黄瓜植物习性
发明领域
1.本公开涉及在黄瓜植物中赋予期望的农艺性状。更具体地，本发明涉及通过操纵控制日长敏感性和植物构型的基因来产生具有改良产量性状的黄瓜植物。
2.发明背景作物生产力最重要的决定因素之一是植物构型。对于许多作物来说，人工选择修饰的枝条构型为提高产量提供了关键步骤，其次是提供了使得能够大规模田间生产的创新。一个突出的实例是番茄，其中编码抗成花素（antiflorigen）的自修剪基因 (sp) 突变的发现，产生了有限生长(determinate)植物，其提供了开花爆发(burst)和同步果实成熟，从而允许机械收获。
3.li 等人 (2018) 的出版物教导将一组六个 grna 组装成一个构建体，以编辑四个基因（ slclv3、slwus、sp和sp5g ）。该构建体被转化到四种醋栗番茄（s. pimpinellifolium）种质资源(accessions)中，所有这些都对细菌性斑点病具有抗性，并且其中两种具有耐盐性。已在 t0 及其 t1 突变植物中的slclv3 和 slwus 的靶向调控区域中鉴定出小插入缺失和大插入。据该出版物中报道，尽管 sp 和 sp5g 对于提高收获指数至关重要，但有限的等位基因变异阻碍了优化这一性状的努力。据进一步报道，在目标 slclv3 启动子区域中具有大插入和倒位的 t0 和 t1 植物中小室数量没有增加。对这一发现的一种解释是，slclv3 启动子的目标区域对于调节 slclv3 转录可能不是必需的。或者，有人提出，slwus下游carg 转录抑制元件侧翼区域的破坏可能降低了其转录并由于小肽编码基因 clv3 (clavata3) clv3和同源框编码基因wus (wuschel)的负反馈环，抵消了 slclv3 突变在控制干细胞增殖中的作用。
4.zs
ögö
n 等人（2018）的出版物公开了设计的 crispr-cas9 基因组改造策略，以将农艺学上期望的性状与醋栗番茄（solanum pimpinellifolium）野生系中呈现的有用性状结合起来。四个编辑的基因是self-pruning (sp)、ovate (o)、fruit weight 2.2 (fw2.2)和lycopene beta cyclase (cycb)。
5.lemmon 等人（2018）描述了使用 crispr
–
cas9 来突变番茄驯化和改良基因的直系同源物，所述基因控制孤儿茄科（solanaceae）作物“地樱桃（groundcherry）”（印加酸浆（physalis pruinosa））中的植物构型、花产生和果实大小。
6.鉴于上述内容，仍然存在长期认识到但尚未满足的需要来以快速有效的方式操纵黄瓜植物构型和花产生以提高产量和降低生产成本。
7.发明概述因此，本发明的一个目的是公开表现出至少一种改良的驯化性状的修饰黄瓜植物，其中所述修饰植物包含至少一种遗传修饰，该遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
8.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具
有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
9.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
10.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
11.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
12.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰的黄瓜植物包含使用靶向基因组修饰在所述至少一种cusp基因中引入的至少一种遗传修饰。
13.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是使用crispr（成簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
14.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
15.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中遗传修饰的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因。
16.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
17.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
18.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物对于所述至少一种遗传修饰的cusp基因是纯合的。
19.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区中的突变、或是表观遗传因子。
20.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
21.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰在植物中产生。
22.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗
传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
23.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-1中的所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
24.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
25.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170-seq id no:255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
26.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述grna序列包含3' ngg前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif）（pam）。
27.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg) 介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
28.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
29.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
30.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物是半有限生长的(semi-determinant)。
31.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物具有有限生长习性。
32.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
33.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出改进的早熟。
34.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出抑制的合轴苗终止(sympodial shoot termination)。
35.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出相似的合轴苗终止。
36.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述驯
化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
37.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
38.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子包含至少一种遗传修饰，其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的降低表达。
39.本发明的另一个目的是公开从如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
40.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
41.本发明的另一个目的是公开用于产生表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物的方法，其中所述方法包括遗传修饰至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的步骤。
42.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其包括使用靶向基因组修饰通过在所述至少一个黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因中遗传引入功能丧失突变来产生修饰黄瓜植物的步骤。
43.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
44.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
45.本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中所述方法包括以下步骤： (a)鉴定至少一种黄瓜sp (cusp)基因或等位基因；(b)合成至少一种指导rna(grna)，其包含与所述至少一种鉴定的cusp等位基因互补的核苷酸序列； (c)用构建体转化黄瓜植物细胞，该构建体包含(a)可操作地连接至所述至少一种grna的cas核苷酸序列，或(b)包含cas蛋白和所述至少一种grna的核糖核蛋白(rnp)复合物；(d) 筛选所述转化植物细胞的基因组中至少一种所述cusp等位基因或基因中诱导的靶向功能丧失突变；(e)再生黄瓜植物，其在至少一种所述cusp等位基因或基因中携带所述功能丧失突变；和 (f) 针对具有改良的驯化性状的黄瓜植物筛选所述再生植物。
46.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述筛选所述转化植物细胞的基因组中诱导的靶向功能丧失突变的所述步骤进一步包括以下步骤：获得所述转化的植物的核酸样品，并进行核酸扩增和任选地限制性内切酶消化以检测所述cusp等位基因或基因中的所述至少一种中的突变。
47.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp黄瓜基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
48.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
49.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
50.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用靶向基因编辑引入的。
51.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
52.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
53.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中突变的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因或基因。
54.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
55.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
56.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物对于所述至少一种cusp突变基因是纯合的。
57.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
58.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
59.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在植物中产生。
60.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
61.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-1中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的 grna 序列及
其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
62.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
63.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170
‑ꢀ
255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
64.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序 （pam）。
65.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
66.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
67.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
68.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物是半有限生长的。
69.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有有限生长习性。
70.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
71.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出改进的早熟。
72.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出抑制的合轴苗终止。
73.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出相似的合轴苗终止。
74.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应的黄瓜植物相比，所述修饰的植物展示出抑制的或降低的日长敏感性。
75.本发明的另一个目的是公开通过如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
76.本发明的另一个目的是公开通过如上述任一项所定义的方法产生的植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子。
77.本发明的另一个目的是公开从如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
78.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
79.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述至少一种驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
80.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:1、seq id no:89和seq id no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
81.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
82.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
83.本发明的另一个目的是公开与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的靶向cusp的grna核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
84.本发明的另一个目的是公开如seq id no:4-88的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-1(cusp-1) 等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
85.本发明的另一个目的是公开如seq id no:92-166的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-2(cusp-2)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
86.本发明的另一个目的是公开如seq id no:170-255的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-3(cusp-3)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
87.附图简述将参考实施方案的以下描述并结合附图来描述所公开主题的示例性非限制性实施方案。附图通常不按比例显示，并且任何尺寸仅意味着示例性而非必然限制性的。相应的或类似的元素可选地由相同的数字或字母表示。
88.图 1示意性地展示了 xie 和 yang (2013) 所描述的 crispr/cas9 作用模式；和图 2用照相显示了再生的转化黄瓜组织。
89.优选实施方案的详细描述在优选实施方案的以下详细描述中，参考了构成其一部分的附图，并且在附图中通过说明显示了其中可以实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并且可以进行结构改变。本发明可以根据权利要求来实践，而无需这些具体细节中的一些或全部。出于清楚的目的，没有详细描述在本发明相关的技术领域中已知的技术材料，以便使本发明不产生不必要的费解。
90.本发明提供与野生型黄瓜相比表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰植物包含至少一种突变的黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因。本发明还提供了使用基因组编辑或其他基因组修饰技术产生上述修饰黄瓜植物的方法。
91.本发明提出的解决方案是使用诸如crispr/cas系统的基因组编辑以产生具有提高的产量并且更具体地具有有限生长习性的栽培黄瓜植物。使用基因组编辑进行育种允许精确且显著缩短的育种过程，从而以高得多的成功率实现这些目标。因此，基因组编辑具有
no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
106.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
107.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
108.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的cusp靶向grna核苷酸序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
109.根据另一个实施方案，本发明提供如seq id no:4-88及其任何组合、seq id no:92-166及其任何组合和seq id no:170-255及其任何组合中的至少一个所示的核苷酸序列分别用于靶向基因组修饰黄瓜 sp-1 (cusp-1)、黄瓜 sp-2 (cusp-2) 和黄瓜 sp-3 (cusp-3) 等位基因或基因的用途。
110.如本文所用，术语“约”表示确定量或测量值或值的
±
25％。
111.如本文所用，术语“相似”表示约
±
20％，特别是
±
15％，更特别是约
±
10％，甚至更特别是约
±
5％的对应或相似范围。
112.如本文所用，术语“对应”通常意指相似（similar）、类似（analogous）、类似（like）、类似（alike）、相似（akin）、平行、相同、相似（resembling）或可比较。在其他方面，它意味着具有或参与相同的关系（例如类型或物种、种类、程度、位置、对应关系或功能）。它进一步意味着相关或伴随。在本发明的一些实施方案中，它指相同黄瓜物种或品系或品种的植物，或指同胞植物，或具有一个或两个共同亲本的一个或多个个体。术语“对应”进一步涵盖野生型黄瓜植物或缺乏遗传修饰（其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达）的黄瓜植物(在本文中也用作野生型或未修饰的黄瓜植物)，或缺乏改良驯化或农艺性状的黄瓜植物。
113.根据本发明的其他方面，如本文所用的术语“对应”或“对应于位置”在本发明的上下文中是指序列同源性或序列同一性。这些术语涉及两个或多个核酸或蛋白质序列，当使用可用序列比较算法之一测量或通过视觉检查进行比较和比对以获得最大对应时，它们相同或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果要相互比较长度不同的两个序列，则序列同一性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分比。如本文所用，两个序列之间的同一性或同源性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数，这考虑缺口数目和每个缺口的长度，其需要被引入用于两条序列的最佳比对。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用相关领域中已知的数学算法来完成。根据本发明的其他方面，术语“对应于核苷酸序列”或“对应于位置”是指所示核苷酸序列的变体、同源物和片段，它们具有或执行相同的生物学功能或与所示核苷酸序列的相同表型特征相关。
114.两个核酸序列基本上相同或一个序列“对应于该核苷酸序列”的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。高严格条件，例如杂交缓冲液中的高杂交温度和低盐，仅允许高度相似的核酸序列之间的杂交，而低严格条件，例如较低温度和高盐，允许在序列不太相似时进行杂交。
115.在本发明的其他实施方案中，此类基本相同的序列是指与所示多核苷酸或氨基酸序列具有至少约80%相似性、优选至少约90%相似性、或者约95%、96%、97%、98%或99% 的相似
性的多核苷酸或氨基酸序列。
116.根据本发明的其他方面，术语“对应”还指互补序列或碱基配对，使得当它们彼此反平行比对时，序列中每个位置的核苷酸碱基将是互补的。两条核酸链之间的互补程度可能不同。
117.如本文所用，“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。术语“植物”包括整株植物或其任何部分或衍生物，例如植物细胞、种子、植物原生质体、可从中再生番茄植物的植物细胞组织培养物、一种或多种植物愈伤组织、分生细胞、小孢子、胚、未成熟胚、花粉、胚珠、花药、果实（例如黄瓜果实）、花、叶、子叶、雌蕊、种子、种皮、根、根尖等。
118.如本文所用，术语“植物细胞”是指植物的结构和生理单元，其包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或作为更高组织单位的一部分，例如植物组织、植物器官或整株植物。
119.如本文所用，术语“植物细胞培养物”是指植物单元的培养物，例如原生质体、可再生细胞、细胞培养物、细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、多个发育阶段的受精卵和胚、叶、根、根尖、花药、分生细胞、小孢子、花、子叶、雌蕊、果实、种子、种皮或其任何组合。
120.如本文所用，术语“植物材料”或“植物部分”是指叶、茎、根、根尖、花或花部分、果实（例如黄瓜果实，特别是如本发明所公开的修饰的黄瓜果实）、花粉、卵细胞、受精卵、种子、种皮、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物或其组合。
121.如本文所用，“植物器官”是指植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花、花蕾或胚。
122.如本文所用，术语“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物、原生质体、分生细胞、愈伤组织和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。该术语与以上列出的或本定义以其他方式所包含的任何特定类型的植物组织结合使用或在缺少以上列出的或本定义以其他方式所包含的任何特定类型的植物组织时使用不旨在排除任何其他类型的植物组织。
123.如本文所用，术语“后代（progeny）”或“后代（progenies）”以非限制性方式指代后代或子代植物。根据某些实施方案，术语“后代”或“后代”是指由尤其详细描述的所公开的或保藏的种子发育或生长或产生的植物。生长的植物优选地具有所公开或保藏的种子的期望性状，即至少一种cusp基因中的功能丧失突变。
124.术语“黄瓜”在下文中是指葫芦科（cucurbitaceae）开花植物的一个属。在本发明的某些方面，它是指黄瓜（cucumis）属内的植物物种，例如黄瓜(c. sativus)物种。
125.如本文所用，术语“驯化”或“驯化性状”是指作物或作物栽培期望的任何农艺性状。本文承认，基于野生祖先和驯化后代之间的关系，已在作物物种中选择驯化表型。
126.在普通作物的驯化过程中出现的性状之一是有限生长(determinacy)，其中茎以顶生花序结束。还在本发明的范围内的是，驯化是指人类在野生植物中进行的选择过程，以适应人类的栽培和食用。这一选择过程使作物的形态和生理发生了显著变化。在作物驯化过程中选择的性状之一是更紧凑的生长习性，表现为一系列性状，例如分枝减少、节间缩短、节数减少、缠绕减少，在一些情况下，有限生长的茎顶端。野生近缘植物一般为藤本、草
本植物，其分枝度高，节数多，节间长而缠绕，分枝向异性生长。缠绕性(vininess)让植物在其中这些野生植物自然生长的灌木或树栖植被中与周围的植物竞争光线。因此，有限生长是在驯化期间或之后选择的一种性状。因此，驯化后，一般来说，茎具有有限的长度，并且开花发生的时间早于无限生长类型。由于有限生长习性允许以较短的生长周期进行机械收获，因此具有有限生长性状的栽培品种在诸如黄瓜等几种作物品种中是优选的。
127.值得注意的是，通过其中人工选择作为强大驱动力的驯化源自其野生祖先的作物，具有修饰的作物基因组以及对人类有益的修饰的形态特征和生长习性。
128.需要强调的是，由于在育种过程中反复使用有限的变异，黄瓜作为经济上重要的蔬菜作物，其遗传基础变得异常狭窄。大多数黄瓜栽培品种具有无限生长的植物习性，其中茎不断伸长，并且具有起源于主茎的1-2个初级侧枝。一些栽培品种在一些生长条件下也会产生次生侧枝（起源于初级侧枝），这是由多基因控制的。当植物以低密度生长时会发生更多的分枝。本发明特别是通过使用基因编辑技术提供具有改良的驯化和/或农艺性状的黄瓜植物解决了这个问题。
129.本发明上下文中的术语“self-pruning”或“sp”是指编码调节合轴生长的开花阻遏物的基因。本文显示，sp 直系同源物的突变引起合轴循环加速和枝条终止（shoot termination）。进一步承认，self pruning (sp) 基因控制沿着例如番茄的复合枝条的营养-生殖开关的规律性，从而调节植物的“有限生长”(sp/sp) 和“无限生长”(sp)习性。sp 是发育调节子，其与金鱼草（antirrhinum）的centroradialis (cen)和拟南芥的 terminal flower 1 (tfl1)和flowering locus t (ft)同源。
130.本发明公开了sp是黄瓜中由至少三种基因组成的基因家族的成员。黄瓜 sp 基因包含分别由如seq. id. no: 1、89 和 167中所示基因组序列、如 seq. id. no: 2、90 和 168中所示编码序列，以及如 seq. id. no: 3、91 和 169中所示的氨基酸序列编码的cusp-1、cusp-2和cusp-3。根据本发明的主要方面，在至少一个上述cusp基因中的基因组编辑靶向突变（其降低了该基因的功能表达）影响了在决定植物构型中起关键作用的植物合轴生长习性。
131.如本文所用，术语“遗传修饰”在下文是指遗传操作或调节，其是使用生物技术直接操作生物体的基因。它还指用于改变细胞遗传组成的一组技术，包括在物种内和物种间转移基因、靶向诱变和基因组编辑技术以产生改良的生物体。根据本发明的主要实施方案，使用基因组编辑机制产生具有改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物。该技术能够实现与黄瓜植物中开花时间和植物构型相关的和/或控制其的特定基因的植物中修饰。
132.术语“基因组编辑”或“基因组/遗传修饰”或“基因组改造”或“基因编辑”在下文中通常指遗传改造的类型，其中dna在活的生物体的基因组中被插入、删除、修饰或替换。与以前将遗传物质随机插入宿主基因组的遗传改造技术不同，基因组编辑将插入靶向位点特异性位置。
133.在本发明的范围内，这种编辑的常用方法使用改造的核酸酶，或“分子剪刀”。这些核酸酶在基因组的期望位置产生位点特异性双链断裂(dsb)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接 (nhej) 或同源重组 (hr)进行修复，产生靶向突变（
‘
编辑’）。本发明使用的改造的核酸酶家族包括但不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和成簇规则间隔短回文重复序列(crispr/cas9）系统。
也在此范围内。
142.现在参考图1 ，其示意性地呈现了如xie, kabin和yinong yang. "rna-guided genome editing in plants using a crispr
–
cas system." molecular plant 6.6 (2013): 1975-1983所描述的crispr/cas9作用机制的实例。如该图所示，cas9 核酸内切酶与嵌合 rna（称为指导 rna 或 grna）形成复合物，取代 crrna-transcrrna 异源双链体，且grna 可通过编程靶向特定位点。grna-cas9 应包含在改造的grna 的 5' 端和靶向基因组位点之间没有错配的至少 15 个碱基配对（grna 种子区域）以及在靶向 dna 互补链中的碱基配对区域之后的ngg 基序（称为前间区序列邻近基序或 pam）。
143.如本文所用，术语“大范围核酸酶”在下文中是指内切脱氧核糖核酸酶，其以大识别位点（12至40个碱基对的双链dna序列）为特征；作为结果，这个位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。因此，大范围核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制酶。
144.如本文所用，术语“前间区序列邻近基序”或“pam”在下文中是指紧接在crispr细菌适应性免疫系统中cas9核酸酶靶向的dna序列之后的2-6个碱基对dna序列。pam 是入侵病毒或质粒的组分，但不是细菌 crispr 基因座的组分。pam 是重要的靶向组分，其可将细菌自身与非自身 dna 区分开来，从而防止 crispr 基因座被核酸酶靶向和破坏。
145.如本文所用，术语“下一代测序”或“ngs”在下文中指的是并行地对数百万个dna小片段进行测序的大规模、平行、高通量或深度测序技术平台。生物信息学分析用于通过将单个读数作图到参考基因组来将这些片段拼凑到一起。
146.如本文所用，术语“基因敲低”在下文中是指通过其降低一种或多种生物体基因表达的实验技术。降低可以通过遗传修饰发生，即靶向基因组编辑或通过用试剂诸如具有与基因或mrna转录物互补的序列的短dna或rna寡核苷酸进行处理。降低的表达可以在 rna 水平或在蛋白质水平。在本发明的范围内，术语基因敲低还指功能丧失突变和/或基因敲除突变，其中使生物体的基因失效或无功能。
147.如本文所用，术语“基因沉默”在下文中是指调节细胞中的基因表达以阻止某种基因的表达。基因沉默可以在转录或翻译过程中发生。在本发明的某些方面，基因沉默被认为与基因敲低具有相似的含义。当基因被沉默时，它们的表达就会降低。相反，当基因被敲除时，它们完全不表达。基因沉默可以被认为是基因敲低机制，因为用于沉默基因的方法，例如rnai、crispr或sirna ，通常会将基因的表达降低至少 70%，但不会完全消除它。
148.如本文所用，术语“功能丧失突变”是指一种突变类型，其中改变的基因产物缺乏野生型基因的功能。包括在本发明范围内的术语的同义词是无效突变。
149.术语“微小rna”或“mirna
ꢀ”
在下文中是指已在大多数真核生物中发现的小的非编码rna。它们以序列特异性方式参与转录后水平的基因表达调控。mirna 是通过 dicer 依赖的小 rna 生物发生途径从它们的前体产生的。mirna 是使用不同的基于 rna 的基因沉默技术研究基因功能的候选者。例如，针对一个或几个目的基因的人工 mirna (amirna) 是功能基因组学中的潜在工具。
150.术语“在植物中”在本发明的上下文中是指在植物或植物细胞内。更具体地，这意味着将crispr/cas复合物引入包含若干细胞的组织培养物的植物材料、整株植物或单个植物细胞中，而不引入外源基因或突变基因。它还用于描述非实验室环境（例如体内）中存在的条件。
151.如本文所用，术语“合轴生长(sympodial growth)”是指一种分叉的分支模式，其中一个分支比另一个分支发育得更强健，导致较强的分支形成初级枝条，而较弱的分支横向出现。合轴(sympodium)也称为合轴(sympode)或合轴(pseudaxis)，是在合轴生长期间形成的主要枝条，其包括更强的分枝。在本发明的一些方面，当顶端分生组织终止并且由一个或多个侧向分生组织（其重复该过程）继续生长时发生合轴生长。顶端分生组织可以被消耗以形成花序或其他确定的结构，或者它可能被中止。
152.还在本发明的范围内的是，两个连续花序之间的枝条部分被称为'合轴' ，每个合轴的叶节数被称为'合轴指数' (spi)。第一个终止事件激活'合轴循环' 。在合轴植物中，明显的主枝条由重复排列的'合轴单位'组成。突变的 sp 基因加速了合轴单位的终止，但不改变合轴习性。结果是花序之间营养节点的数量以依赖于光强度和遗传背景的模式逐渐减少。
153.术语“早熟”在下文中是指提前开花和/或从营养阶段到生殖阶段的快速转变，或减少的“开始开花的时间”，更一般地是指生命周期的较早完成。
154.如本文所用，术语“减少的开花时间”是指产生第一个花序的时间。例如，可以参考在第一个花序出现之前产生的叶子的数量来评估或测量这个性状。
155.术语“收获指数”在本文中可以定义为每株植物重量的总产量。
156.在本发明的上下文中使用的术语“日长”或“日长敏感性”通常是指光周期，它是生物体对白天或黑夜长度的生理反应。光周期也可以定义为植物对光照和黑暗周期的相对长度的发育反应。植物根据光周期分为三类：短日照植物、长日照植物和日中性植物。光周期通过诱导枝条产生花芽而不是叶子和侧芽来影响开花。黄瓜包括在短日照兼性植物中也在本发明的范围内。本发明的黄瓜植物被遗传修饰以表现出日长敏感性的丧失，这是非常需要的能够提高栽培作物产量的农艺性状。
157.如本文所用，术语“有限的”或“有限生长”是指植物生长，其中主茎以花序或其他生殖结构（例如芽）结束，并停止持续无限伸长，而只有来自主茎的分枝具有进一步且类似被限制的增长。它也指以从中央或最上部芽到侧芽或基部芽连续开花为特征的生长。它进一步意味着天然自我限制的生长，导致植物具有确定的最大尺寸。
158.如本文所用，术语“无限的”或“无限生长”是指植物的生长，其中主茎持续无限伸长而不受顶生花序或其他生殖结构的限制。它也指以从侧芽或基部芽到中央或最上部芽连续开花为特征的生长。
159.如本文所用，术语“直系同源物”在下文是指在不同物种中发现的两种或更多种同源基因序列之一。
160.如本文所用，例如参考seq id no:1、4或7，术语“功能变体”或“核酸或氨基酸序列的功能变体”是指序列的变体或序列的一部分，其保留完整的非变体等位基因（例如cusp等位基因）的生物学功能，因此具有sp表达基因或蛋白质的活性。功能变体还包括编码多肽的目的基因的变体，所述多肽例如在非保守残基中具有不影响所得蛋白质功能的序列改变。还包括这样的变体，其与本文所示等位基因的野生型核酸或氨基酸序列基本相同（即仅具有一些序列变异，例如在非保守残基中）并且具有生物活性。
161.如本文所用，术语“品种”或“栽培品种”是指通过结构特征和性能可以从同一物种内的其他品种中鉴定的一组相似植物。
162.如本文所用，术语“等位基因”是指特定基因座处基因或遗传单元的一种或多种备选或变体形式中的任何一种，所有这些等位基因与具体基因座处的一种性状或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的一个特定位置或基因座（多个基因座）。等位基因的备选或变体形式可能是单核苷酸多态性、插入、倒位、易位或缺失的结果，或者是由例如化学或结构修饰、转录调控或翻译后修饰/调控引起的基因调控的结果。与质量性状相关的等位基因可以包含多种遗传单位的备选或变体形式，包括与单个基因或多个基因或其产物、或甚至破坏促成由基因座所代表的表型的遗传因素或由其控制的基因相同或相关的那些。根据进一步的实施方案，术语“等位基因”指特定基因座处基因的一种或多种备选形式中的任何一种。杂合等位基因是同一基因座上的两个不同等位基因。纯合等位基因是特定基因座处的两个相同等位基因。野生型等位基因是天然存在的等位基因。在本发明的上下文中，术语等位基因是指黄瓜中三种已鉴定的sp基因，即cusp-1、cusp-2和cusp-3，其分别具有如seq id no:1、89和167所示的基因组核苷酸序列。
163.如本文所用，术语“基因座”(多个基因座)是指染色体上的一个或多个特定位置或区域或位点，其中例如发现基因或遗传标记元件或因子。在具体实施方案中，这样的遗传元件有助于性状。
164.如本文所用，术语“纯合的”是指当两个相同或相似的等位基因位于具体基因座，但分别位于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传状况或构型。
165.在具体实施方案中，本发明的黄瓜植物包含至少一种突变的cusp基因(即cusp-1、cusp-2和cusp-3)的纯合构型。
166.相反，如本文所用，术语“杂合的”是指当两个不同或不相似的等位基因位于具体基因座，但分别位于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传状况或构型。
167.如本文所用，短语“遗传标记”或“分子标记”或“生物标记”是指个体基因组中的特征，例如与一个或多个基因座或目的性状相关的核苷酸或多核苷酸序列。 在一些实施方案中，遗传标记在目的群体中是多态的，或者基因座被多态性占据，这取决于上下文。遗传标记或分子标记包括例如单核苷酸多态性(snp)、插入缺失(即插入缺失)、简单序列重复(ssr)、限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rafd)、切割扩增多态性序列 (caps) 标志物、多样性阵列技术 (dart) 标志物和扩增片段长度多态性 (aflp) 或其组合，以及许多其他实例，例如 dna 序列本身。例如，遗传标记可用于定位染色体上含有等位基因的遗传基因座，这些等位基因有助于表型性状的变异性。短语“遗传标记”或“分子标记”或“生物标记”还可以指与基因组序列互补或对应的多核苷酸序列，例如用作探针或引物的核酸序列。
168.如本文所用，术语“种质”是指群体或其他个体群体（例如，物种）的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，作为多种等位基因储存库的一组植物。此类种质基因型或种群包括已证明具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，以及遗传价值未知或未经证实的植物材料；其不属于已建立的育种种群的一部分，并且与已建立的育种种群的成员没有已知的关系。
169.如本文所用，术语“杂合体”、“杂合植物”和“杂合后代”是指从遗传上不同的亲本产生的个体（例如遗传上杂合的或大部分杂合的个体）。
170.如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的"序列同一性"或"同一性"指代当在具体比较窗口内针对最大对应性进行比对时相同的两个序列中的残基。 当就蛋白而言使用序列同一性百分比时，认识到不同的残基位置经常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被取代为具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。该术语在下文中进一步指的是在两个不同序列之间完全匹配的字符的数量。因此，不计算空位，并且测量结果与两个序列中较短的序列有关。
171.进一步在所述范围内的是，术语“相似性”和“同一性”还指局部同源性，鉴定同源或相似的结构域（在核苷酸和/或氨基酸序列中）。公认的是，诸如 blast、ssearch、fasta 和 hmmer 等生物信息学工具计算局部序列比对，其鉴定两个序列之间最相似的区域。对于在不同蛋白质的不同序列背景中发现的结构域，比对应限于同源结构域，因为结构域同源性提供了得分中捕获的序列相似性。根据一些方面，术语相似性或同一性进一步包括序列基序，其是广泛存在的并且具有或推测具有生物学意义的核苷酸或氨基酸序列模式。蛋白质可以具有序列基序和/或结构基序，由可能不相邻的氨基酸的三维排列形成的基序。
172.如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括dna分子（例如，cdna或基因组dna）、rna分子（例如， mrna)、天然存在的、突变的、合成的 dna 或 rna 分子，以及使用核苷酸类似物产生的 dna 或 rna 的类似物。它可以是单链的或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mrna或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语还包括基因。术语“基因”、“等位基因”或“基因序列”广泛用于指与生物学功能相关的dna核酸。因此，基因可包括基因组序列中的内含子和外显子，或可仅包括如cdna中的编码序列，和/或可包括与调控序列组合的cdna。因此，根据本发明的多个方面，可以使用基因组dna、cdna或编码dna。在一个实施方案中，核酸是cdna或编码dna。
173.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。
174.根据本发明的其他方面，“修饰的”或“突变体”植物是与天然存在的野生型(wt)植物相比已经改变的植物。具体而言，使用如本文所述的诱变和/或基因组编辑方法，与野生型序列相比，黄瓜中每个sp同源物的内源核酸序列（核酸序列cusp-1、cusp-2和cusp-3）已经改变。这引起内源性 sp 基因失活，从而使sp 失去功能。与野生型植物相比，此类植物具有改变的表型并显示出改良的驯化性状，例如决定性植物构型、同步和/或早期开花以及日长敏感性的丧失。因此，改良的驯化表型是由已使用基因组编辑技术进行了特异性靶向的黄瓜植物基因组中至少一种突变的内源cusp基因的存在赋予的。
175.根据本发明的其他方面，至少一种改良的驯化性状不是由黄瓜中表达的转基因的存在赋予的。
176.进一步在本发明的范围内的是，下调或破坏野生型sp序列的功能表达的sp突变可以是隐性的，使得它们由野生型序列的表达补充。
177.进一步注意，野生型黄瓜植物是不具有任何突变体sp等位基因的植物。
178.本发明的主要方面涉及靶向诱变方法，特别是基因组编辑，并且排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。在本发明的其他实施方案中，如本文所解释的，改良的驯化至少一个性状不是由于转基因的存在。
179.发明人已经产生了具有使至少一种cusp同源等位基因(homoeoallele)失活的突变（其赋予可遗传的改良的驯化性状）的突变体黄瓜株系。以这种方式，没有产生功能性 cusp 蛋白。因此，本发明涉及这些突变体黄瓜株系和相关方法。
180.进一步在本发明的范围内的是，培育具有突变的sp等位基因的黄瓜栽培品种能够实现植物的机械收获。根据本发明的其他方面，sp功能的丧失导致与wt黄瓜相比具有降低的高度、减少的合轴单元数量和有限生长的紧凑黄瓜植物。
181.根据本发明的主要方面，通过选择成花素开花途径基因中的突变来修饰黄瓜枝条构型允许植物构型和产量的重大改良。特别是，抗成花素selfpruning (sp) 基因 (经典sp) 中的突变提供了紧凑的“有限”生长，其转化为开花的爆发，从而实现了大规模的田间生产。
182.尤其是，所描述的工作具有重要意义。结果已经显示，crispr/cas9 可用于在成花素途径家族成员中产生可遗传的突变，其产生期望的表型效应。
183.为了同时编辑多个驯化基因并堆叠产生的等位基因变体，一个选项是通过使用 csy4 多 grna 系统将若干个 grna组装到一个构建体中以编辑若干个基因。然后通过适当的载体将该构建体转化到若干种野生黄瓜种质资源中。
184.进一步在本发明的范围内的是，使用指导rna靶向黄瓜sp基因，即cusp-1、cusp-2和cusp-3，其分别具有如seq. id. no: 1、89和167所示的基因组核苷酸序列、如 seq. id. no: 2、90 和 168所示的编码序列，以及如 seq. id. no: 3、91 和 169 所示的氨基酸序列。已经鉴定了若干个突变的等位基因。值得注意的是，具有突变 sp 等位基因的植物比缺乏突变等位基因的野生型植物更加紧凑。
185.功能缺失突变可以是参照野生型cusp等位基因序列的缺失或插入（“插入缺失”）。缺失可包含在一条或多条链中1-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个核苷酸或更多个。插入可以包含在一条或多条链中1-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个或更多个核苷酸。
186.本发明的植物包括其中该植物对于每个突变是杂合的植物。然而，在优选的实施方案中，植物对于突变是纯合的。根据本领域已知的方法，可以从这些植物中产生也是纯合的后代。
187.进一步在所述范围内的是，根据本发明多个方面的特定cusp核苷酸或氨基酸序列的变体将与如seq id no 1、89或167所示的cusp等位基因的特定非变体cusp核苷酸序列具有至少约50%-99%，例如至少75%，例如至少85%、 86%、87%、88%、89%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更高的序列同一性。确定序列同一性的序列比对程序是本领域众所周知的。
188.同样，本发明的多个方面不仅包括cusp核酸序列或氨基酸序列，还包括其片段。“片段”意指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及由此编码的蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性（在这种情况下是改良的驯化性状）的蛋白质片段。
189.根据本发明的进一步实施方案，本文新鉴定的黄瓜sp(cusp)已使用双sgrna策略进行了靶向。
190.根据本发明的进一步实施方案，可以通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和dna的机械插入(peg介导的dna转化、基因枪法等)完成将dna引入植物细胞。
191.此外，在本发明的范围内的是，将cas9蛋白与grna（核糖核蛋白-rnp's）一起直接插入，以绕过cas9 grna质粒在植物中体内转录和翻译的需要，来实现基因编辑。
192.也可以创建基因组编辑植物并将其用作砧木（rootstock）。然后，cas 蛋白和 grna 可以通过脉管系统运输到植物顶部，并在接穗（scion）中产生基因组编辑事件。
193.在本发明的范围内，使用crispr/cas系统产生具有至少一种改良的驯化性状的黄瓜植物，允许在不通过gmo技术将外源dna引入基因组的情况下修饰预定的特定dna序列。根据本发明的一个实施方案，这通过将cas核酸酶(例如cas9、cpf1等)与预定义的指导rna分子(grna)组合来实现。grna 与植物基因组中靶向编辑的具体 dna 序列互补，并且其将 cas 核酸酶引导至具体核苷酸序列（例如参见图 1）。将预定义的基因特异性 grna 克隆到与 cas 基因相同的质粒中，并将该质粒插入植物细胞中。上述质粒dna的插入可以但不限于使用不同的递送系统、生物的和/或机械的，例如农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和dna的机械插入（peg介导的dna转化，基因枪法等)来完成。
194.进一步在本发明的范围内的是，当到达具体的预定dna序列时，cas9核酸酶切割两条dna链以产生双链断裂，留下平末端。然后通过细胞非同源末端连接 dna 修复机制修复该切割位点，导致插入或缺失，其最终在切割位点处产生突变。例如，公认的是突变的缺失形式由至少 1 个碱基对缺失组成。由于这种碱基对缺失，基因编码序列被破坏，并且编码蛋白质的翻译受到过早终止密码子或蛋白质功能或结构特性破坏的损害。因此 dna 被 cas9 蛋白切割并通过细胞的 dna 修复机制重新组装。
195.进一步在范围内的是，在本文中通过以下产生黄瓜植物中的改良的驯化性状：产生与黄瓜基因组中预定基因即sp基因的具体位点具有同源性的grna，将该grna亚克隆到含有cas9基因的质粒中，并将质粒插入黄瓜植物细胞中。以这种方式产生sp 基因中的位点特异性突变，因此有效地产生非活性分子，导致基因组编辑植物的有限生长习性。
196.根据一个实施方案，本发明提供了表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰的植物包含至少一种遗传修饰，该遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
197.根据本发明的另一个实施方案，cusp基因选自具有如seq id no:1所示基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如seq id no:89所示基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如seq id no:167所示基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
198.根据本发明的另一个实施方案，功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
199.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
200.根据本发明的另一个实施方案，使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合来引入遗传修饰。
201.根据本发明的另一个实施方案，修饰的黄瓜植物包含使用靶向基因组修饰在所述
至少一个cusp基因中引入的至少一种遗传修饰。
202.根据本发明的另一个实施方案，使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关(cas)基因(crispr/cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指状核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入遗传修饰。
203.根据本发明的另一个实施方案，所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
204.根据本发明的另一个实施方案，遗传修饰的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因。
205.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
206.根据本发明的另一个实施方案，插入或缺失产生包含移码的基因。
207.根据本发明的另一个实施方案，所述植物对于所述至少一种遗传修饰的cusp基因是纯合的。
208.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
209.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
210.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰在植物中产生。
211.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
212.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-1中的所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白选自 seq id no: 4-88的和 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
213.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
214.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170-seq id no:255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
215.根据本发明的另一个实施方案，所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序 （pam）。
216.根据本发明的另一个实施方案，所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
217.根据本发明的另一个实施方案，所述植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
218.根据本发明的另一个实施方案，所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
219.根据本发明的另一个实施方案，所述植物是半有限生长的。
220.根据本发明的另一个实施方案，所述植物具有有限生长习性。
221.根据本发明的另一个实施方案，所述植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
222.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出改进的早熟。
223.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出抑制的合轴苗终止。
224.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出相似的合轴苗终止。
225.根据本发明的另一个实施方案，所述驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
226.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
227.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子包含至少一种遗传修饰，其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的降低表达。
228.进一步在本发明的范围内公开从如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
229.根据本发明的另一个实施方案，所述修饰的植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
230.根据另一个实施方案，本发明提供用于产生表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物的方法，其中所述方法包括遗传修饰至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的步骤。
231.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其包括使用靶向基因组修饰通过在所述至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因中遗传引入功能丧失突变来产生修饰黄瓜植物的步骤。
232.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰赋
予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
233.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
234.进一步在本发明的范围内公开上述任一项所定义的方法，其中所述方法包括以下步骤： (a)鉴定至少一种黄瓜sp (cusp)基因或等位基因； (b)合成至少一种指导rna(grna)，其包含与所述至少一种鉴定的cusp等位基因互补的核苷酸序列； (c)用构建体转化黄瓜植物细胞，该构建体包含(a)可操作地连接至所述至少一种grna的cas核苷酸序列，或(b)包含cas蛋白和所述至少一种grna的核糖核蛋白(rnp)复合物；(d) 针对至少一种所述cusp等位基因或基因中诱导的靶向功能丧失突变筛选所述转化植物细胞的基因组；(e)再生黄瓜植物，其在至少一种所述cusp等位基因或基因中携带所述功能丧失突变；和 (f) 针对具有改良的驯化性状的黄瓜植物筛选所述再生植物。
235.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中针对诱导的靶向功能丧失突变筛选所述转化植物细胞的基因组的所述步骤进一步包括以下步骤：获得所述转化的植物的核酸样品，并进行核酸扩增和任选地限制性内切酶消化以检测所述cusp等位基因或基因中的所述至少一种中的突变。
236.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp黄瓜基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
237.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
238.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
239.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用靶向基因编辑引入的。
240.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
241.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
242.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中突变的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因或基因。
243.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
244.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
245.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物对于所述至少一种cusp突变基因是纯合的。
246.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
247.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
248.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在植物中产生。
249.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
250.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-1中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
251.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
252.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170
‑ꢀ
255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
253.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序（pam）。
254.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
255.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
256.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
257.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物
是半有限生长的。
258.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有有限生长习性。
259.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
260.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出改进的早熟。
261.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出抑制的合轴苗终止。
262.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出相似的合轴苗终止。
263.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应的黄瓜植物相比，所述修饰的植物展示出抑制的或降低的日长敏感性。
264.进一步在本发明的范围内公开通过如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
265.进一步在本发明的范围内公开通过如上述任一项所定义的方法产生的植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子。
266.进一步在本发明的范围内公开从如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
267.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
268.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述至少一种驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
269.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:1、seq id no:89和seq id no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
270.根据本发明的另一个实施方案，分离的核苷酸序列与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75%序列同一性。
271.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
272.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的靶向cusp的grna核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
273.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-1(cusp-1) 等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
274.进一步在本发明的范围内公开与如seq id no:92-166的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-2(cusp-2)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
275.进一步在本发明的范围内公开与如seq id no:170-255的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-3(cusp-3)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
276.为了理解本发明并了解其如何在实践中实施，现在将参考以下实施例，仅通过非限制性实例的方式描述多个优选实施方案。
277.实施例1通过靶向基因编辑产生具有改良的驯化性状的黄瓜植物具有突变 sp 基因的黄瓜株系的产生可以通过以下育种/栽培方案中的至少一种来实现：方案1：
· 通过自花授粉的品系稳定
· f6亲本系的产生
· 亲本系的基因组编辑
· 交叉编辑的亲本系以生成 f1 杂合植物。
278.方案2：
· 鉴定目的基因/等位基因
· 设计 grna
· 用 cas9 grna 构建体转化植物
· 筛选和鉴定编辑事件
· 亲本系的基因组编辑注意，品系稳定可以通过以下方式执行：
· 诱导植物雄性开花
· 自花授粉。
279.根据本发明的一些实施方案，品系稳定需要大约6次自交（6代）并通过单种子下降（ssd）方法完成。
280.f1杂合种子产生：新杂合体是通过不同黄瓜品系之间的杂交产生的。
281.根据本发明的另一方面，通过加倍单倍体(dh)进行缩短品系稳定。更具体地说，将crispr-cas9系统转化到小孢子中以获得dh纯合亲本系。加倍单倍体 (dh) 是单倍体细胞进行染色体加倍时形成的基因型。人工产生加倍单倍体在植物育种中很重要。本文承认，传统的近亲育种过程需要大约六代才能达到大约完全的纯合性，而加倍单倍体在一代内就可以实现。
282.在本发明的范围内，本发明开发并提供了对黄瓜具有特异性的遗传标记：
· 基因分型标记-本发明中使用的种质使用分子标记进行基因分型，以允许更有效的育种过程和sp编辑事件的鉴定。
283.分析所用黄瓜品系的等位基因和遗传变异也在本发明的范围内。
284.现在参考已用于通过基因组编辑产生突变的sp黄瓜植物的可选阶段：第 1 阶段：鉴定黄瓜( c. sativus ) sp 基因 (cusp)。
285.本文已在黄瓜( c. sativus ) 中鉴定出三种 sp 直系同源物，即 cusp-1、cusp-2 和 cusp-3。这些同源基因已被测序和作图定位。
286.cusp-1 已被定位到 csgy3g032260:29750603-29747435 [chr3, csgy3g032260 (基因) 黄瓜 (gy14) v2] 并具有如 seq id no: 1 所示的基因组序列。cusp-1基因具有如seq id no:2所示的编码序列并且其编码如seq id no:3所示的氨基酸序列。
[0287]
cusp-2 已被定位到 csgy6g024900:21554140-21555525 [chr6, csgy6g024900 (基因) 黄瓜(gy14) v2] 并具有如 seq id no:89 所示的基因组序列。cusp-2基因具有如seq id no:90所示的编码序列，并且其编码如seq id no:91所示的氨基酸序列。
[0288]
cusp-3 已被定位到 csgy6g012560:10805149-10806778 [chr6, csgy6g012560 (基因) 黄瓜(gy14) v2] 并具有如 seq id no: 167 所示的基因组序列。cusp-3基因具有如seq id no:168所示的编码序列，并且其编码如seq id no:169所示的氨基酸序列。
[0289]
第2阶段：设计和合成对应于靶向编辑的序列，即基因cusp-1、cusp-2和cusp-3中的每一个的序列的grna分子。注意，编辑事件优选地靶向独特的限制性位点序列，以允许更容易地筛选在其基因组内携带编辑事件的植物。根据本发明的一些方面，grna的核苷酸序列应该与靶基因的基因组序列完全相容。因此，例如，应该为不同的 sp 同源物或等位基因以及不同的黄瓜品系构建合适的 grna 分子。
[0290]
将设计的 grna 分子克隆到合适的载体中，并已经验证了它们的序列。此外，已经分析了在黄瓜植物中不同的 cas9 版本在cas9 蛋白活性与grna 分子之间的最佳相容性。
[0291]
现在参考表1-3，其分别呈现了为沉默cusp-1、cusp-2和cusp-3基因而构建的grna序列。术语“pam”在下文中是指前间区序列邻近基序，它是紧随 crispr 细菌适应性免疫系统中 cas9 核酸酶靶向的 dna 序列的 2-6 个碱基对 dna 序列。基因组dna有义链标记为“1”，且反义链标记为
“‑
1”。
[0292]
表 1：靶向cusp-1 的 grna 和 pam 序列
[0293]
表 2：靶向 cusp-2 的 grna 和 pam 序列
[0294]
表 3：靶向 cusp-3 的 grna 和 pam 序列
[0295]
参考表4，其呈现了本发明范围内的序列概述。
[0296]
表4：本发明范围内的序列概述
。
[0297]
上述 grna 分子已被克隆到合适的载体中，并且其序列已得到验证。此外，已经分析了黄瓜植物中不同的 cas9 版本在cas9 蛋白活性与grna 分子之间的最佳相容性。
[0298]
已通过瞬时转化黄瓜组织培养物验证了设计的 grna 分子的效率。携带 grna 序列和 cas9 基因的质粒已被转化到黄瓜原生质体中。原生质体细胞已经生长了很短的时间，然后分析基因组编辑事件的存在。阳性构建体已经经受本文建立的稳定转化方案进入黄瓜植物组织，用于在sp基因中产生基因组编辑的黄瓜植物。
[0299]
第 3 阶段：使用农杆菌或基因枪（基因枪）方法转化黄瓜植物。对于农杆菌和基因枪，可以使用携带（cas9 基因特异性 grna）的 dna 质粒。构建了含有选择标志物、cas9 基因和相关基因特异性grna’s 的载体。对于基因枪，使用携带（cas9 蛋白 基因特异性 grna）的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。rnp 复合物是通过将 cas9 蛋白与相关基因特异性 grna’s混合而产生的。
[0300]
根据本发明的一些实施方案，多种黄瓜组织的转化使用以下的粒子轰击进行：
· dna 载体
· 核糖核蛋白复合物 (rnp’s))。
[0301]
根据本发明的进一步实施方案，多种黄瓜组织的转化使用农杆菌(agrobacterium tumefaciens )通过以下方式进行：
· 基于再生的转化
· 浸花转化
· 幼苗转化。
[0302]
通过瞬时 gus 转化实验，将农杆菌的转化效率与轰击法进行了比较。转化后，进行转化体的gus 染色。
[0303]
现在参考图2，其以照片方式呈现再生的转化黄瓜组织。黄瓜种子在黑暗中发芽 3 天，然后切下子叶并置于再生培养基上。切下后两到三周，再生的黄瓜幼苗开始出现在子叶切割部位（标有红色*）。
editing". nature plants 4 (2018): 766
–
770.xie kabin和yinong yang. "rna-guided genome editing in plants using a crispr
–
cas system". molecular plant 6 (2013): 1975-1983。
发明领域
1.本公开涉及在黄瓜植物中赋予期望的农艺性状。更具体地，本发明涉及通过操纵控制日长敏感性和植物构型的基因来产生具有改良产量性状的黄瓜植物。
2.发明背景作物生产力最重要的决定因素之一是植物构型。对于许多作物来说，人工选择修饰的枝条构型为提高产量提供了关键步骤，其次是提供了使得能够大规模田间生产的创新。一个突出的实例是番茄，其中编码抗成花素（antiflorigen）的自修剪基因 (sp) 突变的发现，产生了有限生长(determinate)植物，其提供了开花爆发(burst)和同步果实成熟，从而允许机械收获。
3.li 等人 (2018) 的出版物教导将一组六个 grna 组装成一个构建体，以编辑四个基因（ slclv3、slwus、sp和sp5g ）。该构建体被转化到四种醋栗番茄（s. pimpinellifolium）种质资源(accessions)中，所有这些都对细菌性斑点病具有抗性，并且其中两种具有耐盐性。已在 t0 及其 t1 突变植物中的slclv3 和 slwus 的靶向调控区域中鉴定出小插入缺失和大插入。据该出版物中报道，尽管 sp 和 sp5g 对于提高收获指数至关重要，但有限的等位基因变异阻碍了优化这一性状的努力。据进一步报道，在目标 slclv3 启动子区域中具有大插入和倒位的 t0 和 t1 植物中小室数量没有增加。对这一发现的一种解释是，slclv3 启动子的目标区域对于调节 slclv3 转录可能不是必需的。或者，有人提出，slwus下游carg 转录抑制元件侧翼区域的破坏可能降低了其转录并由于小肽编码基因 clv3 (clavata3) clv3和同源框编码基因wus (wuschel)的负反馈环，抵消了 slclv3 突变在控制干细胞增殖中的作用。
4.zs
ögö
n 等人（2018）的出版物公开了设计的 crispr-cas9 基因组改造策略，以将农艺学上期望的性状与醋栗番茄（solanum pimpinellifolium）野生系中呈现的有用性状结合起来。四个编辑的基因是self-pruning (sp)、ovate (o)、fruit weight 2.2 (fw2.2)和lycopene beta cyclase (cycb)。
5.lemmon 等人（2018）描述了使用 crispr
–
cas9 来突变番茄驯化和改良基因的直系同源物，所述基因控制孤儿茄科（solanaceae）作物“地樱桃（groundcherry）”（印加酸浆（physalis pruinosa））中的植物构型、花产生和果实大小。
6.鉴于上述内容，仍然存在长期认识到但尚未满足的需要来以快速有效的方式操纵黄瓜植物构型和花产生以提高产量和降低生产成本。
7.发明概述因此，本发明的一个目的是公开表现出至少一种改良的驯化性状的修饰黄瓜植物，其中所述修饰植物包含至少一种遗传修饰，该遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
8.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具
有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
9.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
10.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
11.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
12.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰的黄瓜植物包含使用靶向基因组修饰在所述至少一种cusp基因中引入的至少一种遗传修饰。
13.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是使用crispr（成簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
14.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
15.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中遗传修饰的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因。
16.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
17.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
18.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物对于所述至少一种遗传修饰的cusp基因是纯合的。
19.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区中的突变、或是表观遗传因子。
20.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
21.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗传修饰在植物中产生。
22.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述遗
传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
23.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-1中的所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
24.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
25.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170-seq id no:255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
26.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述grna序列包含3' ngg前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif）（pam）。
27.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg) 介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
28.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
29.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
30.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物是半有限生长的(semi-determinant)。
31.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物具有有限生长习性。
32.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
33.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出改进的早熟。
34.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出抑制的合轴苗终止(sympodial shoot termination)。
35.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出相似的合轴苗终止。
36.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述驯
化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
37.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
38.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子包含至少一种遗传修饰，其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的降低表达。
39.本发明的另一个目的是公开从如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
40.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
41.本发明的另一个目的是公开用于产生表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物的方法，其中所述方法包括遗传修饰至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的步骤。
42.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其包括使用靶向基因组修饰通过在所述至少一个黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因中遗传引入功能丧失突变来产生修饰黄瓜植物的步骤。
43.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
44.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
45.本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中所述方法包括以下步骤： (a)鉴定至少一种黄瓜sp (cusp)基因或等位基因；(b)合成至少一种指导rna(grna)，其包含与所述至少一种鉴定的cusp等位基因互补的核苷酸序列； (c)用构建体转化黄瓜植物细胞，该构建体包含(a)可操作地连接至所述至少一种grna的cas核苷酸序列，或(b)包含cas蛋白和所述至少一种grna的核糖核蛋白(rnp)复合物；(d) 筛选所述转化植物细胞的基因组中至少一种所述cusp等位基因或基因中诱导的靶向功能丧失突变；(e)再生黄瓜植物，其在至少一种所述cusp等位基因或基因中携带所述功能丧失突变；和 (f) 针对具有改良的驯化性状的黄瓜植物筛选所述再生植物。
46.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述筛选所述转化植物细胞的基因组中诱导的靶向功能丧失突变的所述步骤进一步包括以下步骤：获得所述转化的植物的核酸样品，并进行核酸扩增和任选地限制性内切酶消化以检测所述cusp等位基因或基因中的所述至少一种中的突变。
47.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp黄瓜基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
48.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
49.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
50.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用靶向基因编辑引入的。
51.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
52.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
53.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中突变的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因或基因。
54.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
55.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
56.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物对于所述至少一种cusp突变基因是纯合的。
57.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
58.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
59.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在植物中产生。
60.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
61.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-1中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的 grna 序列及
其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
62.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
63.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170
‑ꢀ
255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
64.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序 （pam）。
65.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
66.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
67.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
68.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物是半有限生长的。
69.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有有限生长习性。
70.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
71.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出改进的早熟。
72.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出抑制的合轴苗终止。
73.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出相似的合轴苗终止。
74.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应的黄瓜植物相比，所述修饰的植物展示出抑制的或降低的日长敏感性。
75.本发明的另一个目的是公开通过如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
76.本发明的另一个目的是公开通过如上述任一项所定义的方法产生的植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子。
77.本发明的另一个目的是公开从如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
78.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
79.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所定义的方法，其中所述至少一种驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
80.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:1、seq id no:89和seq id no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
81.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
82.本发明的另一个目的是公开与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
83.本发明的另一个目的是公开与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的靶向cusp的grna核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
84.本发明的另一个目的是公开如seq id no:4-88的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-1(cusp-1) 等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
85.本发明的另一个目的是公开如seq id no:92-166的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-2(cusp-2)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
86.本发明的另一个目的是公开如seq id no:170-255的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-3(cusp-3)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
87.附图简述将参考实施方案的以下描述并结合附图来描述所公开主题的示例性非限制性实施方案。附图通常不按比例显示，并且任何尺寸仅意味着示例性而非必然限制性的。相应的或类似的元素可选地由相同的数字或字母表示。
88.图 1示意性地展示了 xie 和 yang (2013) 所描述的 crispr/cas9 作用模式；和图 2用照相显示了再生的转化黄瓜组织。
89.优选实施方案的详细描述在优选实施方案的以下详细描述中，参考了构成其一部分的附图，并且在附图中通过说明显示了其中可以实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并且可以进行结构改变。本发明可以根据权利要求来实践，而无需这些具体细节中的一些或全部。出于清楚的目的，没有详细描述在本发明相关的技术领域中已知的技术材料，以便使本发明不产生不必要的费解。
90.本发明提供与野生型黄瓜相比表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰植物包含至少一种突变的黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因。本发明还提供了使用基因组编辑或其他基因组修饰技术产生上述修饰黄瓜植物的方法。
91.本发明提出的解决方案是使用诸如crispr/cas系统的基因组编辑以产生具有提高的产量并且更具体地具有有限生长习性的栽培黄瓜植物。使用基因组编辑进行育种允许精确且显著缩短的育种过程，从而以高得多的成功率实现这些目标。因此，基因组编辑具有
no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
106.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
107.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
108.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的cusp靶向grna核苷酸序列具有至少75%序列同一性的分离的核苷酸序列。
109.根据另一个实施方案，本发明提供如seq id no:4-88及其任何组合、seq id no:92-166及其任何组合和seq id no:170-255及其任何组合中的至少一个所示的核苷酸序列分别用于靶向基因组修饰黄瓜 sp-1 (cusp-1)、黄瓜 sp-2 (cusp-2) 和黄瓜 sp-3 (cusp-3) 等位基因或基因的用途。
110.如本文所用，术语“约”表示确定量或测量值或值的
±
25％。
111.如本文所用，术语“相似”表示约
±
20％，特别是
±
15％，更特别是约
±
10％，甚至更特别是约
±
5％的对应或相似范围。
112.如本文所用，术语“对应”通常意指相似（similar）、类似（analogous）、类似（like）、类似（alike）、相似（akin）、平行、相同、相似（resembling）或可比较。在其他方面，它意味着具有或参与相同的关系（例如类型或物种、种类、程度、位置、对应关系或功能）。它进一步意味着相关或伴随。在本发明的一些实施方案中，它指相同黄瓜物种或品系或品种的植物，或指同胞植物，或具有一个或两个共同亲本的一个或多个个体。术语“对应”进一步涵盖野生型黄瓜植物或缺乏遗传修饰（其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达）的黄瓜植物(在本文中也用作野生型或未修饰的黄瓜植物)，或缺乏改良驯化或农艺性状的黄瓜植物。
113.根据本发明的其他方面，如本文所用的术语“对应”或“对应于位置”在本发明的上下文中是指序列同源性或序列同一性。这些术语涉及两个或多个核酸或蛋白质序列，当使用可用序列比较算法之一测量或通过视觉检查进行比较和比对以获得最大对应时，它们相同或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果要相互比较长度不同的两个序列，则序列同一性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分比。如本文所用，两个序列之间的同一性或同源性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数，这考虑缺口数目和每个缺口的长度，其需要被引入用于两条序列的最佳比对。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用相关领域中已知的数学算法来完成。根据本发明的其他方面，术语“对应于核苷酸序列”或“对应于位置”是指所示核苷酸序列的变体、同源物和片段，它们具有或执行相同的生物学功能或与所示核苷酸序列的相同表型特征相关。
114.两个核酸序列基本上相同或一个序列“对应于该核苷酸序列”的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。高严格条件，例如杂交缓冲液中的高杂交温度和低盐，仅允许高度相似的核酸序列之间的杂交，而低严格条件，例如较低温度和高盐，允许在序列不太相似时进行杂交。
115.在本发明的其他实施方案中，此类基本相同的序列是指与所示多核苷酸或氨基酸序列具有至少约80%相似性、优选至少约90%相似性、或者约95%、96%、97%、98%或99% 的相似
性的多核苷酸或氨基酸序列。
116.根据本发明的其他方面，术语“对应”还指互补序列或碱基配对，使得当它们彼此反平行比对时，序列中每个位置的核苷酸碱基将是互补的。两条核酸链之间的互补程度可能不同。
117.如本文所用，“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。术语“植物”包括整株植物或其任何部分或衍生物，例如植物细胞、种子、植物原生质体、可从中再生番茄植物的植物细胞组织培养物、一种或多种植物愈伤组织、分生细胞、小孢子、胚、未成熟胚、花粉、胚珠、花药、果实（例如黄瓜果实）、花、叶、子叶、雌蕊、种子、种皮、根、根尖等。
118.如本文所用，术语“植物细胞”是指植物的结构和生理单元，其包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或作为更高组织单位的一部分，例如植物组织、植物器官或整株植物。
119.如本文所用，术语“植物细胞培养物”是指植物单元的培养物，例如原生质体、可再生细胞、细胞培养物、细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、多个发育阶段的受精卵和胚、叶、根、根尖、花药、分生细胞、小孢子、花、子叶、雌蕊、果实、种子、种皮或其任何组合。
120.如本文所用，术语“植物材料”或“植物部分”是指叶、茎、根、根尖、花或花部分、果实（例如黄瓜果实，特别是如本发明所公开的修饰的黄瓜果实）、花粉、卵细胞、受精卵、种子、种皮、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物或其组合。
121.如本文所用，“植物器官”是指植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花、花蕾或胚。
122.如本文所用，术语“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物、原生质体、分生细胞、愈伤组织和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。该术语与以上列出的或本定义以其他方式所包含的任何特定类型的植物组织结合使用或在缺少以上列出的或本定义以其他方式所包含的任何特定类型的植物组织时使用不旨在排除任何其他类型的植物组织。
123.如本文所用，术语“后代（progeny）”或“后代（progenies）”以非限制性方式指代后代或子代植物。根据某些实施方案，术语“后代”或“后代”是指由尤其详细描述的所公开的或保藏的种子发育或生长或产生的植物。生长的植物优选地具有所公开或保藏的种子的期望性状，即至少一种cusp基因中的功能丧失突变。
124.术语“黄瓜”在下文中是指葫芦科（cucurbitaceae）开花植物的一个属。在本发明的某些方面，它是指黄瓜（cucumis）属内的植物物种，例如黄瓜(c. sativus)物种。
125.如本文所用，术语“驯化”或“驯化性状”是指作物或作物栽培期望的任何农艺性状。本文承认，基于野生祖先和驯化后代之间的关系，已在作物物种中选择驯化表型。
126.在普通作物的驯化过程中出现的性状之一是有限生长(determinacy)，其中茎以顶生花序结束。还在本发明的范围内的是，驯化是指人类在野生植物中进行的选择过程，以适应人类的栽培和食用。这一选择过程使作物的形态和生理发生了显著变化。在作物驯化过程中选择的性状之一是更紧凑的生长习性，表现为一系列性状，例如分枝减少、节间缩短、节数减少、缠绕减少，在一些情况下，有限生长的茎顶端。野生近缘植物一般为藤本、草
本植物，其分枝度高，节数多，节间长而缠绕，分枝向异性生长。缠绕性(vininess)让植物在其中这些野生植物自然生长的灌木或树栖植被中与周围的植物竞争光线。因此，有限生长是在驯化期间或之后选择的一种性状。因此，驯化后，一般来说，茎具有有限的长度，并且开花发生的时间早于无限生长类型。由于有限生长习性允许以较短的生长周期进行机械收获，因此具有有限生长性状的栽培品种在诸如黄瓜等几种作物品种中是优选的。
127.值得注意的是，通过其中人工选择作为强大驱动力的驯化源自其野生祖先的作物，具有修饰的作物基因组以及对人类有益的修饰的形态特征和生长习性。
128.需要强调的是，由于在育种过程中反复使用有限的变异，黄瓜作为经济上重要的蔬菜作物，其遗传基础变得异常狭窄。大多数黄瓜栽培品种具有无限生长的植物习性，其中茎不断伸长，并且具有起源于主茎的1-2个初级侧枝。一些栽培品种在一些生长条件下也会产生次生侧枝（起源于初级侧枝），这是由多基因控制的。当植物以低密度生长时会发生更多的分枝。本发明特别是通过使用基因编辑技术提供具有改良的驯化和/或农艺性状的黄瓜植物解决了这个问题。
129.本发明上下文中的术语“self-pruning”或“sp”是指编码调节合轴生长的开花阻遏物的基因。本文显示，sp 直系同源物的突变引起合轴循环加速和枝条终止（shoot termination）。进一步承认，self pruning (sp) 基因控制沿着例如番茄的复合枝条的营养-生殖开关的规律性，从而调节植物的“有限生长”(sp/sp) 和“无限生长”(sp)习性。sp 是发育调节子，其与金鱼草（antirrhinum）的centroradialis (cen)和拟南芥的 terminal flower 1 (tfl1)和flowering locus t (ft)同源。
130.本发明公开了sp是黄瓜中由至少三种基因组成的基因家族的成员。黄瓜 sp 基因包含分别由如seq. id. no: 1、89 和 167中所示基因组序列、如 seq. id. no: 2、90 和 168中所示编码序列，以及如 seq. id. no: 3、91 和 169中所示的氨基酸序列编码的cusp-1、cusp-2和cusp-3。根据本发明的主要方面，在至少一个上述cusp基因中的基因组编辑靶向突变（其降低了该基因的功能表达）影响了在决定植物构型中起关键作用的植物合轴生长习性。
131.如本文所用，术语“遗传修饰”在下文是指遗传操作或调节，其是使用生物技术直接操作生物体的基因。它还指用于改变细胞遗传组成的一组技术，包括在物种内和物种间转移基因、靶向诱变和基因组编辑技术以产生改良的生物体。根据本发明的主要实施方案，使用基因组编辑机制产生具有改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物。该技术能够实现与黄瓜植物中开花时间和植物构型相关的和/或控制其的特定基因的植物中修饰。
132.术语“基因组编辑”或“基因组/遗传修饰”或“基因组改造”或“基因编辑”在下文中通常指遗传改造的类型，其中dna在活的生物体的基因组中被插入、删除、修饰或替换。与以前将遗传物质随机插入宿主基因组的遗传改造技术不同，基因组编辑将插入靶向位点特异性位置。
133.在本发明的范围内，这种编辑的常用方法使用改造的核酸酶，或“分子剪刀”。这些核酸酶在基因组的期望位置产生位点特异性双链断裂(dsb)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接 (nhej) 或同源重组 (hr)进行修复，产生靶向突变（
‘
编辑’）。本发明使用的改造的核酸酶家族包括但不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和成簇规则间隔短回文重复序列(crispr/cas9）系统。
也在此范围内。
142.现在参考图1 ，其示意性地呈现了如xie, kabin和yinong yang. "rna-guided genome editing in plants using a crispr
–
cas system." molecular plant 6.6 (2013): 1975-1983所描述的crispr/cas9作用机制的实例。如该图所示，cas9 核酸内切酶与嵌合 rna（称为指导 rna 或 grna）形成复合物，取代 crrna-transcrrna 异源双链体，且grna 可通过编程靶向特定位点。grna-cas9 应包含在改造的grna 的 5' 端和靶向基因组位点之间没有错配的至少 15 个碱基配对（grna 种子区域）以及在靶向 dna 互补链中的碱基配对区域之后的ngg 基序（称为前间区序列邻近基序或 pam）。
143.如本文所用，术语“大范围核酸酶”在下文中是指内切脱氧核糖核酸酶，其以大识别位点（12至40个碱基对的双链dna序列）为特征；作为结果，这个位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。因此，大范围核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制酶。
144.如本文所用，术语“前间区序列邻近基序”或“pam”在下文中是指紧接在crispr细菌适应性免疫系统中cas9核酸酶靶向的dna序列之后的2-6个碱基对dna序列。pam 是入侵病毒或质粒的组分，但不是细菌 crispr 基因座的组分。pam 是重要的靶向组分，其可将细菌自身与非自身 dna 区分开来，从而防止 crispr 基因座被核酸酶靶向和破坏。
145.如本文所用，术语“下一代测序”或“ngs”在下文中指的是并行地对数百万个dna小片段进行测序的大规模、平行、高通量或深度测序技术平台。生物信息学分析用于通过将单个读数作图到参考基因组来将这些片段拼凑到一起。
146.如本文所用，术语“基因敲低”在下文中是指通过其降低一种或多种生物体基因表达的实验技术。降低可以通过遗传修饰发生，即靶向基因组编辑或通过用试剂诸如具有与基因或mrna转录物互补的序列的短dna或rna寡核苷酸进行处理。降低的表达可以在 rna 水平或在蛋白质水平。在本发明的范围内，术语基因敲低还指功能丧失突变和/或基因敲除突变，其中使生物体的基因失效或无功能。
147.如本文所用，术语“基因沉默”在下文中是指调节细胞中的基因表达以阻止某种基因的表达。基因沉默可以在转录或翻译过程中发生。在本发明的某些方面，基因沉默被认为与基因敲低具有相似的含义。当基因被沉默时，它们的表达就会降低。相反，当基因被敲除时，它们完全不表达。基因沉默可以被认为是基因敲低机制，因为用于沉默基因的方法，例如rnai、crispr或sirna ，通常会将基因的表达降低至少 70%，但不会完全消除它。
148.如本文所用，术语“功能丧失突变”是指一种突变类型，其中改变的基因产物缺乏野生型基因的功能。包括在本发明范围内的术语的同义词是无效突变。
149.术语“微小rna”或“mirna
ꢀ”
在下文中是指已在大多数真核生物中发现的小的非编码rna。它们以序列特异性方式参与转录后水平的基因表达调控。mirna 是通过 dicer 依赖的小 rna 生物发生途径从它们的前体产生的。mirna 是使用不同的基于 rna 的基因沉默技术研究基因功能的候选者。例如，针对一个或几个目的基因的人工 mirna (amirna) 是功能基因组学中的潜在工具。
150.术语“在植物中”在本发明的上下文中是指在植物或植物细胞内。更具体地，这意味着将crispr/cas复合物引入包含若干细胞的组织培养物的植物材料、整株植物或单个植物细胞中，而不引入外源基因或突变基因。它还用于描述非实验室环境（例如体内）中存在的条件。
151.如本文所用，术语“合轴生长(sympodial growth)”是指一种分叉的分支模式，其中一个分支比另一个分支发育得更强健，导致较强的分支形成初级枝条，而较弱的分支横向出现。合轴(sympodium)也称为合轴(sympode)或合轴(pseudaxis)，是在合轴生长期间形成的主要枝条，其包括更强的分枝。在本发明的一些方面，当顶端分生组织终止并且由一个或多个侧向分生组织（其重复该过程）继续生长时发生合轴生长。顶端分生组织可以被消耗以形成花序或其他确定的结构，或者它可能被中止。
152.还在本发明的范围内的是，两个连续花序之间的枝条部分被称为'合轴' ，每个合轴的叶节数被称为'合轴指数' (spi)。第一个终止事件激活'合轴循环' 。在合轴植物中，明显的主枝条由重复排列的'合轴单位'组成。突变的 sp 基因加速了合轴单位的终止，但不改变合轴习性。结果是花序之间营养节点的数量以依赖于光强度和遗传背景的模式逐渐减少。
153.术语“早熟”在下文中是指提前开花和/或从营养阶段到生殖阶段的快速转变，或减少的“开始开花的时间”，更一般地是指生命周期的较早完成。
154.如本文所用，术语“减少的开花时间”是指产生第一个花序的时间。例如，可以参考在第一个花序出现之前产生的叶子的数量来评估或测量这个性状。
155.术语“收获指数”在本文中可以定义为每株植物重量的总产量。
156.在本发明的上下文中使用的术语“日长”或“日长敏感性”通常是指光周期，它是生物体对白天或黑夜长度的生理反应。光周期也可以定义为植物对光照和黑暗周期的相对长度的发育反应。植物根据光周期分为三类：短日照植物、长日照植物和日中性植物。光周期通过诱导枝条产生花芽而不是叶子和侧芽来影响开花。黄瓜包括在短日照兼性植物中也在本发明的范围内。本发明的黄瓜植物被遗传修饰以表现出日长敏感性的丧失，这是非常需要的能够提高栽培作物产量的农艺性状。
157.如本文所用，术语“有限的”或“有限生长”是指植物生长，其中主茎以花序或其他生殖结构（例如芽）结束，并停止持续无限伸长，而只有来自主茎的分枝具有进一步且类似被限制的增长。它也指以从中央或最上部芽到侧芽或基部芽连续开花为特征的生长。它进一步意味着天然自我限制的生长，导致植物具有确定的最大尺寸。
158.如本文所用，术语“无限的”或“无限生长”是指植物的生长，其中主茎持续无限伸长而不受顶生花序或其他生殖结构的限制。它也指以从侧芽或基部芽到中央或最上部芽连续开花为特征的生长。
159.如本文所用，术语“直系同源物”在下文是指在不同物种中发现的两种或更多种同源基因序列之一。
160.如本文所用，例如参考seq id no:1、4或7，术语“功能变体”或“核酸或氨基酸序列的功能变体”是指序列的变体或序列的一部分，其保留完整的非变体等位基因（例如cusp等位基因）的生物学功能，因此具有sp表达基因或蛋白质的活性。功能变体还包括编码多肽的目的基因的变体，所述多肽例如在非保守残基中具有不影响所得蛋白质功能的序列改变。还包括这样的变体，其与本文所示等位基因的野生型核酸或氨基酸序列基本相同（即仅具有一些序列变异，例如在非保守残基中）并且具有生物活性。
161.如本文所用，术语“品种”或“栽培品种”是指通过结构特征和性能可以从同一物种内的其他品种中鉴定的一组相似植物。
162.如本文所用，术语“等位基因”是指特定基因座处基因或遗传单元的一种或多种备选或变体形式中的任何一种，所有这些等位基因与具体基因座处的一种性状或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的一个特定位置或基因座（多个基因座）。等位基因的备选或变体形式可能是单核苷酸多态性、插入、倒位、易位或缺失的结果，或者是由例如化学或结构修饰、转录调控或翻译后修饰/调控引起的基因调控的结果。与质量性状相关的等位基因可以包含多种遗传单位的备选或变体形式，包括与单个基因或多个基因或其产物、或甚至破坏促成由基因座所代表的表型的遗传因素或由其控制的基因相同或相关的那些。根据进一步的实施方案，术语“等位基因”指特定基因座处基因的一种或多种备选形式中的任何一种。杂合等位基因是同一基因座上的两个不同等位基因。纯合等位基因是特定基因座处的两个相同等位基因。野生型等位基因是天然存在的等位基因。在本发明的上下文中，术语等位基因是指黄瓜中三种已鉴定的sp基因，即cusp-1、cusp-2和cusp-3，其分别具有如seq id no:1、89和167所示的基因组核苷酸序列。
163.如本文所用，术语“基因座”(多个基因座)是指染色体上的一个或多个特定位置或区域或位点，其中例如发现基因或遗传标记元件或因子。在具体实施方案中，这样的遗传元件有助于性状。
164.如本文所用，术语“纯合的”是指当两个相同或相似的等位基因位于具体基因座，但分别位于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传状况或构型。
165.在具体实施方案中，本发明的黄瓜植物包含至少一种突变的cusp基因(即cusp-1、cusp-2和cusp-3)的纯合构型。
166.相反，如本文所用，术语“杂合的”是指当两个不同或不相似的等位基因位于具体基因座，但分别位于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传状况或构型。
167.如本文所用，短语“遗传标记”或“分子标记”或“生物标记”是指个体基因组中的特征，例如与一个或多个基因座或目的性状相关的核苷酸或多核苷酸序列。 在一些实施方案中，遗传标记在目的群体中是多态的，或者基因座被多态性占据，这取决于上下文。遗传标记或分子标记包括例如单核苷酸多态性(snp)、插入缺失(即插入缺失)、简单序列重复(ssr)、限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rafd)、切割扩增多态性序列 (caps) 标志物、多样性阵列技术 (dart) 标志物和扩增片段长度多态性 (aflp) 或其组合，以及许多其他实例，例如 dna 序列本身。例如，遗传标记可用于定位染色体上含有等位基因的遗传基因座，这些等位基因有助于表型性状的变异性。短语“遗传标记”或“分子标记”或“生物标记”还可以指与基因组序列互补或对应的多核苷酸序列，例如用作探针或引物的核酸序列。
168.如本文所用，术语“种质”是指群体或其他个体群体（例如，物种）的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，作为多种等位基因储存库的一组植物。此类种质基因型或种群包括已证明具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，以及遗传价值未知或未经证实的植物材料；其不属于已建立的育种种群的一部分，并且与已建立的育种种群的成员没有已知的关系。
169.如本文所用，术语“杂合体”、“杂合植物”和“杂合后代”是指从遗传上不同的亲本产生的个体（例如遗传上杂合的或大部分杂合的个体）。
170.如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的"序列同一性"或"同一性"指代当在具体比较窗口内针对最大对应性进行比对时相同的两个序列中的残基。 当就蛋白而言使用序列同一性百分比时，认识到不同的残基位置经常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被取代为具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。该术语在下文中进一步指的是在两个不同序列之间完全匹配的字符的数量。因此，不计算空位，并且测量结果与两个序列中较短的序列有关。
171.进一步在所述范围内的是，术语“相似性”和“同一性”还指局部同源性，鉴定同源或相似的结构域（在核苷酸和/或氨基酸序列中）。公认的是，诸如 blast、ssearch、fasta 和 hmmer 等生物信息学工具计算局部序列比对，其鉴定两个序列之间最相似的区域。对于在不同蛋白质的不同序列背景中发现的结构域，比对应限于同源结构域，因为结构域同源性提供了得分中捕获的序列相似性。根据一些方面，术语相似性或同一性进一步包括序列基序，其是广泛存在的并且具有或推测具有生物学意义的核苷酸或氨基酸序列模式。蛋白质可以具有序列基序和/或结构基序，由可能不相邻的氨基酸的三维排列形成的基序。
172.如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括dna分子（例如，cdna或基因组dna）、rna分子（例如， mrna)、天然存在的、突变的、合成的 dna 或 rna 分子，以及使用核苷酸类似物产生的 dna 或 rna 的类似物。它可以是单链的或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mrna或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语还包括基因。术语“基因”、“等位基因”或“基因序列”广泛用于指与生物学功能相关的dna核酸。因此，基因可包括基因组序列中的内含子和外显子，或可仅包括如cdna中的编码序列，和/或可包括与调控序列组合的cdna。因此，根据本发明的多个方面，可以使用基因组dna、cdna或编码dna。在一个实施方案中，核酸是cdna或编码dna。
173.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。
174.根据本发明的其他方面，“修饰的”或“突变体”植物是与天然存在的野生型(wt)植物相比已经改变的植物。具体而言，使用如本文所述的诱变和/或基因组编辑方法，与野生型序列相比，黄瓜中每个sp同源物的内源核酸序列（核酸序列cusp-1、cusp-2和cusp-3）已经改变。这引起内源性 sp 基因失活，从而使sp 失去功能。与野生型植物相比，此类植物具有改变的表型并显示出改良的驯化性状，例如决定性植物构型、同步和/或早期开花以及日长敏感性的丧失。因此，改良的驯化表型是由已使用基因组编辑技术进行了特异性靶向的黄瓜植物基因组中至少一种突变的内源cusp基因的存在赋予的。
175.根据本发明的其他方面，至少一种改良的驯化性状不是由黄瓜中表达的转基因的存在赋予的。
176.进一步在本发明的范围内的是，下调或破坏野生型sp序列的功能表达的sp突变可以是隐性的，使得它们由野生型序列的表达补充。
177.进一步注意，野生型黄瓜植物是不具有任何突变体sp等位基因的植物。
178.本发明的主要方面涉及靶向诱变方法，特别是基因组编辑，并且排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。在本发明的其他实施方案中，如本文所解释的，改良的驯化至少一个性状不是由于转基因的存在。
179.发明人已经产生了具有使至少一种cusp同源等位基因(homoeoallele)失活的突变（其赋予可遗传的改良的驯化性状）的突变体黄瓜株系。以这种方式，没有产生功能性 cusp 蛋白。因此，本发明涉及这些突变体黄瓜株系和相关方法。
180.进一步在本发明的范围内的是，培育具有突变的sp等位基因的黄瓜栽培品种能够实现植物的机械收获。根据本发明的其他方面，sp功能的丧失导致与wt黄瓜相比具有降低的高度、减少的合轴单元数量和有限生长的紧凑黄瓜植物。
181.根据本发明的主要方面，通过选择成花素开花途径基因中的突变来修饰黄瓜枝条构型允许植物构型和产量的重大改良。特别是，抗成花素selfpruning (sp) 基因 (经典sp) 中的突变提供了紧凑的“有限”生长，其转化为开花的爆发，从而实现了大规模的田间生产。
182.尤其是，所描述的工作具有重要意义。结果已经显示，crispr/cas9 可用于在成花素途径家族成员中产生可遗传的突变，其产生期望的表型效应。
183.为了同时编辑多个驯化基因并堆叠产生的等位基因变体，一个选项是通过使用 csy4 多 grna 系统将若干个 grna组装到一个构建体中以编辑若干个基因。然后通过适当的载体将该构建体转化到若干种野生黄瓜种质资源中。
184.进一步在本发明的范围内的是，使用指导rna靶向黄瓜sp基因，即cusp-1、cusp-2和cusp-3，其分别具有如seq. id. no: 1、89和167所示的基因组核苷酸序列、如 seq. id. no: 2、90 和 168所示的编码序列，以及如 seq. id. no: 3、91 和 169 所示的氨基酸序列。已经鉴定了若干个突变的等位基因。值得注意的是，具有突变 sp 等位基因的植物比缺乏突变等位基因的野生型植物更加紧凑。
185.功能缺失突变可以是参照野生型cusp等位基因序列的缺失或插入（“插入缺失”）。缺失可包含在一条或多条链中1-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个核苷酸或更多个。插入可以包含在一条或多条链中1-20个或更多个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个或更多个核苷酸。
186.本发明的植物包括其中该植物对于每个突变是杂合的植物。然而，在优选的实施方案中，植物对于突变是纯合的。根据本领域已知的方法，可以从这些植物中产生也是纯合的后代。
187.进一步在所述范围内的是，根据本发明多个方面的特定cusp核苷酸或氨基酸序列的变体将与如seq id no 1、89或167所示的cusp等位基因的特定非变体cusp核苷酸序列具有至少约50%-99%，例如至少75%，例如至少85%、 86%、87%、88%、89%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更高的序列同一性。确定序列同一性的序列比对程序是本领域众所周知的。
188.同样，本发明的多个方面不仅包括cusp核酸序列或氨基酸序列，还包括其片段。“片段”意指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及由此编码的蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性（在这种情况下是改良的驯化性状）的蛋白质片段。
189.根据本发明的进一步实施方案，本文新鉴定的黄瓜sp(cusp)已使用双sgrna策略进行了靶向。
190.根据本发明的进一步实施方案，可以通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和dna的机械插入(peg介导的dna转化、基因枪法等)完成将dna引入植物细胞。
191.此外，在本发明的范围内的是，将cas9蛋白与grna（核糖核蛋白-rnp's）一起直接插入，以绕过cas9 grna质粒在植物中体内转录和翻译的需要，来实现基因编辑。
192.也可以创建基因组编辑植物并将其用作砧木（rootstock）。然后，cas 蛋白和 grna 可以通过脉管系统运输到植物顶部，并在接穗（scion）中产生基因组编辑事件。
193.在本发明的范围内，使用crispr/cas系统产生具有至少一种改良的驯化性状的黄瓜植物，允许在不通过gmo技术将外源dna引入基因组的情况下修饰预定的特定dna序列。根据本发明的一个实施方案，这通过将cas核酸酶(例如cas9、cpf1等)与预定义的指导rna分子(grna)组合来实现。grna 与植物基因组中靶向编辑的具体 dna 序列互补，并且其将 cas 核酸酶引导至具体核苷酸序列（例如参见图 1）。将预定义的基因特异性 grna 克隆到与 cas 基因相同的质粒中，并将该质粒插入植物细胞中。上述质粒dna的插入可以但不限于使用不同的递送系统、生物的和/或机械的，例如农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和dna的机械插入（peg介导的dna转化，基因枪法等)来完成。
194.进一步在本发明的范围内的是，当到达具体的预定dna序列时，cas9核酸酶切割两条dna链以产生双链断裂，留下平末端。然后通过细胞非同源末端连接 dna 修复机制修复该切割位点，导致插入或缺失，其最终在切割位点处产生突变。例如，公认的是突变的缺失形式由至少 1 个碱基对缺失组成。由于这种碱基对缺失，基因编码序列被破坏，并且编码蛋白质的翻译受到过早终止密码子或蛋白质功能或结构特性破坏的损害。因此 dna 被 cas9 蛋白切割并通过细胞的 dna 修复机制重新组装。
195.进一步在范围内的是，在本文中通过以下产生黄瓜植物中的改良的驯化性状：产生与黄瓜基因组中预定基因即sp基因的具体位点具有同源性的grna，将该grna亚克隆到含有cas9基因的质粒中，并将质粒插入黄瓜植物细胞中。以这种方式产生sp 基因中的位点特异性突变，因此有效地产生非活性分子，导致基因组编辑植物的有限生长习性。
196.根据一个实施方案，本发明提供了表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物，其中所述修饰的植物包含至少一种遗传修饰，该遗传修饰赋予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
197.根据本发明的另一个实施方案，cusp基因选自具有如seq id no:1所示基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如seq id no:89所示基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如seq id no:167所示基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
198.根据本发明的另一个实施方案，功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
199.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
200.根据本发明的另一个实施方案，使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合来引入遗传修饰。
201.根据本发明的另一个实施方案，修饰的黄瓜植物包含使用靶向基因组修饰在所述
至少一个cusp基因中引入的至少一种遗传修饰。
202.根据本发明的另一个实施方案，使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关(cas)基因(crispr/cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指状核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入遗传修饰。
203.根据本发明的另一个实施方案，所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
204.根据本发明的另一个实施方案，遗传修饰的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因。
205.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
206.根据本发明的另一个实施方案，插入或缺失产生包含移码的基因。
207.根据本发明的另一个实施方案，所述植物对于所述至少一种遗传修饰的cusp基因是纯合的。
208.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
209.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
210.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰在植物中产生。
211.根据本发明的另一个实施方案，所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
212.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-1中的所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白选自 seq id no: 4-88的和 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
213.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
214.根据本发明的另一个实施方案，所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170-seq id no:255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
215.根据本发明的另一个实施方案，所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序 （pam）。
216.根据本发明的另一个实施方案，所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
217.根据本发明的另一个实施方案，所述植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
218.根据本发明的另一个实施方案，所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
219.根据本发明的另一个实施方案，所述植物是半有限生长的。
220.根据本发明的另一个实施方案，所述植物具有有限生长习性。
221.根据本发明的另一个实施方案，所述植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
222.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出改进的早熟。
223.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出抑制的合轴苗终止。
224.根据本发明的另一个实施方案，与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述植物表现出相似的合轴苗终止。
225.根据本发明的另一个实施方案，所述驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
226.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
227.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子包含至少一种遗传修饰，其赋予至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的降低表达。
228.进一步在本发明的范围内公开从如上述任一项所定义的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
229.根据本发明的另一个实施方案，所述修饰的植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
230.根据另一个实施方案，本发明提供用于产生表现出至少一种改良的驯化性状的修饰的黄瓜植物的方法，其中所述方法包括遗传修饰至少一种黄瓜self pruning (sp)(cusp)基因的步骤。
231.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其包括使用靶向基因组修饰通过在所述至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因中遗传引入功能丧失突变来产生修饰黄瓜植物的步骤。
232.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰赋
予至少一种黄瓜self pruning (sp) (cusp)基因的降低表达。
233.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的黄瓜植物表现出至少一种改良的驯化性状。
234.进一步在本发明的范围内公开上述任一项所定义的方法，其中所述方法包括以下步骤： (a)鉴定至少一种黄瓜sp (cusp)基因或等位基因； (b)合成至少一种指导rna(grna)，其包含与所述至少一种鉴定的cusp等位基因互补的核苷酸序列； (c)用构建体转化黄瓜植物细胞，该构建体包含(a)可操作地连接至所述至少一种grna的cas核苷酸序列，或(b)包含cas蛋白和所述至少一种grna的核糖核蛋白(rnp)复合物；(d) 针对至少一种所述cusp等位基因或基因中诱导的靶向功能丧失突变筛选所述转化植物细胞的基因组；(e)再生黄瓜植物，其在至少一种所述cusp等位基因或基因中携带所述功能丧失突变；和 (f) 针对具有改良的驯化性状的黄瓜植物筛选所述再生植物。
235.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中针对诱导的靶向功能丧失突变筛选所述转化植物细胞的基因组的所述步骤进一步包括以下步骤：获得所述转化的植物的核酸样品，并进行核酸扩增和任选地限制性内切酶消化以检测所述cusp等位基因或基因中的所述至少一种中的突变。
236.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp黄瓜基因选自具有如seq id no:1所示的基因组核苷酸序列的cusp-1或其功能变体或同源物，具有如 seq id no: 89 所示的基因组核苷酸序列的cusp-2或其功能变体或同源物，具有如 seq id no:167 所示的基因组核苷酸序列的cusp-3或其功能变体或同源物及其任何组合。
237.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述功能变体或同源物与所述cusp核苷酸序列具有至少75％的序列同一性。
238.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用诱变、小干扰rna (sirna)、微小rna (mirna)、人工mirna (amirna)、dna渗入、核酸内切酶或其任何组合引入的。
239.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用靶向基因编辑引入的。
240.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是使用crispr (成簇规则间隔短回文重复序列)和crispr相关（cas）基因（crispr/ cas)、转录激活因子样效应物核酸酶 (talen)、锌指核酸酶 (zfn)、大范围核酸酶或其任何组合引入的。
241.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cas基因选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或 casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casy、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1 (或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，噬菌体cas如casφ (cas-phi)及其任何组合。
242.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中突变的cusp基因是crispr/cas9诱导的可遗传突变的等位基因或基因。
243.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是错义突变、无义突变、插入、缺失、插入缺失、取代或重复。
244.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中插入或缺失产生包含移码的基因。
245.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物对于所述至少一种cusp突变基因是纯合的。
246.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在所述基因的编码区中、是所述基因调控区的突变、或是表观遗传因子。
247.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
248.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰在植物中产生。
249.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述遗传修饰通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88、92-166、170-255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88、92-166、170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
250.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-1中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 4-88的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no: 4-88的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
251.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-2中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含cas蛋白和选自 seq id no: 92-166的grna序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
252.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述cusp-3中的所述突变通过引入包含以下的构建体在植物中产生：(a) cas dna和选自seq id no:170
‑ꢀ
255的grna序列及其任何组合，或 (b) 包含 cas 蛋白和选自 seq id no:170-255的 grna 序列及其任何组合的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。
253.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述grna序列包含3' ngg 前间区序列邻近基序（pam）。
254.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述构建体通过农杆菌浸润、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒或机械插入，例如聚乙二醇 (peg)介导的 dna 转化、电穿孔或基因枪轰击引入植物细胞中。
255.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有至少一种所述cusp基因的降低的表达水平。
256.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述表达的cusp基因的序列选自：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:168 和 seq id no:169 或其功能变体或同源物。
257.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物
是半有限生长的。
258.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物具有有限生长习性。
259.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述修饰的植物比缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物更早开花。
260.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出改进的早熟。
261.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出抑制的合轴苗终止。
262.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应黄瓜植物相比，所述修饰的植物表现出相似的合轴苗终止。
263.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中与缺乏所述遗传修饰的相应的黄瓜植物相比，所述修饰的植物展示出抑制的或降低的日长敏感性。
264.进一步在本发明的范围内公开通过如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物、植物部分、植物果实或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。
265.进一步在本发明的范围内公开通过如上述任一项所定义的方法产生的植物的植物部分、植物细胞、植物果实或植物种子。
266.进一步在本发明的范围内公开从如上述任一项所定义的方法产生的修饰的黄瓜植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
267.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述植物基因型可通过在ncimb aberdeen ab21 9ya，scotland，uk或atcc的登录号下的保藏物而获得。
268.进一步在本发明的范围内公开如上述任一项所定义的方法，其中所述至少一种驯化性状选自开花时间缩短、早熟、同步开花、日长敏感性降低、有限生长或半有限生长构型、合轴循环提前终止、腋芽开花较早、生长习性紧凑、高度降低、合轴单元数减少、适应机械收获、更高的收获指数及其任何组合。
269.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:1、seq id no:89和seq id no:167的cusp基因组核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
270.根据本发明的另一个实施方案，分离的核苷酸序列与选自seq id no:2、seq id no:90和seq id no:168的cusp核苷酸编码序列具有至少75%序列同一性。
271.根据另一个实施方案，本发明提供与选自seq id no:3、seq id no:91和seq id no:169的cusp氨基酸序列具有至少75％序列相似性的分离的氨基酸序列。
272.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88、92-166和170-255所示的靶向cusp的grna核苷酸序列具有至少75％序列同一性的分离的核苷酸序列。
273.根据另一个实施方案，本发明提供与如seq id no:4-88的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-1(cusp-1) 等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
274.进一步在本发明的范围内公开与如seq id no:92-166的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-2(cusp-2)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
275.进一步在本发明的范围内公开与如seq id no:170-255的至少一个中所示的核酸序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列及其任何组合用于黄瓜sp-3(cusp-3)等位基因或基因的靶向基因组修饰的用途。
276.为了理解本发明并了解其如何在实践中实施，现在将参考以下实施例，仅通过非限制性实例的方式描述多个优选实施方案。
277.实施例1通过靶向基因编辑产生具有改良的驯化性状的黄瓜植物具有突变 sp 基因的黄瓜株系的产生可以通过以下育种/栽培方案中的至少一种来实现：方案1：
· 通过自花授粉的品系稳定
· f6亲本系的产生
· 亲本系的基因组编辑
· 交叉编辑的亲本系以生成 f1 杂合植物。
278.方案2：
· 鉴定目的基因/等位基因
· 设计 grna
· 用 cas9 grna 构建体转化植物
· 筛选和鉴定编辑事件
· 亲本系的基因组编辑注意，品系稳定可以通过以下方式执行：
· 诱导植物雄性开花
· 自花授粉。
279.根据本发明的一些实施方案，品系稳定需要大约6次自交（6代）并通过单种子下降（ssd）方法完成。
280.f1杂合种子产生：新杂合体是通过不同黄瓜品系之间的杂交产生的。
281.根据本发明的另一方面，通过加倍单倍体(dh)进行缩短品系稳定。更具体地说，将crispr-cas9系统转化到小孢子中以获得dh纯合亲本系。加倍单倍体 (dh) 是单倍体细胞进行染色体加倍时形成的基因型。人工产生加倍单倍体在植物育种中很重要。本文承认，传统的近亲育种过程需要大约六代才能达到大约完全的纯合性，而加倍单倍体在一代内就可以实现。
282.在本发明的范围内，本发明开发并提供了对黄瓜具有特异性的遗传标记：
· 基因分型标记-本发明中使用的种质使用分子标记进行基因分型，以允许更有效的育种过程和sp编辑事件的鉴定。
283.分析所用黄瓜品系的等位基因和遗传变异也在本发明的范围内。
284.现在参考已用于通过基因组编辑产生突变的sp黄瓜植物的可选阶段：第 1 阶段：鉴定黄瓜( c. sativus ) sp 基因 (cusp)。
285.本文已在黄瓜( c. sativus ) 中鉴定出三种 sp 直系同源物，即 cusp-1、cusp-2 和 cusp-3。这些同源基因已被测序和作图定位。
286.cusp-1 已被定位到 csgy3g032260:29750603-29747435 [chr3, csgy3g032260 (基因) 黄瓜 (gy14) v2] 并具有如 seq id no: 1 所示的基因组序列。cusp-1基因具有如seq id no:2所示的编码序列并且其编码如seq id no:3所示的氨基酸序列。
[0287]
cusp-2 已被定位到 csgy6g024900:21554140-21555525 [chr6, csgy6g024900 (基因) 黄瓜(gy14) v2] 并具有如 seq id no:89 所示的基因组序列。cusp-2基因具有如seq id no:90所示的编码序列，并且其编码如seq id no:91所示的氨基酸序列。
[0288]
cusp-3 已被定位到 csgy6g012560:10805149-10806778 [chr6, csgy6g012560 (基因) 黄瓜(gy14) v2] 并具有如 seq id no: 167 所示的基因组序列。cusp-3基因具有如seq id no:168所示的编码序列，并且其编码如seq id no:169所示的氨基酸序列。
[0289]
第2阶段：设计和合成对应于靶向编辑的序列，即基因cusp-1、cusp-2和cusp-3中的每一个的序列的grna分子。注意，编辑事件优选地靶向独特的限制性位点序列，以允许更容易地筛选在其基因组内携带编辑事件的植物。根据本发明的一些方面，grna的核苷酸序列应该与靶基因的基因组序列完全相容。因此，例如，应该为不同的 sp 同源物或等位基因以及不同的黄瓜品系构建合适的 grna 分子。
[0290]
将设计的 grna 分子克隆到合适的载体中，并已经验证了它们的序列。此外，已经分析了在黄瓜植物中不同的 cas9 版本在cas9 蛋白活性与grna 分子之间的最佳相容性。
[0291]
现在参考表1-3，其分别呈现了为沉默cusp-1、cusp-2和cusp-3基因而构建的grna序列。术语“pam”在下文中是指前间区序列邻近基序，它是紧随 crispr 细菌适应性免疫系统中 cas9 核酸酶靶向的 dna 序列的 2-6 个碱基对 dna 序列。基因组dna有义链标记为“1”，且反义链标记为
“‑
1”。
[0292]
表 1：靶向cusp-1 的 grna 和 pam 序列
[0293]
表 2：靶向 cusp-2 的 grna 和 pam 序列
[0294]
表 3：靶向 cusp-3 的 grna 和 pam 序列
[0295]
参考表4，其呈现了本发明范围内的序列概述。
[0296]
表4：本发明范围内的序列概述
。
[0297]
上述 grna 分子已被克隆到合适的载体中，并且其序列已得到验证。此外，已经分析了黄瓜植物中不同的 cas9 版本在cas9 蛋白活性与grna 分子之间的最佳相容性。
[0298]
已通过瞬时转化黄瓜组织培养物验证了设计的 grna 分子的效率。携带 grna 序列和 cas9 基因的质粒已被转化到黄瓜原生质体中。原生质体细胞已经生长了很短的时间，然后分析基因组编辑事件的存在。阳性构建体已经经受本文建立的稳定转化方案进入黄瓜植物组织，用于在sp基因中产生基因组编辑的黄瓜植物。
[0299]
第 3 阶段：使用农杆菌或基因枪（基因枪）方法转化黄瓜植物。对于农杆菌和基因枪，可以使用携带（cas9 基因特异性 grna）的 dna 质粒。构建了含有选择标志物、cas9 基因和相关基因特异性grna’s 的载体。对于基因枪，使用携带（cas9 蛋白 基因特异性 grna）的核糖核蛋白 (rnp) 复合物。rnp 复合物是通过将 cas9 蛋白与相关基因特异性 grna’s混合而产生的。
[0300]
根据本发明的一些实施方案，多种黄瓜组织的转化使用以下的粒子轰击进行：
· dna 载体
· 核糖核蛋白复合物 (rnp’s))。
[0301]
根据本发明的进一步实施方案，多种黄瓜组织的转化使用农杆菌(agrobacterium tumefaciens )通过以下方式进行：
· 基于再生的转化
· 浸花转化
· 幼苗转化。
[0302]
通过瞬时 gus 转化实验，将农杆菌的转化效率与轰击法进行了比较。转化后，进行转化体的gus 染色。
[0303]
现在参考图2，其以照片方式呈现再生的转化黄瓜组织。黄瓜种子在黑暗中发芽 3 天，然后切下子叶并置于再生培养基上。切下后两到三周，再生的黄瓜幼苗开始出现在子叶切割部位（标有红色*）。
editing". nature plants 4 (2018): 766
–
770.xie kabin和yinong yang. "rna-guided genome editing in plants using a crispr
–
cas system". molecular plant 6 (2013): 1975-1983。
再多了解一些
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