一种具有诱导抗性和ROS响应的农药缓释制剂及其制备方法和应用

一种具有诱导抗性和ros响应的农药缓释制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于农药技术领域，具体涉及一种具有抗性和ros响应的农药缓释制剂的制备及生物效应。


背景技术：

2.农药在防治农作物病虫草害中具有高效、快捷、经济、操作简单、劳动强度小等优点，在有害生物综合防治中处于重要地位。中国的化学农药生产量、使用量巨大，其中主要是乳油、可湿性粉剂和水乳剂等常规农药剂型。然而常规的农药剂型存在有机溶剂使用量大、粉尘飘移、分散性差等问题，并且不具备对活性成分的控制释放能力，导致超过90％的农药活性成分流失在靶标附近的环境中。农药长期大量与低效施用，使我国的蔬菜、水果、粮食以及土壤、水体中的农药残留超标，不仅对非靶标生物及人体健康构成了严重威胁，也导致了生态系统的结构和功能的破坏。
3.近年来，由于农药缓控释制剂具有靶标释放、可控释放和持效期长等优点而成为了农药剂型研究的热点。控制释放技术是指特定系统中的活性成分对特定的靶标可按照设计的浓度和时间持续释放出来,并达到预期效果。
4.目前，尽管环境响应系统在医学上得到了很好的发展，但其在农业上的应用仍然有限。尽管已经实现了简单的缓释，但基于环境变化的响应性释放材料还没有被开发出来。农药领域也需要继续系统地研究、开发和改进对环境有反应的、有针对性的、控制释放的农药。特别是，对内部生物刺激有反应的有效系统在这个领域是一个巨大的挑战。
5.ros是指一类化学性质活泼，氧化能力很强的含氧物质的总称，包括o
2-、oh、o2、h2o2及脂类过氧化产物(脂氧自由基lo、脂过氧化物loo等)。正常生长条件下，植物体内抗氧化系统能保持其体内ros的产生和清除处于动态平衡之中；而植物在生物和非生物胁迫下，体内的抗氧化机制遭到破坏，ros产生和清除的平衡被打破，致使ros过量积累，产生氧化迸发现象，这一现象也被公认为植物的抗病反应之一。很多病原体与植物的相互作用过程中都有植物体内活性氧的参与。病原体引起的植物防卫反应常常伴随着活性氧的爆发。


技术实现要素：

6.基于以上背景技术，本发明的首要目的在于制备一种具有诱导抗性和ros响应的农药缓释制剂及其制备方法和应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.本发明一方面提供一种具有诱导抗性和ros响应的农药缓释制剂，所述农药缓释制剂包括具有诱导抗性和ros响应的载体以及负载的农药，所述具有诱导抗性和ros响应的载体的结构式如下所示：
9.r
1-r-r210.r为ros响应基团，r1为具有诱导抗性的链段，r2为载体基体链段；
11.ros响应基团包括硫醚、缩硫酮、硒化物、二硒化物、芳香硼酸酯、草酸酯、二茂铁；具有诱导抗性的链段包括壳寡糖、壳聚糖、海藻多糖、海藻聚糖、几丁寡糖、几丁质、果胶寡糖、胞外多糖、果胶、半乳糖醛酸、葡寡糖、葡聚糖，载体基体链段包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚己内酯、2-巯基咪唑啉、胆固醇。
12.基于以上技术方案，优选的，所述农药为草甘膦、井冈霉素、霜霉威、霜霉威盐酸盐、乙烯利、敌百虫、杀虫脒、杀虫双、二甲四氯、乙拌磷。
13.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂的农药负载量占载体材料的重量百分比为10-90％，所述农药缓释制剂粒径在10-800nm之间。
14.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂能够诱导植物产生抗性。
15.基于以上技术方案，优选的，所述农药缓释制剂在水溶液条件下释放，24h内释放5-10％，480h内释放40-50％；在ros溶液中，24h内释放10-20％，480h内释放95-99％。
16.基于以上技术方案，优选的，ros溶液为含有o
2-、ho
2-、-oh至少一种，且浓度为4μm-1m的溶液，优选为过氧化氢、过氧化钾、过氧化钙、过氧化钡溶液。
17.本发明另一方面提供一种上述农药缓释制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
18.s1：制备具有诱导抗性和ros响应的载体：将具有诱导抗性的链段通过共价键依次连接上ros响应基团和载体基体链段，得到具有诱导抗性和ros响应的聚合物材料；
19.s2：制备负载农药聚合物胶束：将s1制得的具有诱导抗性和ros响应的聚合物材料与农药溶解于溶剂中得到油相，将所述油相滴入水相中，搅拌，透析除去未负载的农药，透析完成后干燥得到所述农药缓释制剂。
20.基于以上技术方案，优选的，具有诱导抗性和ros响应的聚合物材料与农药的质量比为2:1-5:1。
21.基于以上技术方案，优选的，油相与水相的体积比例1:10-1:1，搅拌时间为2-24h，透析时间为12-48h。
22.基于以上技术方案，优选的，所述溶剂包括甲醇、乙腈、二氯甲烷、dmso。
23.基于以上技术方案，优选的，所述水相包括水、pbs溶液、pva溶液或氯化钠溶液；所述pbs溶液、pva溶液或氯化钠溶液的浓度为0.01-10m。
24.本发明另一方面提供一种包括上述农药缓释制剂的农药组合物。
25.本发明再一方面提供一种上述农药缓释制剂的应用，所述农药制剂用于农作物病虫害的防治。
26.基于以上技术方案，优选的，使用剂量为常规用药剂量的1/10-1/50。
27.有益效果
28.(1)本发明利用植物病理现象，创造性地将具有抑菌作用的井冈霉素、草甘膦等农药负载于具有氧化响应性材料中，可以减少农药在环境中的扩散、消解和流失，同时延长农药持效期，减少施药次数，减少用药量和保护环境。
29.(2)本发明创造性的使得水溶性和油溶性大的农药均可被负载并实现响应性缓慢释放。
30.(3)本发明的农药缓释剂，可根据病原菌侵染植物自然过程中ros含量的变化自发释放农药，准确把握药物的释放时机，增加药物的靶向性，释放时间长，药效可以保持20天
以上，减少了农药补喷的次数，减少农药使用量，使用剂量为常规用药剂量的1/10-1/50。
31.(4)本发明的农药缓释剂，载体材料包含的寡糖，可以诱导植物抗性，作为植物生长调节剂，促进细胞活化，刺激生长。
32.(5)本发明的农药缓释剂，制备工艺简单可行，与常规市售农药相比，减少了有机溶剂的使用，无稳定剂等添加剂，负载的材料本身具有生物相容性和生物可降解性，不会对环境造成任何的压力，抑菌的效果比市售的药剂抑菌效果好10-50倍。
附图说明
33.图1是实施例1中mpeg-tk 1
h-nmr谱图。
34.图2是实施例1中mpeg-tk-cos 1
h-nmr谱图。
35.图3是实施例1制备的vail@mpeg-tk-cos透射电镜图。
36.图4是实施例3中mpeg-tk-cos ros响应裂解后1h-nmr谱图。
37.图5是实施例4中具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos体外释放图。
38.图6是实施例5中具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos平板抑菌效果，a图为平板抑菌图片，b为立枯丝核菌菌落直径统计。
39.图7是实施例6中具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos抑菌效果图，a为h2o处理组，b为vail处理组，c为mpeg-tk-cos处理组，d为vail@mpeg-tk-cos处理组，e为病斑比例统计。
40.图8是实施例7中具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos药效的病情指数统计。
41.图9是实施例7中水稻激素检测结果。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的原料若无特殊说明，均为市购。
43.实施例1
44.s1：具有诱导抗性和ros响应的农药缓释制剂的制备：(1)合成酮缩硫醇(tk)：5.2g3-巯基丙酸和5.8g无水丙酮，溶于干燥的氯化氢中，室温搅拌6h。将搅拌完成后的聚合物放在冰上，直到结晶完成，用己烷和冷水在真空中干燥得到了白色产物，干燥得到恒重的产物，备用。
45.(2)合成mpeg-tk：1.01gtk、1.54g碳化二亚胺、0.92g n-羟基琥珀酰亚胺、1.03gn,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入4.0g mpeg，固体溶解后变成澄清的溶液，600rpm条件下室温下搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得白色粉末，备用。1h-nmr谱图如图1所示，从图中可以看出，1.60,2.60
–
2.68,2.86-2.90ppm为酮缩硫醇的特征吸收峰，证明了mpeg-tk的成功制备。
46.(3)合成mpeg-tk-cos：2.23g mpeg-tk，0.29g碳化二亚胺，0.78g，n,n-二异丙基乙胺，溶于10ml dmso，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入2.4g壳寡糖(cos)，固体溶解后由澄清的溶液变为棕色溶液，600rpm条件下室温下避光搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得粉末，备用，1h-nmr谱图如图2所示，从图中可以看出，4.51-4.61ppm为cos的特征吸收峰，证明了
mpeg-tk-cos的成功制备。
47.s2：制备负载井冈霉素(vail)的缓释制剂vail@mpeg-tk-cos：1g mpeg-tk-cos与0.5g vail同时溶于5ml dmso中超声震荡30min，使其完全溶解混合均匀作为油相，使用注射器泵匀速的逐滴滴加进50ml水中，滴加完成后室温下600rpm搅拌过夜，形成载体材料，置入截留分子量为500-1000的透析袋中，用纯水透析，透析48h，每2h换一次水，直到在210nm处没有吸收值为止，干燥备用，透射电镜检测，vail@mpeg-tk-cos形貌图如图3所示，从图中可以看出，载药缓释制剂的成功制备，载药缓释制剂为单分散的大小均匀的球状。
48.实施例2
49.s1：具有诱导抗性和ros响应的农药缓释制剂的制备：(1)合成胆固醇-草酸酯：1.01g草酸酯、1.54g碳化二亚胺、0.92g n-羟基琥珀酰亚胺、1.03g n,n-二异丙基乙胺，溶于50ml二氯甲烷，600rpm条件下室温下搅拌2h后，加入4.0g胆固醇，固体溶解后变成澄清的溶液，600rpm条件下室温下搅拌48h，乙醚洗涤三次，干燥得白色粉末，备用。
50.(2)合成胆固醇-草酸酯-果胶寡糖：在氮气氛下的冰水浴中，将0.23g胆固醇-草酸酯，0.012g 4-二甲氨基吡啶和0.412g n,n'-二环己基碳二亚胺溶解在50ml二氯甲烷中。然后滴加溶解了0.5g果胶寡糖的dmso溶液。将反应混合物在室温下搅拌48h，然后过滤除去白色沉淀。洗涤，得到的沉淀物为产物。将产物胆固醇-草酸酯-果胶寡糖在25℃下真空干燥6h，备用。
51.s2：制备负载草甘膦的缓释制剂：2.5g胆固醇-草酸酯-果胶寡糖与0.5g草甘膦同时溶于100ml dmso中超声震荡30min，使其完全溶解混合均匀作为油相，使用注射器泵匀速的逐滴滴加进10ml水中，滴加完成后室温下600rpm搅拌过夜，形成载体材料，置入截留分子量为500-1000的透析袋中，用纯水透析，透析48h，每2h换一次水，直到在210nm处没有吸收值为止，干燥备用。
52.实施例3
53.载体材料mpeg-tk-cos ros响应性特性验证：配制h2o2模仿ros刺激。将0.02g载体材料添加到含有5ml 10mm h2o2的离心管中，孵育48h冻干后，使用400m核磁对其结构进行表征，如图4所示1.60处的振动吸收峰消失，说明具有ros响应性的基团发生断裂，证明其具有ros响应性。
54.实施例4
55.负载井冈霉素具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos体外释放实验：称取一定量的干燥后的实施例2制备的vail@mpeg-tk-cos于透析袋中(截留分子量为500-1000)，分别置于缓冲液为水及80μm的过氧化氢溶液中，分别间隔1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h至20天。取样留待检测并补液。用高效液相色谱在210nm处检测样品，并绘制释放曲线图如图5所示，从图中可以看出，vail@mpeg-tk-cos在h2o2的作用下释放较快，无h2o2存在的缓释制剂释放量较低。
56.实施例5
57.具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos抑菌活性：在该实验中，通过生长速率法测定农药缓释制剂对抗立枯丝核菌的杀菌效力。在制备实验的基础上，分别使用有效浓度为1.57-25mg.l-1
井冈霉素及实施例2中制备的vail@mpeg-tk-cos，使得农药缓释制剂设定在10-90％抑制率范围内，在复活再鉴定后，将立枯丝核菌(直径4mm)的真菌饼接种在
含有pda培养基的培养皿上，并在28℃的恒温培养箱中培养。通过比较菌落直径确定农药缓释制剂对真菌的相对抑制百分比，如图6所示，与对照组及市售vail相比，1.56mg.l-1
、6.75mg.l-1
、25mg.l-1
的vail@mpeg-tk-cos抑菌效果更为明显，并随浓度增大抑菌效果增大，未负载药物的载体材料与对照组相比，抑菌效果也有明显的差异，证明载体材料本身具有抑菌活性。具有诱导植物抗性和ros响应的农药缓释制剂由于材料本身的抑菌作用与药物的协同作用，药效明显优于单独农药。以上实验证明，我们制备的载药缓释制剂效果优于市售药物。
58.实施例6
59.具有ros响应并诱导植物抗性的vail@mpeg-tk-cos离体抑菌效果：在该实验中，通过生长速率法测定农药缓释制剂对抗立枯丝核菌的杀菌效力。在制备实验的基础上，离体叶片接种立枯丝核菌的方法如下:将生长时间和宽度相同的水稻长度剪为4-5厘米，将其放在含有苯并咪唑(0.1g.l-1
)水琼脂培养基的培养皿上。叶片的前表面(无叶脉的一面)与培养基紧密接触。在离体叶片上喷洒vali、vail@mpeg-tk-cos、mpeg-tk-cos和ddh2o(其中vali的有效浓度为25mg.l-1
)。用无菌打孔器在距离菌核距离相同的位置上取出带有直径为5毫米的立枯丝核菌菌丝的pda琼脂块。将上述带有菌丝的琼脂块放在离体水稻叶片叶脉中心位置。培养皿在28℃恒温培养箱中培养。通过计算病害叶斑面积占整个叶片面积的比例，计算出脱落叶片的病害。该公式如下。
60.s1/s2＝p1/p2
61.s1：水稻离体叶片病斑的面积；s2：水稻离体叶片的面积；p1：病斑处的像素；p2：水稻的像素
62.如图7所示，与对照组及vail相比，载药缓释制剂抑菌效果更为明显，水、vail、空载体材料和vail@mpeg-tk-cos处理组的病斑面积比例分别为50.56％、20.07％、18.26％和5.6％，与平板抑菌实验的结果相似，具有诱导抗性的载体材料与对照组相比抑菌效果具有显著性差异。同时具有诱导抗性和ros响应的vail@mpeg-tk-cos由于载体材料诱导植物自身产生的抗性与药物的协同作用药效明显优于单独农药。以上实验证明，我们制备的载药缓释制剂与井冈霉素的效果相比具有极显著性差异，效果更好。
63.实施例7
64.将发芽后的水稻(oryza sativa spp.japonica cv.nipponbare)幼苗播种到yoshida溶液中。水稻植株的栽培条件是80-100％的相对湿度，28℃持续14h的光照和10h的24℃黑暗。使用"牙签插入法"将培养了30天的水稻接种立枯丝核菌。具体方法如下将市售的牙签切成约8毫米的小段，然后将每段均匀地分成4部分。将处理好的牙签整齐地放置在培养皿的底部。然后在牙签上加入马铃薯葡萄糖培养基。用无菌打孔器从距离菌核相同的位置处取出直径为5毫米的pda琼脂块，并将其放在相同距离的五个点上。将培养皿放在28℃的培养箱中，直到真菌被牙签填满。分别在水稻上喷洒vail和实施例1中制备的vail@mpeg-tk-cos(vail的有效浓度为25mg.l-1
)。用无菌镊子取装有真菌的牙签段，然后插入水稻倒数第二片叶子的鞘内。每个处理有30株水稻，每个处理组进行三次重复。病害指数的统计方法如下：
[0065][0066]
并提取水稻病斑处的激素检测。
[0067]
如图8所示，与对照组及vail相比，vail@mpeg-tk-cos抑菌效果更为明显，水稻病斑处的激素检测结果如图9所示，可以看出，实施例1中制备的vail@mpeg-tk-cos处理后水稻病斑处的水杨酸(sa)含量明显增加，证明其诱导水稻植株产生抗性，以上的实验证明，我们制备的负载农药的缓释制剂具有诱导植物抗性和ros响应的特点，其药效明显优于单独农药。