微生物识别用标记的确定方法与流程

1.本发明涉及用于微生物的识别的标记的确定方法。更详细而言，本发明涉及利用质量分析来确定用于识别微生物的标记的方法。


背景技术：

2.以往，作为识别微生物的种类的方法之一，广泛使用基于dna碱基序列的相似性解析。在利用了这样的dna碱基序列的方法中，从识别对象微生物提取dna、决定dna碱基序列等需要比较长的时间。
3.然而，在罹患引起各种疾病的细菌的情况下，迅速且准确地确定该细菌对于患者的治愈和二次感染的预防是极其重要的。因此，要求迅速且准确的细菌分析方法。
4.因此，近年来，使用基于对识别对象微生物进行质量分析而得到的质谱图案来进行微生物鉴定的方法。根据质量分析，能够使用极微量的微生物试样在短时间内得到分析结果，且也容易进行多被检体的连续分析，因此能够简便且迅速地进行微生物鉴定。特别是，从尽可能不分解蛋白质等生物体高分子地进行离子化的软离子化法被实用化以来，质量分析被广泛应用于微生物的分析。
5.在软离子化法中，近年来，使用被称为基质辅助激光解吸离子化质量分析(以下，有时称为maldi-ms)的离子化法的质量分析作为微生物的分析手段受到关注。将通过maldi-ms得到的质谱图案与预先在数据库中大量收录的已知微生物的质谱图案进行比对，由此进行识别对象微生物的鉴定。这样的方法将质谱图案用作对于各微生物而言为特异性的信息(即指纹)，因此被称为指纹(fingerprint)法。
6.在使用maldi-ms的微生物鉴定中，作为直至种(species)的分析已知有指纹法，在一部分临床领域中被实用化。另一方面，对于直至亚种或血清型的分析，例如在专利文献1中报告了使用核糖体蛋白质等作为标记的方法。在专利文献1的方法中，将预先实测的质谱的检测峰信息(m/z值等)与分析对象物的实测数据进行比对，根据有无归属于标记的特定的m/z值的峰来进行微生物的识别。
7.在专利文献2中记载有如下方法：在由多个数据构成的多个组中，对各组的数据进行比较来进行差异解析，搜索用于识别各组的标记。
8.进而，还得到使用上述专利文献1或2的方法确定标记并识别微生物的结果。
9.例如，关于沙门氏菌属的肠道沙门氏菌肠道亚种(salmonella enterica subsp.enterica)，报告了通过基于指纹法的方法进行直到种的鉴定，使用12种标记进行血清型的识别的方法(专利文献3、非专利文献1)。
10.根据非专利文献1，通过专利文献1的方法，将m/z值等预先实测的质谱的检测峰信息与实际数据进行比对，由此首先确定识别对象微生物为沙门氏菌属。接着，对按每个血清型分组的多个菌株的数据进行比较，确定用于识别各血清型的标记。报告了通过这样的方法确定12种血清型识别标记作为沙门氏菌的血清型识别标记，能够利用这些标记识别22种血清型。
11.现有技术文献
12.专利文献
13.专利文献1：日本特开2015-184020号公报
14.专利文献2：日本特开2018-505063号公报
15.专利文献3：wo2017/168740公报
16.非专利文献
17.非专利文献1：《应用微生物学与生物技术(applied microbiology and biotechnology)》，2017，vol.101，no.23-24，pp.8557-8569.


技术实现要素：

18.发明要解决的技术问题
19.已知微生物即使属于同一属，也被细致地分类为种、亚种、血清型以及株等，各自的性质不同。例如在上述沙门氏菌属的情况下，种有肠道沙门氏菌(enterica)与邦戈尔沙门氏菌(bongori)这2种菌种、或者在它们中加入地下沙门氏菌(subterranea)而得到的3种菌种，肠道沙门氏菌(enterica)中有6种亚种。进而，每个亚种有不同的血清型、株，例如据说在作为亚种的肠道亚种(enterica)中存在2000种以上的血清型。
20.此外，根据微生物的不同，存在对人具有致病性与不具有致病性的情况，血清型分别具有生物学上不同的性质。因此需要通过简便且迅速的方法来识别微生物的亚种、血清型、株。
21.微生物中存在大量的血清型、株，因此不容易对它们的全部进行分析。且在对人具有致病性的微生物的分析中，从检查者的安全性的观点出发，尽可能地抑制实测次数也是至关重要的。进而，能够购买到的试样的种类也有限。因此，如上述方法那样仅基于实测数据进行标记搜索存在极限。因此，目前为止报告的标记数目有限，能够通过标记来识别的种、亚种、血清型也有限。
22.此外，在血清型、株的数量庞大的微生物的情况下，能够用于识别的实测数据也较少，实测数据的数据库化也尚未充分完善。
23.因此，期望基于尽可能少的实测数据来确定用于识别微生物的标记的方法。
24.用于解决上述技术问题的方案
25.本发明人等根据通过质量分析法得到的分析结果与可获得的公共的基因信息，研究能够对识别对象微生物的属、种、亚种、血清型进行识别的标记的搜索方法，发现了基于尽可能少的实测数据来确定标记的方法，从而完成了本发明。
26.即本发明涉及包括下述步骤1～8的微生物识别用标记的确定方法。
27.步骤1：选定全基因组已被破译的微生物。
28.步骤2：对在上述步骤1中选定的微生物所具有的蛋白质进行质量分析，得到蛋白质的分子量相关离子峰。
29.步骤3：根据在上述步骤2中得到的分子量相关离子峰得到各峰的实测m/z值。
30.步骤4：对于在上述步骤1中选定的微生物，通过基因数据库得到该微生物所具有的蛋白质及其氨基酸序列信息，根据该氨基酸序列信息计算该蛋白质的理论m/z值。
31.步骤5：对在步骤4中计算出的理论m/z值与在上述步骤3中得到的实测m/z值进行
比较，将实测m/z值归属于具有与实测m/z值一致的理论m/z值的蛋白质及其氨基酸序列。
32.步骤6：从数据库中获得与在上述步骤5中归属的蛋白质类似的氨基酸序列。
33.步骤7：根据识别分类从具有在上述步骤6中获得的类似的氨基酸序列的微生物中筛选微生物，计算该微生物所具有的蛋白质的氨基酸序列的理论m/z值。
34.步骤8：按每个识别分类对在步骤7中计算出的氨基酸序列的理论m/z值进行比较，将具有在每个所识别的分类中存在差异的理论m/z值的蛋白质确定为用于识别的标记。
35.发明效果
36.根据本发明，能够基于较少的实测数据来确定用于识别微生物的标记，例如在沙门氏菌中，除了在非专利文献1中确定的标记以外，新确定了26种标记。
附图说明
37.图1是示出本发明的用于识别微生物的标记的确定方法的流程图。
38.图2是肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)与鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)中的通过本发明的方法确定的标记之一的chab的质谱。
具体实施方式
39.以下，对本发明的用于识别微生物的标记的确定方法进行说明。
40.如上所述，微生物即使属于相同的属以及种，也可进一步分类为大量亚种、血清型、株。此外，根据种、亚种、血清型的不同，有时对人体具有毒性，且有效的治疗药也不同。因此，通过简便且迅速的方法识别微生物是至关重要的。作为在本发明中成为识别对象的微生物，主要包含细菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、真菌等，例如可例举沙门氏菌、大肠杆菌等，但并不限定于此。
41.标记通常是指用于识别归属于某一组的不同的各要素的、各要素所特有的特征。在微生物的情况下，例如使用在每个不同的属、属于同一属的不同的种、或属于同一种的不同的亚种、血清型或株中氨基酸序列的一部分不同的蛋白质等作为标记。
42.在本发明中，着眼于微生物所具有的蛋白质，基于识别对象的微生物所共通的遗传信息(基因组信息)，确定能够识别属、种、亚种、血清型或株的蛋白质。所确定的蛋白质能够用作用于识别作为识别对象的微生物的标记。并且，所确定的标记不一定必须是识别亚种、血清型或株的标记，也可以是根据目的仅识别属、或仅识别种的标记。
43.作为标记使用的蛋白质只要是微生物所具有的蛋白质即可，例如优选使用微生物的细胞内的蛋白质作为标记。作为细胞内的蛋白质，可例举核糖体蛋白质等，但并不限定于此。
44.在标记的确定中使用质量分析法。优选使用采用了特别是尽可能不分解高分子而进行离子化的软离子化法的maldi-ms。在标记的确定中，使用通过质量分析测量而得的质子附加于中性分子的蛋白质m的分子(以下，有时称为[m h]

)等的分子量相关离子峰的数据。此时，作为蛋白质的m/z的值，期望使用通过将各蛋白质的碱基序列翻译成氨基酸序列而求出的计算质量。进而，在根据所述氨基酸序列求出计算质量时，期望考虑切断n-末端甲硫氨酸残基作为翻译后修饰。具体而言，在倒数第2个氨基酸残基为gly、ala、ser、pro、val、thr或cys的情况下，设为n-末端甲硫氨酸被切断而计算理论值。
[0045]
本发明的微生物识别用标记的确定方法如图1的流程图所示，按照以下的工序进行。
[0046]
步骤1：从识别对象微生物中选定全基因组已被破译的微生物。
[0047]
步骤2：对在上述步骤1中选定的微生物所具有的蛋白质进行质量分析，得到蛋白质的基于氨基酸序列的[m h]

等分子量相关离子的峰(以下，有时称为分子量相关离子峰)。
[0048]
步骤3：根据在上述步骤2中得到的分子量相关离子峰得到各峰的m/z值作为实测的值(以下，有时也称为实测m/z值)。
[0049]
步骤4：对于在上述步骤1中选定的微生物，通过基因数据库得到该微生物所具有的蛋白质与氨基酸序列，根据该氨基酸序列信息计算该蛋白质的m/z值的理论值(以下，有时称为理论m/z值)。
[0050]
步骤5：对在上述步骤4中计算出的理论m/z值与在上述步骤3中得到的实测m/z值进行比较，将实测m/z值归属于具有与实测m/z值一致的理论m/z值的蛋白质及其氨基酸序列。
[0051]
步骤6：从数据库中获得与在上述步骤5中归属的蛋白质类似的氨基酸序列。
[0052]
步骤7：根据识别分类从具有在上述步骤6中获得的类似的氨基酸序列的微生物中筛选微生物，计算该微生物所具有的蛋白质的氨基酸序列的理论m/z值。
[0053]
步骤8：按每个识别分类对在步骤7中计算出的氨基酸序列的理论m/z值进行比较，将具有在每个属、种、亚种、血清型、株等识别分类中存在差异的理论m/z值的蛋白质确定为用于识别的标记。
[0054]
通常，在微生物的情况下，在不同的属、种、亚种、血清型及株中，具有多个相同的蛋白质，通过组合多个上述标记蛋白质的m/z值，能够识别微生物的属、种、亚种、血清型、株。
[0055]
以下更详细地说明各步骤。
[0056]
[步骤1～3]
[0057]
在步骤1中从识别对象微生物中选定的全基因组已被破译的微生物基于基因数据库等公知的数据库例如uniprot(注册商标，别名the universal protein resource)、ncbi或供应商信息来选定即可。选定全基因组已被破译的微生物后，获得该微生物，通过步骤2进行质量分析，得到蛋白质的基于氨基酸序列的分子量相关离子峰。质量分析方法优选为上述的maldi-ms。在maldi-ms中，针对每个蛋白质得到基于氨基酸序列的[m h]

等的分子量相关离子峰，通过步骤3对各个峰得到其m/z值。
[0058]
[步骤4]
[0059]
另一方面，在步骤1中选定的微生物由于进行了全基因组破译，因此该微生物中包含的蛋白质及其氨基酸序列已得到判明，通常收录在基因数据库中。因此，能够通过数据库获得在步骤1中选定的微生物中包含的全部蛋白质的氨基酸序列，计算各自的理论m/z值。所使用的数据库例如可例举uniprot(注册商标，别名the universal protein resource)、ncbi等。
[0060]
[步骤5]
[0061]
在步骤5中，通过对在步骤3中得到的实测m/z值与在步骤4中计算出的理论m/z值
进行比较，能够将在步骤2的质量分析中得到的全部分子量相关离子峰归属于已知的蛋白质及其氨基酸序列。
[0062]
[步骤6]
[0063]
在微生物的情况下，根据属、种、亚种、血清型或株的不同，有时蛋白质的质量不同。认为该质量的差异是由于构成蛋白质的氨基酸发生了变异的缘故。在步骤6中，为了检索氨基酸序列的突变体，检索与归属的蛋白质类似的氨基酸序列。
[0064]
在上述步骤6中，具有类似的氨基酸序列的蛋白质例如能够通过从现有的微生物的数据库中检索来确定。检索的方法例如可例举使用uniprot或ncbi等作为数据库的similarity检索(相似性检索)。在进行相似性检索的情况下，例如以序列类似度50％以上的条件进行检索。关于序列类似度，根据识别的目的等适当设定即可。
[0065]
[步骤7]
[0066]
具有在上述步骤6中选定的类似的氨基酸序列的蛋白质包含属于各种属或种的微生物的氨基酸序列，因此，根据识别分类从其中筛选微生物。例如在识别分类为种、亚种、血清型或株的情况下，筛选与在步骤1中筛选出的微生物相同属的微生物。此外，在识别分类为属的情况下，与其属无关地筛选全部微生物。然后，求出这些筛选出的微生物的氨基酸序列的理论m/z值。
[0067]
[步骤8]
[0068]
通过步骤4至7，对全基因组已被破译的微生物进行质量分析，由此得到检测出的蛋白质及其氨基酸序列的理论m/z值。同时，求出具有与全基因组已被破译的微生物的氨基酸序列类似的氨基酸序列的、例如同属异种的微生物所具有的蛋白质的理论m/z值。在步骤8中，例如对同属异种的微生物所具有的蛋白质的基于氨基酸序列的理论m/z值进行比较，如果能够确定具有在种间存在差异的m/z值的蛋白质，则将该蛋白质确定为种的识别用的标记。在步骤8中，在能够确定多个具有存在差异的m/z值的蛋白质的情况下，可以将具有存在差异的m/z值的蛋白质全部确定为标记，在这些蛋白质中，例如也可以将具有高强度的m/z值的蛋白质确定为标记，也可以将具有与其他标记的m/z值之差为200ppm以上、优选为500ppm以上、更优选为800ppm以上的m/z值的蛋白质确定为标记。
[0069]
在属、种、亚种或血清型不同的情况下，通过上述步骤确定的标记即使是相同的蛋白质，理论m/z值也分别不同。即，各蛋白质具有在每个属、种、亚种或血清型中不同的理论m/z值，因此能够设为用于它们的识别的标记。此时，即便在整体中有几个属、种、亚种或血清型具有相同的理论m/z值时，通过组合多个蛋白质的理论m/z值，若作为整体有助于识别，则也能够设为用于它们的识别的标记。
[0070]
以下，作为微生物，以沙门氏菌属为例，对上述方法进行更详细的说明。
[0071]
作为在步骤1中选定的全基因组已被破译的沙门氏菌，可例举肠道沙门氏菌肠道亚种阿巴特图巴血清型(salmonella enterica subsp.enterica serovar abaetetuba)(以下有时称为阿巴特图巴沙门氏菌(s.abaetetuba))(菌株：atcc 35640)、肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型(salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium)(菌株：atcc 700720)等。
[0072]
例如，通过利用maldi-ms对上述的阿巴特图巴沙门氏菌进行质量分析，得到蛋白质的基于氨基酸序列的[m h]

等的分子量相关离子峰。
[0073]
如果对实测的蛋白质的分子量相关离子峰应用自校准，则可求出更精确的m/z值。
[0074]
另一方面，阿巴特图巴沙门氏菌的基因组信息已被公开，例如能够从上述数据库uniprot等获得所持有的全部蛋白质名与氨基酸序列的数据。能够根据所得到的氨基酸序列信息计算各蛋白质的分子量相关离子峰的m/z值。通过将这样计算出的理论m/z值与之前实测的蛋白质的分子量相关离子峰的实测m/z值进行对比，能够将实测的蛋白质的分子量相关离子峰的m/z值归属于蛋白质以及氨基酸序列。
[0075]
阿巴特图巴沙门氏菌的实测的分子量相关离子峰数目较为庞大，因此可以适当选定进行归属的分子量相关离子峰。例如，可以选定m/z值为2000～20000、优选为3000～15000的范围的峰，对其进行归属。此外，也可以选定峰的s/n为2以上、优选为3以上的峰，对其进行归属。
[0076]
对于上述归属的蛋白质，例如通过进行使用了上述un i prot的相似性检索，得到类似的氨基酸序列的理论m/z值。通过从其中选择属于沙门氏菌的氨基酸序列与其蛋白质，分别得到沙门氏菌的各种、各亚种、各血清型、或各株及其理论m/z值。
[0077]
对如上所述得到的沙门氏菌的每个种、亚种、血清型的理论m/z值进行比较，能够将在每个种、亚种、血清型或株中示出不同的m/z值的蛋白质选定为标记。
[0078]
例如能够通过以下的工序来确认通过上述的方法选定的标记是否正确。首先，通过maldi-ms对已判明种、亚种、血清型中的任一个的微生物进行质量分析，与上述同样地求出对于通过实测得到的蛋白质的分子量相关离子峰的m/z值。能够通过是否以理论m/z值检测出被选定为标记的蛋白质来确认质量分析的结果。
[0079]
若以上述沙门氏菌为例，则首先利用maldi-ms对已判明血清型的多个沙门氏菌进行质量分析，与上述同样地求出对于通过实测得到的蛋白质的分子量相关离子峰的m/z值。能够通过是否按照上述血清型中的蛋白质的基于氨基酸序列的理论m/z值再现性良好地检测出被选定为标记的蛋白质来确认质量分析的结果。
[0080]
另外，通常情况下，在微生物的亚种已判明的情况下，其种已判明，在血清型已判明的情况下，其种与亚种已判明。另一方面，存在即使种已判明但其亚种或血清型未判明的情况。因此，在上述的确认方法中，例如，为了确认用于识别种的标记，需要使用种、或者种与亚种、或者种、亚种与血清型已判明的微生物。此外，为了确认用于识别种与亚种的标记，需要使用种与亚种、或者种、亚种与血清型已判明的微生物。
[0081]
使用通过上述方法确定的标记对识别对象的微生物进行识别。识别方法例如能够与标记的确定方法同样地采用对识别对象的微生物进行质量分析的方法。优选使用采用了特别是尽可能不分解高分子而进行离子化的软离子化法的maldi-ms。
[0082]
对识别对象的微生物进行质量分析，得到蛋白质的分子量相关离子峰。从得到的分子量相关离子峰中确认是否存在归属于被确定为上述标记的蛋白质的理论m/z值中的峰。或者确认以哪个理论m/z值检测出该标记蛋白质的峰。如果在识别对象的微生物中确认到归属于被确定为标记的蛋白质的理论m/z值中的峰的存在，则可识别出具有该蛋白质的种、亚种或血清型等。或者可基于该标记蛋白质的峰的m/z值，识别作为识别对象的微生物的种、亚种或血清型等。
[0083]
如上所述，通过预先选定能够用于微生物的识别的标记，如果对识别对象的微生物进行质量分析，则能够识别该微生物所属的属、种、亚种或血清型。此外，不需要对设想的
属、种、亚种、血清型全部另外进行分析而与识别对象的微生物进行比较，仅分析识别对象的微生物即可。
[0084]
所选定的标记使属、种、亚种、血清型的识别变得容易，能够简便且迅速地识别微生物的属、种、亚种以及血清型。此外，也能够按照属、种、亚种、血清型来确定标记，构建由所确定的标记的至少一个与其理论m/z值、以及属、种、亚种或血清型中的至少任一个构成的数据库。例如，能够确定可识别亚种的标记，构建各亚种与其标记的数据库。通过构建这样的数据库，能够根据识别对象微生物的质量分析的结果直接识别其属、种、亚种或血清型。此外，本发明的标记的选定方法只要分析已破译全基因组的微生物即可，能够抑制对人存在致病性的微生物等的实测次数，从检查者的安全性、劳力的观点出发也是有用的。
[0085]
实施例
[0086]
以下例举实施例对本发明详细地进行说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
[0087]
作为微生物，将沙门氏菌设为被检试样，进行能够用于识别沙门氏菌的种、亚种、血清型的标记的确定。
[0088]
利用maldi-ms对被检试样进行质量分析。在maldi-ms中使用的装置为岛津制作所制axima(注册商标)performance，测量条件如下所述。
[0089]
[质量分析条件]
[0090]
装置：岛津制作所制axima(注册商标)performance
[0091]
条件：正模式(positive模式)。lin模式。光栅分析。
[0092]
[工序]
[0093]
通过下述工序1-9进行沙门氏菌的标记的确定及其确认。
[0094]
1.选定肠道沙门氏菌肠道亚种阿巴特图巴血清型(以下称为阿巴特图巴沙门氏菌)的菌株：atcc 35640作为沙门氏菌的全基因组破译株，在lb琼脂培养基中，以温度37℃培养20小时。同样地，将沙门氏菌属的2种血清型：肠炎沙门氏菌(菌株：gtc00131、gtc09491、hyogose11002、hyogose12001)与鼠伤寒沙门氏菌(菌株：nbrc14210、nbrc15181、nbrc12529、nbrc13245)的各株在lb琼脂培养基中以温度37℃培养20小时。
[0095]
2.作为基质溶液，制备以下的芥子酸(sinapinic acid)(wako公司制，以下称为sa)溶液并用于以下的工序。
[0096]
sa-1：sa为25mg/ml的乙醇(以下称为etoh)溶液
[0097]
sa-2：sa为25mg/ml的由1重量％亚甲基二膦酸(methylene diphosphoric acid，西格玛奥德里奇公司制，以下称为mdpna)、1mm正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷(西格玛奥德里奇公司制，以下称为dmp)、0.6重量％三氟乙酸(wako公司制，trifluoroacetic acid，以下称为tfa)以及50重量％乙腈(wako公司制，acetonitrile，以下称为acn)构成的水溶液。
[0098]
3.用微量天平称量约1mg上述工序1的沙门氏菌，加入工序2中制备的sa-2溶液，利用针(needle)以沙门氏菌的浓度为1mg/0.075ml(1
×
107个/μl)的方式悬浮后，施加1min超声波，对得到的悬浮液在12000rpm、5min的条件下进行离心分离。
[0099]
4.将上述工序2.中制备的sa-1溶液以每滴0.5μl滴加到maldi板上，进行预涂布。然后，将上述3.的离心分离后的上清液以每滴1μl滴加至预涂布后的孔中。自然干燥后，在maldi-ms中插入板，以正模式、lin模式通过光栅分析进行测量。n数设为4。测量后，应用沙
门氏菌的自校准，评价得到的质谱，确认检测出的蛋白质的峰的m/z值。
[0100]
5.从作为全基因组破译株的阿巴特图巴沙门氏菌的公开基因信息中获得全部的氨基酸序列与蛋白质名。根据该氨基酸序列信息计算各蛋白质的基于氨基酸序列的理论m/z值。
[0101]
6.对于在上述工序5中获得的蛋白质，选择归属于如下峰的蛋白质：在上述4.中得到的质谱的峰中，m/z值为3000～20000范围、峰的信号/噪声比(s/n)为3以上、质量精度500ppm以内、n数4中检测到3次以上的峰，且相对于一个峰不存在2个以上从工序5获得的蛋白质的m/z值的理论值的近似值。
[0102]
7.对于上述工序6的各蛋白质，通过公开基因信息的相似性检索(序列类似度50％以上)来检索类似的氨基酸序列信息，将沙门氏菌属菌的各株中的理论m/z值与种、亚种、血清型信息一起获得。
[0103]
8.将在上述工序7中得到的理论m/z值分别按沙门氏菌属的种、亚种、血清型进行比较，将在每个种、亚种、血清型中示出不同的m/z值的蛋白质确定为标记。
[0104]
[结果]
[0105]
首先，在肠炎沙门氏菌(菌株：gtc00131、gtc09491、hyogose11002、hyogose12001)与鼠伤寒沙门氏菌(菌株：nbrc14210、nbrc15181、nbrc12529、nbrc13245)的质谱中，将与上述工序6同样地进行选择而得的主要蛋白质中的代表峰的检测状况汇总于表1。其结果，实测数据基本反映了根据基因信息计算出的蛋白质的m/z值信息。
[0106]
[表1]
[0107]
表1.肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌的主要蛋白质的峰检测率(％)
[0108][0109]
如下求出检测率。
[0110]
按血清型对上述各株各测量4次，将s/n》3、质量精度500ppm以内且检测到3次以上蛋白质的情况判定为检测出该蛋白质的株。将检测出的株的数目除以所测量的株的总数，作为检测率。例如，若在4株中检测出蛋白质的株为4株则检测率为100％，若在4株中检测出蛋白质的株为3株则检测率为75％。
[0111]
根据表1可知，除了一部分以外，基本可按照理论值检测出峰。作为存在根据蛋白质的不同而检测率低的情况的理由，是因为蛋白质的峰为低灵敏度。根据该结果，确认了能够根据基因信息预测检测峰的m/z值。由此，认为能够基于基因信息预测标记蛋白质。
[0112]
接着，在上述工序8中，按沙门氏菌属的种、亚种、血清型对理论m/z值进行比较，将在每个种、亚种、血清型中示出不同的m/z值的以下26种蛋白质确定为标记蛋白质。
[0113]
s22、ycar、l35、bcsr、ssag、nucleotidyl transferase、yibj、oadg、chab、zapb、hu-1、yeis、hu-2、irap、s15、rpoz、ihfb、ihfa、ygam、raia、yife、yeex、endolysin、rnasep、
chey、s5
[0114]
例如，对于在工序8中确定为标记的蛋白质chab，将沙门氏菌属的2种血清型(肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌)的实测峰示于图2，将理论m/z值示于表2。由图2以及表2可知，确认到通过确定为标记的蛋白质chab能够识别2种血清型(肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌)。
[0115]
[表2]
[0116]
表2.肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌的chab的理论m/z值
[0117][0118]
进而，将上述中确定为标记的26种蛋白质的种、亚种、血清型的理论m/z值汇总的结果示于表3、5、7。并且，将非专利文献1中报告的沙门氏菌血清型识别用的12种标记蛋白质的理论m/z值汇总的结果示于表4、6、8。
[0119]
[表3]
[0120]
表3.用于识别沙门氏菌的种的26种新标记蛋白质的理论m/z的例子
[0121][0122]
表3示出了针对沙门氏菌属的2个种(邦戈尔沙门氏菌、肠道沙门氏菌)的、在上述中确定为标记的26种蛋白质中的17种代表(s15、s22、yeis、ycar、ygam、raia、irap、hu2、bcsr、ihfa、chey、rpoz、yife、ihfb、yeex、hu1、endolysin)的理论m/z值。表中的下划线的数值表示仅在该种中确认到的理论m/z值。其中，在种间存在500ppm以内的m/z值的情况下，不
带下划线。在存在多个m/z值的情况下，将代表值以外的值表示为“etc.”。在该情况下，存在作为在种间具有差异的代表性的m/z值并且其为在种间近似的m/z值时，优先例示该m/z值作为代表值。
[0123]
以下划线的数值的m/z值确认到峰的情况下，表示有可能仅通过该峰就能够进行种的识别。此外，可知在难以通过一个蛋白质进行识别的情况下，也有可能能够通过确认多个蛋白质的m/z值来识别。并且，通过与后述的表4那样的已知标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0124]
[表4]
[0125]
表4.用于识别沙门氏菌的种的12种已知标记蛋白质的理论m/z值的例子
[0126][0127]
表4示出了针对沙门氏菌属的2个种(邦戈尔沙门氏菌、肠道沙门氏菌)的、作为非专利文献1中报告的血清型识别用而已知的12种标记蛋白质中的6种代表的理论m/z值。下划线的数值表示仅在该种中确认到的理论m/z值。其中，在种间存在500ppm以内的m/z值的情况下，不带下划线。在存在多个m/z值的情况下，将代表值以外的值表示为“etc.”。在该情况下，存在作为在种间具有差异的代表性的m/z值并且其为在种间近似的m/z值时，优先例示该m/z值作为代表值。
[0128]
另外，例示的6种蛋白质为非专利文献1中报告的血清型识别用的12种标记中的6种，作为表4中例示的种的识别用标记并非已知的。
[0129]
在以表4的下划线的数值的m/z值确认到峰的情况下，表示有可能仅通过该峰就能够进行种的识别。此外，可知在难以通过一个蛋白质进行识别的情况下，也有可能能够通过确认多个蛋白质的m/z值来识别。并且，通过与上述表3那样的新标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0130]
[表5]
[0131]
表5.用于识别沙门氏菌的亚种的26种新标记蛋白质的理论m/z值的例子
[0132][0133]
表5示出了针对肠道沙门氏菌的6个亚种(豪顿亚种(houtenae)、萨拉姆亚种(salamae)、因迪卡亚种(indica)、双相亚利桑那亚种(diarizonae)、亚利桑那亚种(arizonae)、肠道亚种(enterica))的新标记蛋白质26种中的6种代表(chab、yeis、ssag、irap、bcsr、endolysin)的理论m/z值。表中的连字符表示在数据库中没有记载。下划线的数值表示仅在该亚种中确认到的理论m/z值。其中，在种间存在500ppm以内的m/z值的情况下，不带下划线。在存在多个m/z值的情况下，将代表值以外的值表示为“etc.”。在该情况下，存在作为在种间具有差异的代表性的m/z值并且其为在种间近似的m/z值时，优先例示该m/z值作为代表值。
[0134]
在以下划线的数值的m/z值确认到峰的情况下，表示有可能仅通过该峰就能够进行种的识别。此外，可知在难以通过一个蛋白质进行识别的情况下，也有可能能够通过确认多个蛋白质的m/z值来识别。并且，通过与后述的表6那样的已知标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0135]
[表6]
[0136]
表6.用于识别沙门氏菌的亚种的12种已知标记蛋白质的理论m/z值的例子
[0137][0138]
表6示出了针对肠道沙门氏菌的6个亚种(豪顿亚种、萨拉姆亚种、因迪卡亚种、双相亚利桑那亚种、亚利桑那亚种、肠道亚种)的、非专利文献1中报告的作为血清型识别用而已知的标记蛋白质12种中的4种代表(yibt、l15、yaia、gns)的理论m/z值。表中的连字符表示在数据库中没有记载。下划线的数值表示仅在该亚种中确认到的理论m/z值。其中，在种间存在500ppm以内的m/z值的情况下，不带下划线。在存在多个m/z值的情况下，将代表值以外的值表示为“etc.”。在该情况下，存在作为在种间具有差异的代表性的m/z值并且其为在种间近似的m/z值时，优先例示该m/z值作为代表值。
[0139]
另外，例示的4种蛋白质是在非专利文献1中报告的血清型识别用的12种标记中的4种，作为表6中例示的亚种的识别用标记并非已知的。
[0140]
在以下划线的数值的m/z值确认到峰的情况下，表示有可能仅通过该峰就能够进行种的识别。此外，可知在难以通过一个蛋白质进行识别的情况下，也有可能能够通过确认多个蛋白质的m/z值来识别。
[0141]
并且，通过与上述表5那样的新标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0142]
[表7]
[0143]
表7.用于识别沙门氏菌的血清型的26种新标记蛋白质的理论m/z值的例子
[0144][0145]
表7示出了针对肠道沙门氏菌肠道亚种的14种血清型(adelaide、agama、agona、alachua、albany、altona、anatum、barreilly、berta、bovismorbificans、braenderup、brancaster、bredeney、cerro)的新标记蛋白质26种中的7种代表(yjbj、chab、yeis、ssag、ygam、raia、endolysin)的理论m/z值。表中的连字符表示没有数据库。可知存在能够通过组合多个蛋白质的m/z值来进行识别的可能性。并且，通过与后述的表8那样的已知标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0146]
[表8]
[0147]
表8.用于识别沙门氏菌的血清型的已知标记蛋白质的理论m/z值的例子
[0148][0149]
表8示出了针对肠道沙门氏菌肠道亚种的14种血清型(adelaide、agama、agona、alachua、albany、altona、anatum、barreilly、berta、bovismorbificans、braenderup、brancaster、bredeney、cerro)的新标记蛋白质的6种代表(soda、yibt、l15、pplase、l25、
gns)的理论m/z值。表中的连字符表示没有数据库。可知存在能够通过组合多个蛋白质的m/z值来进行识别的可能性。另外，已知由于soda为高质量蛋白质，与其他蛋白质相比灵敏度低，在高质量区域确认的峰形状容易发生变异等，因此m/z值的精度容易降低。
[0150]
例示的6种蛋白质是在非专利文献1中报告的用于识别22种血清型的12种标记中的6种，而严格意义上来看作为22种以外的血清型的识别标记也是有效的这一点并不是已知的。在表8中，除了s.altona、s.braenderup，均属于上述22种之外的血清型。
[0151]
此外，通过与表7那样的新标记蛋白质的m/z值的检测状况组合，有可能还能够进行仅通过已知标记蛋白质难以实现的识别。
[0152]
根据表3～8的结果，判明了通过使用了基因信息的本次的流程确认的26种新标记蛋白质对于沙门氏菌的种、亚种、血清型的识别是有效的。并且，启示了通过这些标记蛋白质，还能够进行仅通过已知的标记蛋白质难以实现的识别的可能性。此外，本发明的微生物识别用标记的确定方法能够通过使用基因信息来确定针对更多的种、亚种、血清型的识别标记。
[0153]
根据以上的结果可知，能够根据基因信息预测实测数据，通过比较根据基因信息得到的理论m/z值，能够确定识别微生物的标记。特别地，本发明的微生物识别用标记的确定方法利用了通过进行1次全基因组信息已判明的沙门氏菌的质量分析而得到的检测峰的m/z值。即，使用1次实测数据并根据基因信息预测不同的种等的实测数据，比较来自基因信息的理论值，由此能够确定对沙门氏菌的种、亚种、血清型的识别有效的标记。
[0154]
[方案]
[0155]
本领域技术人员理解上述示例性的实施方式是以下方案的具体例。
[0156]
[1]一种微生物识别用标记的确定方法，包括下述步骤1～8。
[0157]
步骤1：选定全基因组已被破译的微生物。
[0158]
步骤2：对在上述步骤1中选定的微生物所具有的蛋白质进行质量分析，得到蛋白质的基于氨基酸序列的分子量相关离子峰。
[0159]
步骤3：根据在上述步骤2中得到的分子量相关离子峰得到各峰的实测m/z值。
[0160]
步骤4：对于在上述步骤1中选定的微生物，通过基因数据库得到该微生物所具有的蛋白质与氨基酸序列，根据该氨基酸序列信息计算该蛋白质的理论m/z值。
[0161]
步骤5：对在步骤4中计算出的理论m/z值与在上述步骤3中得到的实测m/z值进行比较，将实测m/z值归属于具有与实测m/z值一致的理论m/z值的蛋白质及其氨基酸序列。
[0162]
步骤6：从数据库中获得与在上述4中归属的蛋白质类似的氨基酸序列。
[0163]
步骤7：根据识别分类从具有在上述步骤6中获得的类似的氨基酸序列的微生物中筛选微生物，计算该微生物所具有的蛋白质的氨基酸序列的理论m/z值。
[0164]
步骤8：对在步骤7中计算出的氨基酸序列的理论m/z值进行比较，将具有在每个分类中存在差异的m/z值的蛋白质确定为用于识别的标记。
[0165]
根据上述[1]的发明，提供一种基于较少的实测数据来确定用于识别微生物的标记的方法。
[0166]
[2]如上述[1]所述的微生物识别用标记的确定方法，上述质量分析为maldi-ms。
[0167]
根据上述[2]的发明，能够使用极微量的微生物试样在短时间内得到分析结果，并且也容易进行多被检体的连续分析。
[0168]
[3]如上述[1]～[2]的任一项所述的微生物识别用标记的确定方法，微生物为沙门氏菌。
[0169]
根据上述[3]的发明，能够确定沙门氏菌的识别用标记。
[0170]
[4]一种微生物的识别方法，使用了通过上述[1]所述的方法确定的微生物识别用标记。
[0171]
根据上述[4]的发明，能够以较少的实测迅速地识别微生物。
[0172]
[5]如上述[4]所述的微生物的识别方法，微生物为沙门氏菌。
[0173]
根据上述[5]的发明，能够迅速地识别沙门氏菌。
[0174]
[6]一种数据库，包含通过上述[1]所述的方法确定的微生物识别用标记及其理论m/z值、以及从与该标记对应的微生物的属、种、亚种、血清型和株构成的组中选择的至少1种。
[0175]
通过使用上述[6]的发明，能够简便地识别微生物。