抗CFP10抗体及其应用

no:22所示的lcdr3；如seq id no:15 所示的lcdr1、如seq id no:19所示的lcdr2和如seq id no:23所示的 lcdr3；如seq id no:16所示的lcdr1、如seq id no:20所示的lcdr2 和如seq id no:24所示的lcdr3。
11.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体含有：
12.如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:5所示的hcdr2和如seq id no:9所示的hcdr3，如seq id no:13所示的lcdr1、如seq id no:17 所示的lcdr2和如seq id no:21所示的lcdr3；
13.如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:6所示的hcdr2和如seq id no:10所示的hcdr3，如seq id no:14所示的lcdr1、如seq id no:18 所示的lcdr2和如seq id no:22所示的lcdr3；
14.如seq id no:3所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2和如seq id no:11所示的hcdr3，如seq id no:15所示的lcdr1、如seq id no:19 所示的lcdr2和如seq id no:23所示的lcdr3；或
15.如seq id no:4所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2和如seqid no:12所示的hcdr3，如seq id no:16所示的lcdr1、如seq id no:20 所示的lcdr2和如seq id no:24所示的lcdr。
16.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的vh的fr1选自seq idno:25-28中任一序列所示vh的fr1，vh的fr2选自seq id no:25-28中任一序列所示vh的fr2，vh的fr3选自seq id no:25-28中任一序列所示 vh的fr3，vh的fr4选自seq id no:25-28中任一序列所示vh的fr4。
17.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的vl的fr1选自seq idno:29-32中任一序列所示vl的fr1，vl的fr2选自seq id no:29-32中任一序列所示vl的fr2，vl的fr3选自seq id no:29-32中任一序列所示vl 的fr3，vl的fr4选自seq id no:29-32中任一序列所示vl的fr4。
18.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的vh的fr1-fr4选自seqid no:25-28中任一序列所示vh的fr1-fr4，和/或所述抗cfp10抗体的vl 的fr1-fr4选自seq id no:29-32中任一序列所示vl的fr1-fr4。
19.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的vh的氨基酸序列如seqid no:25-28中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:29-32中任一所示。优选地，抗cfp10抗体的vh如seq id no:25所示，vl如seq id no: 29所示；vh如seq id no:26所示，vl如seq id no:30所示；vh如seqid no:27所示，vl如seq id no:31所示；vh如seq id no:28所示，vl 如seq id no:32所示。
20.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的轻链恒定区是κ或λ。
21.在一个或多个实施方案中，所述抗cfp10抗体的重链恒定区是iga、igd、 ige、igg和igm的重链恒定区。优选地，重链恒定区为migg2a的恒定区。
22.在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
23.本发明还提供一种核酸分子或含有该核酸分子的核酸构建物，所述核酸分子具有：
24.(1)编码本文任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列；和/或
25.(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列或它们作为引物的片段。
26.在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或克隆载体。
27.本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：
28.(1)表达本文任一实施方案所述的抗cfp10抗体变体或其抗原结合片段；和/或
29.(2)包含本文任一实施方案所述的核酸分子或含有该核酸分子的核酸构建物。
30.本发明还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段，和检测免疫反应所需的试剂。
31.在一个或多个实施方案中，所述免疫反应是抗原抗体反应，例如elisa。
32.本发明还提供本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段在制备诊断结核病的试剂盒中的用途。优选地，所述结核病是由结核分支杆菌(m.tuberculosis)感染引起的疾病。
33.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的赋形剂或载剂。
34.本发明还提供本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段在制备治疗结核病的药物中的应用；优选地，所述结核病是由结核分支杆菌(m.tuberculosis)感染引起的疾病。
35.本发明还提供一种治疗或预防结核病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段，或含有本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段的药物组合物。优选地，所述结核病是由结核分支杆菌(m.tuberculosis)感染引起的疾病。
附图说明
36.图1显示单细胞测序抗体(细胞培养上清)具有cfp10结合能力。
37.图2显示单细胞测序抗体(纯化抗体)具有cfp10结合能力。
具体实施方式
38.除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如molecular cloning：a laboratorymanual，第二版(sambrook等，1989)；oligonucleotide synthesis(m.j.gait 编辑，1984)；animal cell culture(r.i.freshney编辑，1987)；methods inenzymology(academic press，inc.)；current protocols in molecular biology (f.m.ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；pcr：the polymerasechain reaction(mullis等编辑，1994)；a practical guide to molecular cloning (perbal bernard v.，1988)；phage display：a laboratory manual(barbas等， 2001)。
39.cfp10蛋白由毒力结核分枝杆菌基因组的差异区域rd-1(region ofdifference-1)编码。其氨基酸序列的ncbi登录号为np_218391。cfp10蛋白也可包括变体及片段。
lcdr3-fr4，重链可变区的结构为fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4。本发明中，所述抗体的各cdr之间可以任意组合，从而构成抗体cdr组或用于形成抗体可变区。
46.本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位) 的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如，kohler和milstein， nature，256：495-97(1975)；hongo等，hybridoma，14(3)：253-260(1995)， harlow等，antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，第二版.1988；hammerling等，在：monoclonal antibodies and t-cell hybridomas， 563-681，elsevier，n.y.，1981)、重组dna法(例如us 4,816,567)、噬菌体展示技术(例如，clackson等，nature，352：624-628(1991)；marks 等，j.mol.biol.，222：581-597(1992)；sidhu等，j.mol.biol.，338(2)： 299-310(2004)；lee等，j.mol.biol.，340(5)：1073-1093(2004)；fellouse， proc.natl.acad.sci.usa，101(34)：12467-12472(2004)；和lee等j.immunol. methods，284(1-2)：119-132(2004))、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(例如，wo1998/24893；wo1996/34096；wo1996/33735；wo 1991/10741； jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa，90：2551(1993)；jakobovits等， nature，362：255-258(1993)；bruggemann等，year in immunol.，7：33(1993)； us 5,545,807；us 5,545,806；us 5,569,825；us 5,625,126；us 5,633,425；和 us 5,661,016；marks等，bio/technology，10：779-783(1992)；lonberg等， nature，368：856-859(1994)；morrison，nature，368：812-813(1994)； fishwild等，nature biotechnol.，14：845-851(1996)；neuberger，naturebiotechnol.，14：826(1996)；和lonberg和huszar，intern.rev.immunol.， 13：65-93(1995)、单细胞测序法(nat biotechnol.2013feb；31(2):166-9.)。
47.术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换地使用，是指基本上是其完整形式的抗体(与抗体片段相对比)。具体而言，完全抗体包括那些具有重链和轻链包括fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域 (例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况中，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
[0048]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括fab、fab’、 f(ab’)2和fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2； zapata等，protein eng.，8(10)：1057-1062，1995)；单链抗体分子；scfv-fc 片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。fab片段由完整轻链及重链可变结构域(vh)和一条重链第一恒定结构域(ch1)组成。每个fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理
抗体产生一个较大f(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。 fab’片段因在ch1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段有所不同。f(ab’)2抗体片段最初是作为成对fab’片段生成的，在fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的fc受体(fcr)所识别的区。
[0049]“fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个hvr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。
[0050]“单链fv”也可缩写为“sfv”或“scfv”，是包含抗体vh和vl结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sfv多肽在vh和vl结构域之间还包含多肽接头，使得sfv形成期望的抗原结合结构。关于sfv的综述参见the pharmacology of monoclonal antibodies，第113卷，rosenburg和moore 编辑，springer-verlag，new york，pp.269-315(1994)。
[0051]
所述片段的“化学修饰”包括添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，peg化”)，包括fv、scfv、fab、f(ab’)2和fab'的聚乙二醇化片段，即fv-peg、scfv-peg、fab-peg、f(ab’)2-peg和fab'-peg。这类片段具有 egfr结合活性。
[0052]
优选地，所述抗体片段，尤其是抗原结合片段，由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于cfp10，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种抗体片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
[0053]
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/ 或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(us 4,816,567；morrison等，proc.nat.acad.sci.usa，81：6851-6855，1984)。
[0054]
本发明的抗cfp10抗体也可以是微型抗体。微型抗体是包含与ch3结构域连接的scfv的最小化抗体样蛋白(hu等，1996，cancer res.，56：3055-3061)。本发明的抗cfp10抗体还可以是结构域抗体，参见例如us 6,248,516。结构域抗体(dab)是抗体的功能结合结构域，对应于人抗体dab的重链(vh)或轻链(vl)的可变区，具有约13kda的分子量或小于完整抗体的十分之一尺寸。dab在包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统的多种宿主中充分表达。另外，即使在经受严酷条件，诸如冷冻干燥或热变性后，dab仍高度稳定且保持活性。参见例如us 6,291,158；us 6,582,915；us 6,593,081；us 6,172,197；us2004/0110941；ep 0368684；us 6,696,245、wo04/058821、wo04/003019和 wo03/002609。
[0055]
本文中，抗cfp10抗体含有如seq id no:1-4中任一所示的hcdr1。抗 cfp10抗体含有如seq id no:5-8中任一所示的hcdr2。抗cfp10抗体含有如seq id no:9-12中任一所示
的hcdr3。抗cfp10抗体含有如seq idno:13-16中任一所示的lcdr1。抗cfp10抗体含有如seq id no:17-20中任一所示的lcdr2。抗cfp10抗体含有如seq id no:21-24中任一所示的 lcdr3。
[0056]
本文中，所述抗cfp10抗体含有如seq id no:1-4中任一所示的hcdr1、如seq id no:5-8中任一所示的hcdr2和如seq id no:9-12中任一所示的 hcdr3，和/或含有如seq id no:13-16中任一所示的lcdr1、如seq idno:17-20中任一所示的lcdr2和如seq id no:21-24中任一所示的lcdr3。
[0057]
优选地，所述抗cfp10抗体含有：如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:5所示的hcdr2和如seq id no:9所示的hcdr3；如seq idno:2所示的hcdr1、如seq id no:6所示的hcdr2和如seq id no:10所示的hcdr3；如seq id no:3所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2 和如seq id no:11所示的hcdr3；或如seq id no:4所示的hcdr1、如seqid no:8所示的hcdr2和如seq id no:12所示的hcdr3。
[0058]
优选地，所述抗cfp10抗体含有：如seq id no:13所示的lcdr1、如 seq id no:17所示的lcdr2和如seq id no:21所示的lcdr3；如seq idno:14所示的lcdr1、如seq id no:18所示的lcdr2和如seq id no:22 所示的lcdr3；如seq id no:15所示的lcdr1、如seq id no:19所示的 lcdr2和如seq id no:23所示的lcdr3；如seq id no:16所示的lcdr1、如seq id no:20所示的lcdr2和如seq id no:24所示的lcdr3。
[0059]
更优选地，本发明抗cfp10抗体含有表1的组a1到组a4中任一组的hcdr 和lcdr：
[0060]
表1，cdr和可变区的序列号以及抗体编号
[0061][0062]
本发明抗cfp10抗体vh的fr1可选自表1中各抗体编号的vh的fr1， fr2可选自表1中各抗体编号的vh的fr2，fr3可选自表1中各抗体编号的 vh的fr3，fr4可选自表1中各抗体编号的vh的fr4；和/或vl的fr1可选自表1中各抗体编号的vl的fr1，fr2可选自表1中各抗体编号的vl的 fr2，fr3可选自表1中各抗体编号的vl的fr3，fr4可选自表1中各抗体编号的vl的fr4。
[0063]
在一些实施方案中，所述抗cfp10抗体的vh的氨基酸序列如seq id no: 25-28中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:29-32中任一所示。优选地，抗cfp10抗体的vh如seq id no:25所示，vl如seq id no:29 所示；vh如seq id no:26所示，vl如seq id no:30所示；vh如seq idno:27所示，vl如seq id no:31所示；vh如seq id no:28所示，vl如 seq id no:32所示。
[0064]
本文中，各抗体的重链和轻链恒定区可使用本领域中任何重链和轻链恒定区而不影响抗体与抗原的结合能力。例如，本发明抗体的轻链恒定区可以是κ或λ。κ的示例性氨基酸序列如seq id no:34所示。本发明抗体的重链恒定区可以是iga、igd、ige、igg和igm的重链恒定区。migg2a的恒定区的示例性氨基酸序列如seq id no:33所示。
[0065]
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列取代、
manual，cold spring harbor laboratory press，cold springharbor，n.y.，第9章和第11章；和current protocols in molecular biology， 1995，ausubel等编，john wiley&sons,inc.，章节2.10和6.3-6.4)。
[0074]
如本文中所概述，通常使用盒式诱变或pcr诱变或本领域中熟知的其它技术在编码抗cfp10抗体的dna中通过核苷酸的位点特异性诱变以产生编码变体的dna，且此后在细胞培养物中表达重组dna来制备根据本发明的变体。然而，可以通过使用确定的技术体外合成来制备包含具有多达约100-150 个残基的的抗原结合片段。
[0075]
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗cfp10抗体或其抗原结合片段。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。
[0076]
本发明还提供包含至少一个如上述多核苷酸的质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体。另外，本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。
[0077]
任何宿主细胞中所用的表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”) 通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。下文论述每个这些序列。
[0078]
载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于抗cfp10抗体编码序列的 5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸(诸如6his)或另一种“标签”，诸如flag、ha(血球凝集素流感病毒)或myc，它们存在市场上有售的抗体中。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测抗cfp10抗体的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可随后通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的抗cfp10抗体除去。
[0079]
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。
[0080]
复制起点典型地是在市场上购买的那些原核表达载体的一部分，且此起点有助于载体在宿主细胞中扩增。如果选择的载体不含复制起点位点，则可以基于已知的序列来化学合成并连接到载体中。举例来说，来自质粒pbr322(newengland biolabs，beverly，ma)的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，且各种病毒起点(例如，sv40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(vsv)或乳头瘤病毒，诸如hpv或bpv)适用于在哺乳动物细胞中克隆载体。哺乳动物表达载体通常不需要复制起点组分(例如，常常只使用sv40起点，因为它也含有病毒早期启动子)。
[0081]
转录终止序列典型地位于多肽编码区的3'末端，用以终止转录。原核细胞中的转录终止序列通常是富含g-c的片段，接着是多聚胸苷酸序列。
[0082]
可选的标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长而言必要的一种蛋白质。典型的选择标记基因编码(a)赋予对于抗生素或其它毒素(例如，对于原核宿主细胞而言为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性； (b)补足细胞的营养缺陷型；或(c)提供无法从复合物或确定的培养基获得的重要营养素的蛋白质。特异性的可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。
[0083]
核糖体结合位点对于mrna的翻译起始而言通常是必要的而且由 shine-dalgarno序列(原核生物)或kozak序列(真核生物)来表征。此元件典型地位于启动子的3'和将要表达的多肽的编码序列的5'。
[0084]
本发明的表达和克隆载体将典型地含有由宿主生物体识别并与编码抗 cfp10抗体的分子可操作性连接的启动子。启动子是位于控制结构基因转录的结构基因(通常在约100至1000bp以内)的起始密码子上游的非转录序列。
[0085]
本领域也熟知在各种宿主中使用的合适启动子。例如，与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子包括但不限于由诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、b型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(sv40)的病毒基因组获得的启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
[0086]
可将增强子序列插入载体中以通过高等真核生物增加编码组成本发明的抗cfp10抗体的轻链或重链的dna的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的dna的顺式作用元件，长度通常约为10-300bp。增强子具有相对的方向和位置独立性，已在转录单元的5’和3’位置处发现增强子。已知可获自哺乳动物基因的若干种增强子序列，例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的增强子序列。然而，典型地使用来自病毒的增强子。本领域中已知的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。
[0087]
本发明的表达载体可以由起始载体(诸如市售载体)来构建。这类载体可含有或可不含所有所需的侧翼序列。如果本文所述侧翼序列的一个或多个并非已存在于载体中，则其可单独获得并与载体连接。本领域技术人员熟知用于获得各个侧翼序列的方法。
[0088]
在构建载体并将编码包含抗cfp10抗体的轻链、重链或轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点后，可将已完成的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可通过众所周知的方法将抗cfp10抗体的表达载体转化至所选的宿主细胞中，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂转染、deae-葡聚糖介导的转染或其它已知的技术。所选方法部分可随待使用的宿主细胞类型而变化。
[0089]
当培养在适当的条件下培养宿主细胞，使其合成抗cfp10抗体，抗cfp10 抗体随后可从培养基收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果不分泌的话)。适当的宿主细胞如前文所述。
[0090]
抗cfp10抗体用于治疗目的的用途
[0091]
本文所述的抗cfp10抗体的所有方面都可用于制备用以治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病尤其病况与结核杆菌(例如结核分支杆菌(m.tuberculosis))相关的疾病或病况，例如由m.tuberculosis引起的结核病。
[0092]
诊断用途、测定和试剂盒
[0093]
本发明的抗cfp10抗体可用于诊断测定，例如结合测定来检测和/或定量样品中的结核杆菌(例如结核分支杆菌(m.tuberculosis))。抗cfp10抗体可用在进一步研究cfp10在疾病中的作用的研究中。所述样品包括但不限于体液(例如血浆、血液、血清、组织间液、淋巴液、脑脊液)、痰、咽喉部分泌物、胸液、腹水、尿液、胃液、脓液、粪便等。cfp10的含量可以是预后的。因此，本发明的诊断包括预前、预中和预后。
[0094]
本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫学方法检测样本中 cfp10的存在。可以体内或体外进行cfp10的检测。适用于检测cfp10的存在的方法实例包括elisa、facs、ria等。这些方法所需的试剂本领域周知，例如pbs、tween、bsa、封闭剂、稀释剂、检测抗体、显色剂(例如hrp底物tmb)。
[0095]
对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记抗cfp10抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3h、14c、 15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)、荧光基团(例如，fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团通过各种长度的间隔子臂与抗cfp10抗体偶合以减小潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
[0096]
在一个具体实施方案中，用标记基团标记抗体并检测经过标记的抗体与 cfp10的结合。在另一个具体实施方案中，体内检测抗体与cfp10的结合。在另一个具体实施方案中，使用本领域中已知的技术来分离和测量抗体-cfp10。
[0097]
在一个具体实施方案中，用包括dna的核酸片段标记抗体并检测经过标记的抗体与cfp10的结合，包括使用pcr方法扩增后检测dna。在另一个具体实施方案中，使用固定了抗体或者标记的抗体的磁珠与cfp10结合，从而富集抗原和抗体，并进一步检测抗体或者抗体的标记。
[0098]
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合cfp10的测试分子的存在。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量cfp10的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合cfp10的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合cfp10。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
[0099]
药物组合物、施用途径
[0100]
本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗 cfp10抗体以及药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/ 或佐剂。
[0101]
在某些实施方案中，药物组合物中可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂等优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的ph、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的这类物质。这些物质为现有技术已知，例如可参见 remington's pharmaceutical sciences，第18版，a.r.genrmo编， 1990，mack publishing company。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组
合物。
[0102]
可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。
[0103]
其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗cfp10抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
[0104]
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
[0105]
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器 (例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
[0106]
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的抗cfp10抗体或其抗原结合片段或其药物组合物来治疗患者(尤其是患者的t细胞相关疾病，如t 细胞相关癌症以及自体免疫疾病)的方法。
[0107]
本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
[0108]
将采用的含有本发明抗cfp10抗体或其抗原结合片段的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。
[0109]
给药频率将取决于所用配制物中特定抗cfp10抗体的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
[0110]
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。
[0111]
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
[0112]
实施例
[0113]
实施例1：免疫小鼠使其产生抗结核杆菌抗原cfp10的单克隆抗体
[0114]
使用粗提的结核分枝杆菌来源cfp10抗原免疫小鼠。每个抗原免疫组为5 只雌性8周龄的balb/c小鼠。单只小鼠单次免疫，使用50微克对应抗原，加入250微克胶体锰佐剂，混合均匀并室温静置3-5分钟，再加入无菌生理盐水补齐体积至600微升，震荡均匀后即可用于小鼠多点皮下免疫，其中肌肉注射 200微升(左右大腿肌肉各100微升)，皮下注射200微升(左右腹侧皮下各 100微升)，腹腔注射200微升。首次免疫后，每隔7天采用同样的策略增强免疫一次，共计增强免疫四次。
[0115]
实施例2：对免疫后的小鼠血清进行酶联免疫反应检测
[0116]
采集小鼠血清样本，检测抗原免疫组小鼠血清中抗cfp10 igg抗体的滴度。 elisa检测策略如下：采用纯化的结核分枝杆菌来源cfp10抗原(1mg/ml,pbs 溶解和稀释)包被孔板过夜，pbst洗三次，加入pbst配制的1％bsa，室温封闭1小时，弃去封闭液，加入倍比稀释的血清样本，室温孵育2小时，弃去血清样本，pbst洗5次，加入稀释的hrp偶联的山羊抗小鼠igg fc检测抗体，室温孵育1小时，pbst洗5次，加入tmb底物，室温孵育15-30分钟，检测od650纳米的吸光值，并通过graphpad prism 5软件分析实验数据。
[0117]
基于抗体滴度的检测数据，选择两只血清抗cfp10 igg抗体滴度较高的小鼠，通过流式细胞分选术分选小鼠脾脏中的浆母b细胞，用于后续实验。具体实验操作如下：麻醉小鼠并分别收集小鼠血清样本，处死小鼠并分别收集小鼠脾脏并放置在预冷的pbs(含1％fbs)中，制备脾脏单细胞悬液并裂红。将脾脏细胞重悬在1毫升预冷的pbs(含1％fbs)中，加入流式抗体，4度冰箱避光染色20分钟，预冷的pbs(含1％fbs)洗两遍，将细胞重悬在5毫升预冷的pbs(含1％fbs)中，轻轻吹打均匀，上机分选前加入2微升dapi 工作液(死细胞染料)。
[0118]
实施例3：单细胞测序产生单克隆抗体
[0119]
将分选出的b谱系细胞进行单细胞测序(上海市免疫学研究所，10x genomics)。根据免疫后的抗原特异性b细胞克隆扩张的特点从众多序列中挑出目的序列(轻链可变区和重链可变区序列)，并将其构建成带有恒定区(轻链为cκ，重链恒定区为migg2a的恒定区)的完整抗体结构。将抗体序列插入至表达载体，以共转的形式转入悬浮293细胞中，收集上清，进行初步测浓度以及检测结合后，用g蛋白珠将选出来的抗体进行亲和纯化。所得上清或抗体至于4℃或-20冰箱保存、待用。
[0120]
实施例4：elisa测定单细胞测序抗体(细胞培养上清)结合抗原的能力
[0121]
1)在96孔高吸附性酶标检测板(nunc)中包被100μl cfp10，浓度为2μg/ml，至于4℃冰箱孵育过夜；
[0122]
2)弃去板中液体，用pbst(含0.05％tween-20的pbs)洗板3次，加入200μl1％bsa(pbs配制)，室温封闭1小时；
[0123]
3)将细胞培养上清适当稀释，细胞培养基为阴性对照，各取100μ；至上述封闭后的孔中(pbst洗板3遍，弃去液体)，室温孵育1小时；
[0124]
4)pbst洗板3遍，拍干液体，每孔加入100μl检测抗体(羊抗鼠fc γ片段特异性igg，hrp)，1：5000，室温孵育1小时；
[0125]
5)pbst洗板5遍，拍干液体，每孔加入100μl hrp底物tmb(a 液与b液等体积混合，
kpl)，显色10-30分钟后用酶标仪读取od650mn处信号值。
[0126]
如图1所示，单细胞测序抗体具有抗原cfp10结合能力。
[0127]
实施例5：elisa测定单细胞测序抗体(纯化抗体)结合抗原的能力
[0128]
1)在96孔高吸附性酶标检测板(nunc)中包被100μl cfp10，浓度为2μg/ml，至于4℃冰箱孵育过夜；
[0129]
2)弃去板中液体，用pbst(含0.05％tween-20的pbs)洗板3次，加入200μl1％bsa(pbs配制)，室温封闭1小时；
[0130]
3)将纯化后的抗体适当稀释，抗cgg抗体作为阴性对照，各取100 μ；至上述封闭后的孔中(pbst洗板3遍，弃去液体)，室温孵育1小时；
[0131]
4)pbst洗板3遍，拍干液体，每孔加入100μl检测抗体(羊抗鼠fc γ片段特异性igg，hrp)，1：5000，室温孵育1小时；
[0132]
5)pbst洗板5遍，拍干液体，每孔加入100μl hrp底物tmb(a 液与b液等体积混合，kpl)，显色10-30分钟后用酶标仪读取od650mn处信号值。
[0133]
如图2所示，单细胞测序抗体具有抗原cfp10结合能力。