一种具有ROS、GSH双响应的农药缓释制剂及其制备方法和应用

一种具有ros、gsh双响应的农药缓释制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于农药技术领域，具体涉及一种具有ros、gsh双响应的农药缓释制剂及其制备和应用。


背景技术：

2.农药在防治农作物病虫草害中具有高效、快捷、经济、操作简单、劳动强度小等优点，在有害生物综合防治中处于重要地位。中国的化学农药生产量、使用量巨大，其中主要是乳油、可湿性粉剂和水乳剂等常规农药剂型。然而常规的农药剂型存在有机溶剂使用量大、粉尘飘移、分散性差等问题，并且不具备对活性成分的控制释放能力，导致超过90％的农药活性成分流失在靶标附近的环境中。农药长期大量与低效施用，使我国的蔬菜、水果、粮食以及土壤、水体中的农药残留超标，不仅对非靶标生物及人体健康构成了严重威胁，也导致了生态系统的结构和功能的破坏。
3.近年来，由于农药缓控释制剂具有靶标释放、可控释放和持效期长等优点而成为了农药剂型研究的热点。控制释放技术是指特定系统中的活性成分对特定的靶标可按照设计的浓度和时间持续释放出来,并达到预期效果。
4.国内外对农药控释剂的研究主要集中在缓慢释放、延长持效期方面，目前关于利用有害生物与植物的相互作用产生的酶、ph值和氧化还原等刺激为控释因子制备环境响应性农药控释剂的研究和报道还非常少。
5.当植物遭受病原菌侵染危害时会引起活性氧(ros)和谷胱甘肽(gsh)的增加，正常生长条件下，植物体内抗氧化系统能保持其体内ros、gsh的产生和清除处于动态平衡之中；而植物在生物和非生物胁迫下，体内的抗氧化机制遭到破坏，ros、gsh产生和清除的平衡被打破，致使ros、gsh过量积累，产生氧化迸发现象，这一现象也被公认为植物的抗病反应之一。很多病原体与植物的相互作用过程中都有植物体内ros、gsh的参与。


技术实现要素：

6.基于以上背景技术，本发明的首要目的在于提供一种具有ros、gsh双响应性的农药缓释制剂，具有高载药量和较好的ros、gsh双响应缓释效果，当植物受到病虫害等胁迫产生ros、gsh中的一种或两种时在相应的位置及时释放药物，药效明显优于市售的药物。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.本发明提供了一种具有ros、gsh双响应性的农药缓释制剂，所述农药缓释制剂包括具有ros、gsh双响应性的载体和负载的农药，所述具有ros、gsh双响应的载体的结构式如下所示：
9.r
1-r
0-r-r2或r
1-r-r
0-r210.r为ros响应基团，r0为gsh响应基团，r1为亲水性链段，r2为疏水性链段；
11.ros响应基团包括硫醚、缩硫酮、硒化物、二硒化物、芳香硼酸酯、草酸酯、二茂铁；
gsh响应的基团包括胱胺、3-巯基丙酸、3,3'-二硫代二丙酸、2,2'-二硫二乙醇、2-氨乙基二硫代丙酸、巯基乙酸、4-氨基苯硫酚、半胱氨酸；亲水性链段包括壳寡糖、半乳糖醛酸、海藻寡糖、果寡糖、甘露寡糖、葡寡糖、大豆寡糖、巴戟天寡糖、几丁质寡糖、寡聚半乳糖醛酸及各类寡糖，疏水性链段包括聚乙二醇琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酯、聚己内酯、2-巯基咪唑啉、胆固醇。
12.基于以上技术方案，优选的，所述农药为草甘膦、井冈霉素、霜霉威、霜霉威盐酸盐、乙烯利、敌百虫、杀虫脒、杀虫双、二甲四氯、乙拌磷。
13.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂为粒径范围为10-500nm的球形聚合物胶束。
14.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂的农药负载量占载体材料的重量百分比为10-80％，包封率在15-75％之间。
15.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂能够诱导植物产生抗性。
16.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂在水溶液条件下释放，一天内释放20-30％，21天内释放55-60％；在不同浓度的ros、gsh溶液中，一天内释放30-40％，21天内释放90-95％。
17.本发明另一方面提供一种上述农药缓释制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
18.s1：制备具有ros、gsh双响应的聚合物材料：将亲水性链段通过共价键依次连接上ros响应基团、gsh响应基团和疏水性链段，或者，将亲水性链段通过共价键依次连接上gsh响应基团、ros响应基团和疏水性链段，得到具有ros、gsh双响应的聚合物材料；
19.s2：制备负载农药聚合物胶束：将s1制得的具有ros、gsh双响应的聚合物材料与农药溶解于溶剂中得到油相，将所述油相滴入水相中，搅拌，透析除去未负载的农药，透析完成后干燥得到农药缓释制剂。
20.基于以上技术方案，优选的，具有ros、gsh双响应的聚合物材料与农药的质量比为2:1-5:1。
21.基于以上技术方案，优选的，油相与水相的体积比例1:10-1:1，搅拌时间为2-24h，透析时间为12-48h。
22.基于以上技术方案，优选的，所述溶剂包括甲醇、乙腈、二氯甲烷、dmso。
23.基于以上技术方案，优选的，所述水相包括水、pbs溶液、pva溶液或氯化钠溶液；所述pbs溶液、pva溶液或氯化钠溶液的浓度为0.01-10m。
24.本发明另一方面提供一种包括上述农药缓释制剂的农药组合物。
25.本发明再一方面提供一种上述农药缓释制剂的应用，所述农药制剂用于农作物病虫害的防治。
26.基于以上技术方案，优选的，使用剂量为常规用药剂量的1/10-1/50。
27.有益效果
28.(1)本发明利用植物病理现象，创造性地将具有杀菌作用的井冈霉素、草甘膦等农药负载于具有ros、gsh双响应性材料中，可以减少农药在环境中的扩散、消解和流失，同时延长农药持效期，减少施药次数，减少用药量和保护环境。
29.(2)本发明的农药缓释剂，可根据病原菌侵染植物自然过程中ros、gsh含量的变化
自发释放农药，ros、gsh单一存在或共同存在时都可以响应释放农药，准确把握药物的释放时机，增加药物的靶向性，释放时间长，药效可以保持500h以上，减少了农药补喷的次数，减少农药使用量，使用剂量为常规用药剂量的1/10-1/50。
30.(3)本发明的农药缓释剂，载体材料的亲水端为寡糖。具有生物相容性、可生物降解、对人类和环境友好等优点。更为重要的是特定结构的寡糖可以诱导植物产生抗性，也可以作为植物生长调节剂，促进细胞活化，刺激生长。在农药缓释剂响应过程中，上述载体材料中的寡糖可被释放出来，进而发挥激活植物的免疫的作用。
31.(4)本发明的农药缓释剂，制备工艺简单可行，与常规市售农药相比，减少了有机溶剂的使用，无稳定剂等添加剂，负载的材料本身具有生物相容性和生物可降解性，不会对环境造成任何的压力，杀菌的效果比市售的药剂抑菌效果好3-50倍。
附图说明
32.图1是实施例1中mpeg-ss 1
h-nmr谱图。
33.图2是实施例1中mpeg-ss-tk 1
h-nmr谱图。
34.图3是实施例1中mpeg-ss-tk-cos 1
h-nmr谱图。
35.图4是实施例1vail@mpeg-ss-tk-cos透射电镜图。
36.图5是实施例3中具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos体外释放图。
37.图6是实施例4中具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos平板抑菌效果，a图为平板抑菌图片，b为立枯丝核菌菌落直径统计。
38.图7是实施例5中具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos离体叶片抑菌效果图，a为h2o处理组，b为vail处理组，c为mpeg-ss-tk-cos处理组，d为vail@mpeg-ss-tk-cos处理组，e为病斑比例统计。
39.图8是实施例6中具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-ss-tk-cos药效的病情指数统计。
40.图9是实施例6中水稻激素检测结果。
具体实施方式
41.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的原料若无特殊说明，均为市购。
42.实施例1
43.s1：制备具有ros响应的两亲性聚合物材料：(1)合成酮缩硫醇(tk)：5.2g(49.1mmol)3-巯基丙酸和5.8g(98.2mmol)无水丙酮，溶于干燥的氯化氢中，室温搅拌6h。将搅拌完成后的聚合物放在冰上，直到结晶完成，用己烷和冷水在真空中干燥得到了白色产物，干燥得到恒重的产物，备用。
44.(2)合成mpeg-cooh：4.6g mpeg-oh、0.24g琥珀酸酐、溶于30ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入200μl吡啶，溶液变成澄清的溶液，600rpm条件下室温下搅拌72h，乙醚洗涤三次，干燥得白色粉末，备用。
45.(3)合成mpeg-ss：3.8g mpeg-cooh、0.39g碳化二亚胺，0.52g n,n-二异丙基乙胺，溶于30ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入0.32g2,2'-二硫二乙醇(ss)，
600rpm条件下室温下避光搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得粉末，备用。1h-nmr谱图如图1所示，3.2-3.37ppm为2,2'-二硫二乙醇的特征吸收峰，证明mpeg-2,2'-二硫二乙醇的成功制备。
46.(4)合成mpeg-ss-tk：1.01g tk、1.54g碳化二亚胺、0.92g n-羟基琥珀酰亚胺、1.03g n,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入4.0g(2.1mmol)mpeg-ss，固体溶解后变成澄清的溶液，600rpm条件下室温下搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得白色粉末，备用。1h-nmr谱图如图2所示，1.60,2.60
–
2.68,2.86
–
2.90ppm为酮缩硫醇的特征吸收峰，证明mpeg-2,2'-二硫二乙醇-酮缩硫醇的成功制备。
47.(5)合成mpeg-ss-tk-cos：
48.2.23g mpeg-ss-tk，0.29g碳化二亚胺，0.78g n,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入2.5g壳寡糖(cos)，固体溶解后由澄清的溶液变为淡黄色溶液，600rpm条件下室温下避光搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得粉末，备用。从图3中可以看出，4.51-4.61ppm为cos的特征吸收峰，证明mpeg-ss-tk-cos的成功制备。
49.s2：制备负载井冈霉素(vail)聚合物胶束vail@mpeg-ss-tk-cos：1g mpeg-ss-tk-cos与0.5g vail同时溶于5ml dmso中超声震荡30min，使其完全溶解混合均匀作为油相，使用注射器泵匀速的逐滴滴加进50ml水中，滴加完成后室温下600rpm搅拌过夜，形成聚合物胶束，置入截留分子量为500-1000的透析袋中，用纯水透析，透析48h，每2h换一次水，直到在210nm处没有吸收值为止，干燥备用。透射电镜检测，载药胶束形貌图如图4所示，从图中可以看出，载药聚合物胶束的成功制备，载药聚合物胶束为单分散的、大小均匀的球状，粒径为1-500nm。
50.实施例2
51.s1：(1)合成胆固醇甲酰氯-2-氨乙基二硫代丙酸：在氮气氛下的冰水浴中，将2-氨乙基二硫代丙酸2.5g、三乙胺1.6ml溶解在50ml二氯甲烷中。在冰水浴条件下，将溶解4.8g胆固醇甲酰氯的20ml二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，3h滴加完后除去冰浴，并继续反应3h。反应结束后，旋转出溶剂，粗产物经过层析柱分离两次进一步纯化，最终得到白色固体产物备用。
52.(2)合成胆固醇甲酰氯-2-氨乙基二硫代丙酸-酮缩硫醇：1.01g酮缩硫醇、1.54g碳化二亚胺、0.92gn-羟基琥珀酰亚胺、1.03g n,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入1.16g胆固醇甲酰氯-2,2'-二硫二乙醇，固体溶解后变成澄清的溶液，600rpm条件下室温下搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得白色粉末，备用。
53.(3)合成胆固醇甲酰氯-2-氨乙基二硫代丙酸-酮缩硫醇-葡寡糖：
54.0.82g胆固醇甲酰氯-2-氨乙基二硫代丙酸-酮缩硫醇，0.29g碳化二亚胺，0.78g n,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入2.5g葡寡糖，600rpm条件下室温下避光搅拌48h，洗涤纯化，备用。
55.s2：制备负载vail的聚合物胶束：1g胆固醇甲酰氯-2-氨乙基二硫代丙酸-酮缩硫醇-葡寡糖与0.2g草甘膦同时溶于10ml dmso中超声震荡30mins，使其完全溶解混合均匀作为油相，使用注射器泵匀速的逐滴滴加进10ml水中，滴加完成后室温下600rpm搅拌过夜，形成聚合物胶束，置入截留分子量为500-1000的透析袋中，用纯水透析，透析48h，每2h换一次水，直到在210nm处没有吸收值为止，干燥备用。
56.实施例3
57.具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos体外释放响应：称取一定量的干燥后的实施例1制备的vail@mpeg-ss-tk-cos置于透析袋中(截留分子量为500-1000)，分别置于缓冲液为水、80μm的过氧化氢溶液和不同浓度的谷胱甘肽溶液中，分别间隔1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h直到21天(504h)。取样留待检测并补充相同的缓冲液。用高效液相色谱在210nm处检测样品，并绘制释放曲线图，如图5所示，从图中可以看出，负载农药的聚合物胶束在h2o2、gsh存在的条件下均可响应释放且释放的速度比没有h2o2、gsh存在时速度要快，在21天时基本释放完全，而没有h2o2、gsh存在时农药只释放了50％左右。实验结果表明，当植物受到外界胁迫时不同部位产生不同量的ros和gsh时，农药缓释制剂均可快速响应释放农药，从而准确把握药物的释放时机，增加药物的靶向性。
58.实施例4
59.具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos的平板抑菌效果：在该实验中，通过生长速率法测定农药缓释制剂对抗立枯丝核菌的杀菌效力。在制备实验的基础上，分别使用有效浓度为1.56-25mg.l-1
vail及实施例1中制备的vail@mpeg-ss-tk-cos，使得农药缓释制剂设定在10-90％抑制率范围内，在复活再鉴定后，将立枯丝核菌(直径4mm)的真菌饼接种含有pda培养基的培养皿上，并在27-29℃的恒温培养箱中培养。通过比较菌落直径确定农药缓释制剂对真菌的相对抑制百分比，如图6所示，与对照组及未包载的裸药相比，1.56mg.l-1
、6.75mg.l-1
、25mg.l-1
的vail@mpeg-ss-tk-cos抑菌效果更为明显，并随浓度增大抑菌效果增大，vail的抑菌率分别为0％、11.63％、20.16％，vail@mpeg-ss-tk-cos分别为3.88％、14.73％、25.20％，我们制备的载药胶束，有ros和gsh存在时效果明显优于市售的药物。
60.实施例5
61.具有ros、gsh双响应的vail@mpeg-ss-tk-cos离体叶片抑菌效果：在该实验中，通过生长速率法测定农药缓释制剂对抗立枯丝核菌的杀菌效力。在制备实验的基础上，离体叶片接种立枯丝核菌的方法如下:将生长时间和宽度相同的水稻长度剪为4-5厘米，将其放在含有苯并咪唑(0.1g.l-1
)水琼脂培养基的培养皿上。叶片的前表面(无叶脉的一面)与培养基紧密接触。在离体叶片上喷洒vali、vail@mpeg-tk-cos、mpeg-tk-cos和ddh2o(其中vali的有效浓度为25mg.l-1
)。用无菌打孔器在距离菌核距离相同的位置上取出带有直径为5毫米的立枯丝核菌菌丝的pda琼脂块。将上述带有菌丝的琼脂块放在离体水稻叶片叶脉中心位置。培养皿在28℃恒温培养箱中培养。通过计算病害叶斑面积占整个叶片面积的比例，计算出脱落叶片的病害。该公式如下。
62.s1/s2＝p1/p2
63.s1：水稻离体叶片病斑的面积；s2：水稻离体叶片的面积；p1：病斑处的像素；p2：水稻的像素
64.如图7所示，与对照组及市售vail相比，vail@mpeg-ss-tk-cos抑菌效果更为明显，水、vail、空胶束和vail@mpeg-ss-tk-cos处理组的病斑面积比例分别为50.56％、20.07％、46.09％和10.8％，我们制备的载药胶束与vail的效果相比具有极显著性差异，效果更好。
65.实施例6
66.将发芽后的水稻(oryza sativa spp.japonica cv.nipponbare)幼苗播种到
yoshida溶液中。水稻植株的栽培条件是80-100％的相对湿度，28℃持续14h的光照和10h的24℃黑暗。使用"牙签插入法"将培养了30天的水稻接种立枯丝核菌。具体方法如下：将市售的牙签切成约8毫米的小段，然后将每段均匀地分成4部分。将处理好的牙签整齐地放置在培养皿的底部。然后在牙签上加入马铃薯葡萄糖培养基。用无菌打孔器从距离菌核相同的位置处取出直径为5毫米的pda琼脂块，并将其放在相同距离的五个点上。将培养皿放在28℃的培养箱中，直到真菌被牙签填满。分别在水稻上喷洒vail和实施例1中制备的vail@mpeg-ss-tk-cos(vail的有效浓度为25mg.l-1
)。用无菌镊子取装有真菌的牙签段，然后插入水稻倒数第二片叶子的鞘内。每个处理有30株水稻，每个处理组进行三次重复。病害指数的统计方法如下：
[0067][0068]
并提取水稻病斑处的激素检测。
[0069]
如图8所示，与对照组及vail相比，vail@mpeg-ss-tk-cos抑菌效果更为明显，激素检测结果如图9所示，可以看出，实施例1中制备的vail@mpeg-ss-tk-cos处理后水杨酸(sa)含量明显增加，证明其诱导水稻植株产生抗性，以上的实验证明，本发明所提供的负载农药的缓释制剂具有诱导植物抗性和ros、gsh双响应的特点，其药效明显优于单独农药。