环氧树脂的化学酶降解的制作方法

转移酶接触以获得混合物mb的步骤。
18.优选地，本发明的方法进一步包括在步骤b)之后或者与步骤b)同时进行的步骤c)，步骤c)包括酶处理，该酶处理包括使混合物ma或混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
19.特别地，包括步骤b)或步骤b)和步骤c)的酶处理之后是连续的步骤d)，其包括化学处理混合物mb或混合物mc，该化学处理包括使混合物mb或混合物mc与强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。更特别地，步骤d)中的强布朗斯台德碱的水溶液是氢氧化钠水溶液。
20.有利地，步骤a)包括在该溶剂中溶胀该环氧树脂r。更有利地，在步骤a)中，该溶剂选自包括磷酸氢二钠的水溶液、磷酸的水溶液和苯酚的组，更优选地该溶剂是磷酸氢二钠的水溶液。
21.特别地，在步骤b)中，该谷胱甘肽s-转移酶产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌(n.aromaticivorans)菌株。
22.优选地，在步骤c)中，该对羟基苯甲酸羟化酶是突变酶，优选地是呈现至少两个点突变l199v或l200v和y385f的突变酶。
23.有利地，该芳香族化合物r1对应于双酚的二缩水甘油醚，特别是双酚a二缩水甘油醚。
24.特别地，该固化剂r2是胺或咪唑衍生物。
25.特别地，然后使步骤d)之后获得的混合物md进一步经受如以上所定义的步骤b)至d)。可替代地，使步骤d)之后获得的混合物md进一步经受如以上所定义的步骤a)至d)。
26.本发明还涉及谷胱甘肽s-转移酶、特别是产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌菌株的谷胱甘肽s-转移酶用于降解基于以下的环氧树脂r的用途：
[0027]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0028]-至少一种固化剂r2。
[0029]
特别地，进一步使用对羟基苯甲酸羟化酶用于降解该环氧树脂r，优选呈现至少两个以下点突变的突变的对羟基苯甲酸羟化酶：l199v或l200v和y385f，以用于降解基于以下的环氧树脂r：
[0030]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0031]-至少一种固化剂r2。
[0032]
本发明涉及一种用于回收复合材料cm的方法，该方法包括以下步骤：
[0033]
a’)提供包含基于以下的环氧树脂r的复合材料：
[0034]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0035]-至少一种固化剂r2，
[0036]
b’)处理步骤a’)之后获得的该复合材料cm，该处理包括用根据本发明的用于降解环氧树脂的方法降解该环氧树脂r的步骤，在这种情况下步骤a)中的该环氧树脂r是该复合材料cm，
[0037]
c’)步骤b’)之后获得环氧树脂含量减少的复合材料。
[0038]
1.用于降解环氧树脂的方法
[0039]
根据本发明的方法包括至少两个如以下描述的步骤a)和b)。
[0040]
1.1步骤a)
[0041]
步骤a)包括向溶剂中添加基于以下的环氧树脂r：
[0042]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0043]-至少一种固化剂r2
[0044]
以获得混合物ma。
[0045]
步骤a)允许该环氧树脂r在其加入的该溶剂中溶胀。特别地，它还可以允许环氧树脂r的解交联。更特别地，当该溶剂是包含磷酸盐的水溶液时，步骤a)允许环氧树脂或部分解交联的环氧树脂的磷酸化。
[0046]
在本发明中，非极性溶剂是具有小于15的介电常数的溶剂。
[0047]
在本发明中，极性溶剂是具有15或大于15的介电常数的溶剂。
[0048]
在本发明中，极性质子溶剂是具有15或大于15的介电常数并且含有不稳定质子的溶剂。
[0049]
在本发明中，极性非质子溶剂是具有15或大于15的介电常数并且缺乏不稳定质子的溶剂。
[0050]
溶剂可以是选自戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、石油醚、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷及其混合物的非极性溶剂，特别地其是己烷。
[0051]
溶剂可以是选自二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺(dma)、四氢呋喃(thf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)、二甲氧基乙烷(dme)、甲基叔丁基醚(mtbe)、硝基甲烷、1,4-二噁烷、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、乙酸、甲酸及其混合物的非质子极性溶剂，特别地其选自dmso和dmf。
[0052]
溶剂可以是选自醇、水溶液及其混合物的质子极性溶剂。
[0053]
在本发明中，醇是在碳原子上带有至少一个羟基的有机化合物。优选地，它在包括在55℃与95℃之间的温度下是液体。特别地，它可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇及其区域异构体、苯酚、戊醇及其区域异构体、1-己醇、2,2,2-三氟乙醇(tfe)、六氟丙-2-醇(hfip)。
[0054]
向其中添加环氧树脂r的溶剂可以是如以上所描述的非极性溶剂和非质子极性溶剂的混合物。
[0055]
向其中添加环氧树脂r的溶剂可以是如以上所描述的非极性溶剂和质子极性溶剂的混合物。
[0056]
向其中添加环氧树脂r的溶剂可以是如以上所描述的非质子极性溶剂和质子极性溶剂的混合物。
[0057]
优选地，向其中添加环氧树脂r的溶剂选自如以上所描述的极性质子溶剂、极性非质子溶剂及其混合物，更特别地其是如以上所描述的极性质子溶剂。
[0058]
有利地，溶剂选自由醇、水溶液及其混合物组成的组。更有利地，水溶液可以包含一种或多种布朗斯台德酸如h3po4、h2so4、hcl、hbr或hno3。可替代地，水溶液可以包含一种或
多种布朗斯台德碱如磷酸氢二钠、氨、naoh、koh、na2co3或k2co3。
[0059]
特别地，向其中添加环氧树脂r的溶剂选自包括苯酚、磷酸的水溶液、磷酸氢二钠的水溶液及其组合的组。更特别地，步骤a)的溶剂是磷酸氢二钠的水溶液。甚至更特别地，在步骤a)中使用的磷酸氢二钠水溶液具有从120至1000g/ml的磷酸氢二钠的浓度，优选120至500g/l。尤其是，磷酸氢二钠以其十二水合磷酸氢二钠的形式使用。
[0060]
有利地，磷酸氢二钠/环氧树脂的重量比包括在5与150g/g之间。
[0061]
可以将步骤a)的环氧树脂r和溶剂的混合物在包括在20℃与95℃之间、优选在40℃与95℃之间、更优选在55℃与95℃之间的温度下加热。
[0062]
步骤a)优选地在搅拌下进行。
[0063]
步骤a)可以持续从72小时至4天。
[0064]
有利地，步骤a)包括以下步骤：
[0065]-a1)将环氧树脂r添加至溶剂中，
[0066]-a2)搅拌，然后
[0067]-a3)任选地在减压下部分蒸发，并且然后
[0068]-a4)任选地用水稀释。
[0069]
四个步骤a1)、a2)、a3)和a4)是连续的。可以重复步骤a2)、a3)和任选地a4)一次或多于一次，特别是从一次至三次。
[0070]
特别地，在步骤a2)中，将环氧树脂r在溶剂中的混合物搅拌72小时至1920小时。
[0071]
特别地，在步骤a2)中，将环氧树脂r在溶剂中的混合物在包括在20℃与95℃之间、优选在40℃与95℃之间、更优选在55℃与95℃之间的温度下搅拌。
[0072]
优选地，将环糊精进一步添加至环氧树脂在溶剂中的混合物中。
[0073]
在本发明中，环糊精是环状寡糖，由通过α-1,4糖苷键连接的α-d-吡喃葡萄糖亚单元的大环的环组成。它特别地由五个或更多个通过1,4糖苷键连接的α-d-吡喃葡萄糖单元构成。环糊精α包含6个α-d-吡喃葡萄糖亚单元。环糊精β包含7个α-d-吡喃葡萄糖亚单元。环糊精γ包含8个α-d-吡喃葡萄糖亚单元。
[0074]
优选地，在步骤a)中使用的环糊精在环中包含范围从六至八个单元的多个d-吡喃葡萄糖亚单元。
[0075]
更优选地，环糊精选自包括环糊精α、环糊精β和环糊精γ的组，甚至更优选地环糊精是环糊精β。
[0076]
有利地，环糊精/环氧树脂的重量比包括在2.5与50g/g之间。
[0077]
有利地，步骤a)包括以下步骤：
[0078]-a5)将环糊精添加至环氧树脂r和溶剂的混合物中，
[0079]-a6)将所得到的混合物在包括在20℃与95℃之间的温度下加热。
[0080]
步骤a5)和步骤a6)优选地在搅拌下进行。
[0081]
特别地，将环糊精在步骤a4)之后添加。更特别地，步骤a5)和步骤a6)在步骤a4)之后。
[0082]
优选地，在步骤a6)中，将环氧树脂、环糊精和溶剂的混合物搅拌24小时至几周，更优选地搅拌36小时至72小时。
[0083]
将步骤a)之后获得的混合物称为混合物ma。
[0084]
1.2步骤b)
[0085]
步骤b)包括酶处理步骤a)之后获得的混合物ma，该处理包括使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶接触以获得混合物mb的步骤。
[0086]
在本发明的意义上，“谷胱甘肽s-转移酶”(gst)是具有催化还原形式的谷胱甘肽(gsh)与不同底物结合的能力的酶。
[0087]
在标准命名法中，这些酶被归类为ec 2.5.1.18的成员。
[0088]
特别地，gst酶能够将谷胱甘肽基团转移至树脂结构上，如以下等式(或图x)中所示：
[0089][0090]
其中
[0091]
实际上，谷胱甘肽或(2s)-2-氨基-4-{[(1r)-1-[(羧基甲基)氨基甲酰基]-2-硫烷基乙基]氨基甲酰基}丁酸包含一个硫醇基团。谷胱甘肽基团对应于通过其硫连接至树脂结构的谷胱甘肽分子。
[0092]
在本发明的方法中使用的谷胱甘肽s-转移酶(gst)可以是真核或原核来源的，优选是原核来源的。
[0093]
在gst的超家族之中，被称为β-醚酶的立体特异性谷胱甘肽s-转移酶的亚类是本发明的方法特别感兴趣的。
[0094]
特别地，可以使用产生自鞘氨醇菌属种(sphingobium sp.)及其同系物的酶lige、ligp、和ligf。在本领域技术人员容易识别的同系物之中，技术人员可以引用来自新鞘脂菌属种(novosphingobium sp.)pp1y的酶lige-ns(＝nslige)和ligf-ns，来自嗜芳烃新鞘氨醇菌(novosphingobium aromaticivorans)dsm12444的lige-na(＝nalige)、ligf-na(＝naligf1)和naligf2。
[0095]
在方法的具体实施中，在步骤b)中使用的谷胱甘肽s-转移酶是β-醚酶。特别地，在步骤b)中使用的gst是产生自鞘脂菌属物种的酶lige、ligp或ligf或这些酶的任何同系物，例如ligd、ligl、lign、ligo或ligg。优选地，在步骤b)中使用的gst是lige同系物。
[0096]
在本发明的方法的具体实施中，在步骤b)中，谷胱甘肽s-转移酶产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌(嗜芳烃新鞘氨醇菌(n.aromaticivorans))菌株。谷胱甘肽s-转移酶特别地可以是产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌菌株的lige同系物，即，lige-na。
[0097]
特别地，可以将谷胱甘肽s-转移酶固定在合适的固体支撑物上。
[0098]
有利地，将谷胱甘肽s-转移酶以表达谷胱甘肽s-转移酶的裂解细菌的肉汤形式添加至混合物ma中。细菌是如上所描述的。裂解细菌的肉汤通过以下方式获得：培养如以上描
述的细菌，随后离心以获得细胞团块，然后将细胞团块与磷酸盐缓冲液(0.1m ph＝7.0)以1g(团块)/10ml(缓冲液)的比例混合，并且通过超声使细菌裂解。
[0099]
由细菌裂解获得的肉汤含有谷胱甘肽s-转移酶。可以使用至少1vol.％的该溶液，优选地可以使用从1vol.％至20vol.％。
[0100]
特别地，在步骤b)中，使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶在适当的介质中接触。
[0101]
有利地，谷胱甘肽s-转移酶细胞团块/混合物ma在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与10g/kg之间。
[0102]
特别地，适当的介质是包含谷胱甘肽的水性介质。更特别地，谷胱甘肽/谷胱甘肽s-转移酶细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.06g/kg与3g/kg之间。
[0103]
特别地，适当的介质包含甘氨酸。更特别地，甘氨酸/谷胱甘肽s-转移酶细胞团块在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与50g/kg之间。
[0104]
优选地，适当的介质具有包括在6与11之间、更优选在8与10之间的ph。
[0105]
优选地，使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶接触至少50小时、更优选至少60小时。
[0106]
特别地，使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶在包括在20℃与45℃之间的温度下接触。
[0107]
因此，在步骤b)中，使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶优选地在包含谷胱甘肽、任选地甘氨酸的水性介质中，优选地在包括在6与11之间的ph下，优选地在包括在20℃与45℃之间的温度下接触，并且优选地接触至少50小时。
[0108]
特别地，步骤b)包括以下步骤：
[0109]-b1)优选地依次向反应器中添加混合物ma、水、谷胱甘肽、任选地甘氨酸、以及谷胱甘肽s-转移酶，
[0110]-b2)将步骤b1)之后获得的混合物在包括在20℃与45℃之间的温度下搅拌至少50小时。
[0111]
步骤b1)之后获得的混合物对应于以上提及的在适当的介质中与谷胱甘肽s-转移酶接触的混合物ma。
[0112]
将步骤b)之后获得的混合物称为混合物mb。
[0113]
所得到的混合物mb具有包括在5与7之间的ph。
[0114]
1.3步骤c)
[0115]
步骤c)包括酶处理，其包括使混合物ma或混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
[0116]
在本发明的意义上，对羟基苯甲酸羟化酶(被归类为ec 1.14.13.2)是参与芳香族化合物降解的黄素蛋白。辅因子nadp作为氢的受体参与反应，并且在反应过程中被转化为nadph。在步骤c)中，该酶催化芳香族部分(在树脂结构中大量存在)上羟基的加成，如以下图示呈现的：
[0117]
[0118]
因此，该反应允许树脂的氧化。树脂因而更具亲水性，并且其在水性介质中的溶解度增加。此外，这些羟基化部分更易受步骤d)中进行的断裂的影响。
[0119]
在优选实施例中，在步骤c)中使用的对羟基苯甲酸羟化酶(phbh)产生自绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)。在另一个实施例中，在步骤c)中使用的对羟基苯甲酸羟化酶(phbh)产生自谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。
[0120]
在步骤c)中使用的phbh酶可以是野生型酶或突变酶。
[0121]
对于该步骤c)，评估了phbh的几种突变体(参见实例c)。尽管所有测试的酶均能够催化树脂的羟基化，但是它们中的一种被认定为特别有效：用以下两个点突变修饰的来自绿脓杆菌的phbh：l199v和y385f。该突变酶先前已经在申请jp 2009213392中报告(seq id no.10)。
[0122]
在本发明的优选实施例中，在步骤c)中使用的phbh是突变酶，甚至更优选地其是呈现至少两个点突变l199v或l200v和y385f的突变酶，更优选地是以下中的一种：
[0123]-用以下两个点突变修饰的产生自绿脓杆菌的突变phbh酶：l199v和y385f(在实例中指定为“m010”)，或
[0124]-同时用以下两个点突变修饰的产生自谷氨酸棒状杆菌的突变phbh酶：l200v和y385f(在实例中指定为“ym321”)，或
[0125]-用以下三个点突变修饰的产生自谷氨酸棒状杆菌的突变phbh酶：l200v、y385f和d39y(在实例中指定为“ym322”)。
[0126]
特别地，可以将phbh固定在合适的固体支撑物上。
[0127]
特别地，在步骤c)中，使前述混合物(ma或mb)与phbh在适当的介质中、特别地在包含适当量的辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)的水性介质中接触。
[0128]
有利地，水性介质包含允许辅因子nadp再生的化合物。用于再生nadp的手段是本领域技术人员所熟知的。特别地，用于步骤c)的适当的介质可以包含葡萄糖和具有葡萄糖脱氢酶活性的酶，其将nadp

还原为nadph同时氧化葡萄糖-6-磷酸(归类于ec 1.1.1.49中)。本领域技术人员熟知这些酶，并且将能够选择一种葡萄糖脱氢酶如et004。
[0129]
优选地，水性介质包含黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。
[0130]
更优选地，水性体系包含葡萄糖脱氢酶如et004和fad。
[0131]
有利地，以表达phbh的裂解细菌的肉汤形式添加phbh。细菌是如上所描述的。裂解细菌的肉汤通过以下方式获得：培养如以上描述的细菌，随后离心以获得细胞团块，然后将细胞团块与磷酸盐缓冲液(0.1m ph＝7.0)以1g(团块)/10ml(缓冲液)的比例混合，并且通过超声使细菌裂解。
[0132]
由细菌裂解获得的肉汤含有phbh。可以使用至少1vol.％的该溶液，优选地可以使用从1vol.％至20vol.％。
[0133]
步骤c)可以在步骤b)之后或者与步骤b)同时进行。
[0134]
如果步骤c)在步骤b)之后进行，则步骤c)包括酶处理，该酶处理包括使混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
[0135]
如果步骤c)与步骤b)同时进行，则步骤c)包括酶处理，该酶处理包括使混合物ma与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
[0136]
在第一个实施例中，在根据本发明的方法中，步骤b)之后是包括酶处理步骤b)之
后获得的混合物mb的连续的步骤c)，该处理包括使混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
[0137]
在该实施例中，根据本发明的方法中的酶处理包括进行步骤b)，随后进行步骤c)。
[0138]
有利地，phbh细胞团块/混合物b在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与10g/kg之间。
[0139]
特别地，适当的介质是包含nadp的水性介质。更特别地，nadp/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.1g/kg与10g/kg之间。
[0140]
特别地，适当的介质包含葡萄糖。更特别地，葡萄糖/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在50g/kg与300g/kg之间。
[0141]
有利地，适当的介质包含fad。更特别地，fad/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.0002g/kg与0.002g/kg之间。
[0142]
特别地，适当的介质包含葡萄糖脱氢酶如et004。更特别地，et004细胞团块/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.3g/kg与10g/kg之间。
[0143]
优选地，适当的介质具有包括在6与11之间、更优选在8与9之间的ph。
[0144]
优选地，使混合物mb在大气压下与phbh接触至少50小时。
[0145]
特别地，使混合物mb与phbh在包括在20℃与45℃之间、更优选在30℃与40℃之间的温度下接触。
[0146]
因此，在步骤c)中，使混合物mb与phbh优选地在包含nadp、任选地葡萄糖、任选地fad、任选地et004的水性介质中，优选地在包括在8与9之间的ph下，优选地在包括在20℃与45℃之间的温度下接触，并且优选地接触至少50小时。
[0147]
特别地，步骤c)包括以下步骤：
[0148]-c1)优选地依次向反应器中添加混合物mb、葡萄糖、nadp、fad、et004和phbh，
[0149]-c2)将步骤c1)之后获得的混合物在包括在20℃与45℃之间的温度下搅拌至少50小时。
[0150]
步骤c1)之后获得的混合物对应于以上提及的在适当的介质中与phbh接触的混合物mb。
[0151]
在第二个实施例中，在根据本发明的方法中，步骤b)与步骤c)同时。因此，步骤a)之后是酶处理步骤a)之后获得的混合物ma，该处理包括使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶和对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤。
[0152]
在该实施例中，根据本发明的方法中的酶处理包括同时进行步骤b)和步骤c)。
[0153]
特别地，当步骤b)和步骤c)同时进行时，使混合物ma与gst和phbh同时在适当的介质中接触。
[0154]
有利地，gst细胞团块/混合物a在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与10g/kg之间。
[0155]
有利地，phbh细胞团块/混合物a在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与10g/kg之间。
[0156]
特别地，适当的介质是包含nadp和谷胱甘肽的水性介质。更特别地，nadp/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.1g/kg与10g/kg之间。更特别地，谷胱甘肽/gst细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.06g/kg与3g/kg之间。
[0157]
特别地，适当的介质包含甘氨酸。更特别地，甘氨酸/谷胱甘肽s-转移酶细胞团块在适当的介质中的重量比包括在1g/kg与50g/kg之间。
[0158]
特别地，适当的介质包含葡萄糖。更特别地，葡萄糖/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在50g/kg与300g/kg之间。
[0159]
有利地，适当的介质包含fad。更特别地，fad/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.0002g/kg与0.02g/kg之间。
[0160]
特别地，适当的介质包含et004。更特别地，et004细胞团块/phbh细胞团块在适当的介质中的重量比包括在0.3g/kg与10g/kg之间。
[0161]
优选地，适当的介质具有包括在6与11之间、更优选在8与9之间的ph。
[0162]
优选地，使混合物ma与gst和phbh接触至少50小时。
[0163]
特别地，使混合物ma与gst和phbh在包括在20℃与45℃之间的温度下接触。
[0164]
因此，当步骤b)和步骤c)同时进行时，使混合物ma与gst和phbh优选地在包含谷胱甘肽、nadp、任选地葡萄糖、任选地fad、任选地et004的水性介质中，优选地在包括在6与11之间的ph下，优选地在包括在20℃与45℃之间的温度下接触，并且优选地接触至少50小时。
[0165]
特别地，步骤b)和步骤c)包括以下步骤：
[0166]-bc1)优选地依次向反应器中添加混合物ma、水、葡萄糖、谷胱甘肽、甘氨酸、nadp、fad、et004、phbh和gst，
[0167]-bc2)将步骤bc1)之后获得的混合物在包括在20℃与45℃之间的温度下搅拌至少96小时。
[0168]
步骤bc1)之后获得的混合物对应于以上提及的在适当的介质中与gst和phbh同时接触的混合物ma。
[0169]
在两个实施例中，将步骤c)之后获得的混合物均称为混合物mc。
[0170]
所得到的混合物mc具有包括在5与7之间的ph。
[0171]
1.4步骤d)
[0172]
步骤d)包括化学处理混合物mb或混合物mc，该化学处理包括使混合物mb或混合物mc与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。
[0173]
实际上，步骤d)在酶处理之后进行。
[0174]
酶处理可以包括进行步骤b)以获得混合物mb或者依次或同时进行步骤b)和步骤c)以获得混合物mc。
[0175]
因此，步骤d)可以在步骤b)之后进行。因而步骤d)包括化学处理混合物mb，该化学处理包括使混合物mb与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。在该实施例中，不进行步骤c)。
[0176]
可替代地，步骤d)可以在步骤c)之后进行。因而步骤d)包括化学处理混合物mc，该化学处理包括使混合物mc与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。在该实施例中，步骤b)和步骤c)依次或同时进行。
[0177]
特别地，在两个实施例中，强布朗斯台德碱选自碱金属和碱土金属的氢氧化物如氢氧化钠、氢氧化锂或氢氧化钾。优选地，强布朗斯台德碱是氢氧化钠。
[0178]
优选地，强布朗斯台德碱的浓度包括在0.1mol/l与10mol/l之间、更优选地在1mol/l与10mol/l之间。
[0179]
有利地，(强布朗斯台德碱的水溶液)/混合物mb的重量比或(包含强布朗斯台德碱的水溶液)/混合物mc的重量比包括在20g/g与1g/g之间。
[0180]
有利地，在每个实施例中，在步骤d)中，使混合物mb或混合物mc与包含强布朗斯台德碱的水溶液在包括在20℃与100℃之间的温度下、更有利地在60℃与100℃之间的温度下接触48小时至2周。
[0181]
2.轮次
[0182]
根据本发明的方法可以重现数次，优选地至少一次，更优选地至少两次。在这些重现中，步骤a)是任选的。
[0183]
本发明的方法可以重现在一次与30次之间、优选地在一次与20次之间、更优选地在一次与十次之间。
[0184]
根据本发明的方法的第一轮对应于：
[0185]
a)向溶剂中添加基于以下的环氧树脂r：
[0186]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0187]-至少一种固化剂r2，
[0188]
b)酶处理步骤a)之后获得的该混合物ma，该处理包括使该混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶接触以获得混合物mb的步骤，
[0189]
c)任选地与步骤b)同时酶处理混合物ma或者酶处理步骤b)之后获得的混合物mb，该处理包括使混合物ma或混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤，
[0190]
d)任选地化学处理混合物mb或混合物mc，该化学处理包括使混合物mb或混合物mc与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。
[0191]
可以使在进行根据本发明的方法的第一轮之后获得的混合物m1再次经受根据本发明的方法，并且因此替换步骤a)中的环氧树脂r或步骤b)中的混合物ma。然后进行根据本发明的方法的第二轮。
[0192]
因此，第二轮对应于：
[0193]
a)任选地向溶剂中添加在根据本发明的方法的第一轮之后获得的混合物m1，
[0194]
b)酶处理步骤a)之后获得的混合物ma’或第一轮之后获得的混合物m1，该处理包括使混合物ma’或混合物m1与谷胱甘肽s-转移酶接触以获得混合物mb’的步骤，
[0195]
c)任选地与步骤b)同时酶处理混合物ma’或m1或者酶处理步骤b)之后获得的混合物mb’，该处理包括使混合物ma’或m1或者混合物mb’与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc’的步骤，
[0196]
d)任选地化学处理混合物mb’或混合物mc’，该化学处理包括使混合物mb’或混合物mc’与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md’的步骤。
[0197]
在进行根据本发明的方法的第一轮之后获得的混合物m1可以是如以上所定义的混合物mb、混合物mc或混合物md。优选地，其对应于混合物md。
[0198]
有利地，然后使步骤d)之后获得的混合物md进一步经受如以上所定义的步骤b)至d)。
[0199]
可替代地，使步骤d)之后获得的混合物md进一步经受如以上所定义的步骤a)至d)。
[0200]
特别地，可以进行多于两轮，更特别地可以进行多于三轮。优选地，可以进行1至30轮、更优选2至20轮、甚至更优选2至10轮。
[0201]
有利地，可以进行一至十轮根据本发明的方法。
[0202]
3.环氧树脂
[0203]
根据本发明的方法旨在降解环氧树脂。
[0204]
在本发明的方法中使用的环氧树脂是基于：
[0205]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0206]-至少一种固化剂r2，
[0207]-任选地额外的化合物r3。
[0208]
当然，表述“基于以下的环氧树脂”应被理解为意指包含用于该组合物的各种基础成分的混合物和/或反应产物的环氧树脂，它们中的一些可以在环氧树脂、或者复合材料或包含此类复合材料的成品的制造的各个阶段的过程中，特别是在固化步骤的过程中，旨在至少部分地彼此或与它们的直接化学环境反应或能够反应。
[0209]
换句话说，环氧树脂r由至少一种如以下所描述的芳香族化合物r1和至少一种固化剂r2制造。
[0210]
有利地，环氧树脂r是基于一种芳香族化合物r1和一种固化剂r2。
[0211]
如本文关于有机化合物所用，术语“芳香族”意指包含一个或多于一个芳基部分的有机化合物，该芳基部分可各自任选地被一个或多个典型地选自氧、氮和硫杂原子的杂原子中断，并且一个或多于一个芳基部分的碳原子中的一个或多个可以任选地被一个或多个典型地选自烷基、烷氧基、羟烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳基、烷芳基、芳烷基的有机基团取代。
[0212]
如本文所用，术语“芳基”意指具有离域共轭π体系的环状、共平面的5元至14元有机基团，其中π电子的数目等于4n 2，其中n是0或正整数，该有机基团包括其中环成员中的每一个是碳原子的化合物，如苯，其中环成员中的一个或多个是典型地选自氧、氮和硫原子的杂原子的化合物，如呋喃、吡啶、咪唑和噻吩，以及稠合环体系，如萘、蒽和芴，其中这些环碳中的一个或多个可以被一个或多个典型地选自烷基、烷氧基、羟烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳基、烷芳基、卤素基团，例如像苯基、甲基苯基、三甲基苯基、壬基苯基、氯苯基或三氯甲基苯基的有机基团取代。
[0213]
如本文所用，“环氧基团”意指邻位环氧基团，即1,2-环氧基团。
[0214]
3.1.芳香族化合物r1
[0215]
环氧树脂r的第一种基本化合物是每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环的芳香族化合物r1。
[0216]
根据本发明的芳香族化合物r1每分子带有至少两个环氧基团，并且该至少两个环氧基团中的一个可以是来自由带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环携带的缩水甘油氧基的环氧基团。
[0217]
特别地，合适的芳香族化合物r1包括酚和多酚的聚缩水甘油醚如二缩水甘油基间苯二酚、1,2,2-四(缩水甘油氧基苯基)乙烷、或1,1,1-三(缩水甘油氧基苯基)甲烷，双酚的二缩水甘油醚如双酚a(双(4-羟基苯基)-2,2-丙烷)的二缩水甘油醚、双酚f(双(4-羟基苯
基)甲烷)的二缩水甘油醚、双酚c(双(4-羟基苯基)-2,2-二氯乙烯)的二缩水甘油醚、和双酚s(4,4'-磺酰基二苯酚)的二缩水甘油醚、包括其低聚物，芳香族醇的聚缩水甘油醚，环氧化酚醛清漆化合物，环氧化甲酚酚醛清漆化合物，氨基苯酚的聚缩水甘油醚如三缩水甘油氨基苯酚(tgap)、三缩水甘油氨基甲酚。
[0218]
优选地，合适的芳香族化合物r1包括已知的可商购的化合物，如对氨基苯酚的三缩水甘油醚(如来自亨斯迈公司(hunstman)的my 0510)；间氨基苯酚的三缩水甘油醚(如来自亨斯迈公司的my 0610)；基于双酚a的材料如2,2-双(4,4'-二羟基苯基)丙烷的二缩水甘油醚(如来自陶氏公司(dow)的der 661或来自迈图公司(momentive)的epon 828)；苯酚酚醛清漆树脂的缩水甘油醚(如来自陶氏公司的den 431或den 438)；二羟基二苯基甲烷的二缩水甘油基衍生物(如来自亨斯迈公司的py 306)。
[0219]
有利地，芳香族化合物r1对应于双酚的二缩水甘油醚如双酚a(双(4-羟基苯基)-2,2-丙烷)的二缩水甘油醚、双酚f(双(4-羟基苯基)甲烷)的二缩水甘油醚、双酚c(双(4-羟基苯基)-2,2-二氯乙烯)的二缩水甘油醚、以及双酚s(4,4'-磺酰基二苯酚)的二缩水甘油醚。
[0220]
特别地，芳香族化合物r1对应于双酚a二缩水甘油醚。
[0221]
3.2固化剂r2
[0222]
环氧树脂r的第二种基本化合物是固化剂r2。
[0223]
环氧树脂的固化剂是本领域技术人员所熟知的。
[0224]
其可以是胺如伯胺、仲胺、或叔胺、酮亚胺，聚酰胺树脂，咪唑衍生物，聚硫醇，酸酐，三氟化硼-胺的络合物，双氰胺，有机酰肼，光固化剂或紫外线固化剂。
[0225]
特别地，作为固化剂的胺是多胺。它可以是脂肪族多胺或芳香族胺。
[0226]
作为固化剂的合适的胺包括二亚乙基三胺(dta)、三亚乙基四胺(tta)、四亚乙基五胺(tepa)、二丙二胺(dpda)、二乙基氨基丙胺(deapa)、胺248、n-氨基乙基哌嗪(n-aep)、lamiron c-260、araldit hy-964、薄荷二胺(mda)、异佛尔酮二胺(ipda)、s cure 211、wandamin hm、1.3 bac、间二甲苯二胺(m-xda)、sho-amine x、胺黑(amine black)、sho-amine黑、sho-amine n、sho-amine 1001、sho-amine 1010、间苯二胺(mpda)、二氨基二苯甲烷(ddm)、二氨基二苯砜(dds)、4,4
’‑
亚甲基双(2,6-二乙基苯胺)。
[0227]
作为固化剂r2的合适的咪唑衍生物包括2-甲基咪唑、2-苯基-咪唑、3-苄基-2-甲基咪唑、5-甲基-2-苯基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、5-乙基-2-甲基咪唑或1-氰基乙基-2-十一烷基咪唑鎓偏苯三酸盐。
[0228]
作为固化剂r2的合适的酸酐包括邻苯二甲酸酐、偏苯三酸酐、均苯四酸酐、二苯甲酮三羧酸酐、乙二醇双偏苯三酸酯、三偏苯三酸甘油酯、马来酸酐、四氢邻苯二甲酸酐、内亚甲基四氢邻苯二甲酸酐、甲基内亚甲基四氢邻苯二甲酸酐、十二碳烯基琥珀酸酐、六氢邻苯二甲酸酐、六氢-4-甲基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、甲基环己烯二羧酸酐、烷基苯乙烯-马来酸酐共聚物、氯菌酸酐、聚壬二酸酐。
[0229]
优选地，固化剂r2选自伯胺和咪唑衍生物。
[0230]
3.3额外的化合物r3
[0231]
环氧树脂r还可以基于至少一种每分子具有至少两个环氧基团的环氧化合物。合适的环氧化合物包括芳香族环氧化合物、环氧化合物、脂环族环氧化合物、和环氧化合物。
[0232]
合适的芳香族环氧化合物包括每分子具有两个或更多个环氧基团的芳香族化合物，包括已知的化合物，例如像：酚和多酚的聚缩水甘油醚，如二缩水甘油基间苯二酚、1,2,2-四(缩水甘油基氧基苯基)乙烷、或1,1,1-三(缩水甘油基氧基苯基)甲烷，双酚a(双(4-羟基苯基)-2,2-丙烷)、双酚f(双(4-羟基苯基)甲烷)、双酚c(双(4-羟基苯基)-2,2-二氯乙烯)和双酚s(4,4'-磺酰基二酚)的二缩水甘油醚，包括其低聚物、带有芴环的环氧化合物、带有萘环的环氧化合物、二环戊二烯改性的酚环氧化合物、环氧化的酚醛清漆化合物、和环氧化的甲酚酚醛清漆化合物，胺的聚缩水甘油基加合物，如n,n-二缩水甘油基苯胺、n,n,n
′
,n
′‑
四缩水甘油基二氨基二苯基甲烷(tgddm)、三缩水甘油基氨基苯酚(tgap)、三缩水甘油基氨基甲酚、或四缩水甘油基二甲苯二胺，或氨基醇，如三缩水甘油基氨基苯酚，多元羧酸的聚缩水甘油基加合物，如邻苯二甲酸二缩水甘油酯，氰尿酸聚缩水甘油酯，如氰尿酸三缩水甘油酯，(甲基)丙烯酸缩水甘油酯与可共聚的乙烯基化合物的共聚物，如苯乙烯甲基丙烯酸缩水甘油酯。
[0233]
每分子具有两个或更多个环氧基团的合适的环氧化合物包括已知的可商购的化合物，如n,n,n',n'-四缩水甘油基二氨基二苯甲烷(如来自亨斯迈公司的my 9663、my 720、和my 721)、n,n,n',n'-四缩水甘油基-双(4-氨基苯基)-1,4-二异丙基苯(如来自迈图公司的epon 1071)；n,n,n',n'-四缩水甘油基-双(4-氨基-3,5-二甲基苯基)-1,4-二异丙基苯(如来自迈图公司的epon 1072)；对氨基苯酚的三缩水甘油醚(如来自亨斯迈公司的my 0510)；间氨基苯酚的三缩水甘油醚(如来自亨斯迈公司的my 0610)；基于双酚a的材料如2,2-双(4,4'-二羟基苯基)丙烷的二缩水甘油醚(如来自陶氏公司的der 661或来自迈图公司的epon 828，以及优选在25℃下粘度为8-20pa
·
s的酚醛清漆树脂；苯酚酚醛清漆树脂的缩水甘油醚(如来自陶氏公司的den 431或den 438)；基于二环戊二烯的苯酚酚醛清漆(如来自亨斯迈公司的556)；1,2-邻苯二甲酸二缩水甘油酯；二羟基二苯基甲烷的二缩水甘油基衍生物(如来自亨斯迈公司的py 306)。
[0234]
每分子具有两个或更多个环氧基团的合适的脂环族环氧化合物包括已知的化合物，例如像双(2,3-环氧-环戊基)醚、双(2,3-环氧-环戊基)醚与乙二醇的共聚物、二环戊二烯二环氧化物、4-乙烯基环己烯二氧化物、3,4-环氧环己基甲基、3,4-环氧环己烷羧酸酯、1,2,8,9-二环氧柠檬烯(二氧化柠檬烯)、3,4-环氧-6-甲基-环己基甲基、3,4-环氧-6-甲基环己烷羧酸酯、双(3,4-环氧-6-甲基环己基甲基)己二酸酯、2-(7-氧杂二环[4.1.0]庚-3-基)螺[1,3-二噁烷-5,3'-[7]氧杂二环[4.1.0]庚烷]、烯丙基环戊烯基醚的二环氧化物、1,4-环己二烯二环氧化物、1,4-环己烷甲醇二缩水甘油醚、双(3,4-环氧环己基甲基)己二酸酯、3,4-环氧-6-甲基环己烷羧酸酯、二缩水甘油基1,2-环己烷羧酸酯、3,4-环氧环己基甲基甲基丙烯酸酯、3-(环氧乙烷-2-基)-7-氧杂二环[4.1.0]庚烷、双(2,3-环氧丙基)环己-4-烯-1,2-二羧酸酯、4,5-环氧四氢邻苯二甲酸二缩水甘油酯、聚[氧基(环氧乙烷基-1,2-环己烷二基)]α-氢-ω-羟基-醚、二-7-氧杂二环[4.1.0]庚烷。
[0235]
每分子具有两个或更多个环氧基团的合适的脂肪族环氧化合物包括已知化合物，例如像：丁二醇二缩水甘油醚、环氧化聚丁二烯、二氧化二戊烯、三羟甲基丙烷三缩水甘油醚、双[2-(2-丁氧基乙氧基)乙基)乙基]己二酸酯、己二醇二缩水甘油醚和氢化双酚a环氧树脂。
[0236]
合适的脂环族环氧化合物和脂肪族环氧化合物包括已知的可商购的化合物，例如
像：3',4'-环氧环己烷甲基-3,4-环氧环己基羧酸酯(celloxidetm 2021p树脂(大赛璐株式会社(daicel corporation))和aradite cy 179(亨斯迈先进材料公司(huntsman advanced materials))、二-7-氧杂二环[4.1.0]庚烷(celloxidetm 8010(大赛璐株式会社))、聚[氧基(环氧乙烷基-1,2-环己烷二基)],α-氢-ω-羟基-醚与2-乙基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇的3:1混合物(ehpe 3150(大赛璐株式会社))。
[0237]
环氧树脂可以任选地进一步基于一种或多种每分子具有一个环氧基团的单环氧化合物，其选自芳香族单环氧化合物、单脂环族环氧化合物、和脂肪族单环氧化合物。合适的单环氧化合物包括已知的化合物，例如像：饱和的脂环族单环氧化物如3,3'-双(氯甲基)氧杂环丁烷、氧化异丁烯、氧化苯乙烯，烯属单环氧化物如环十二碳二烯单环氧化物、3,4-环氧-1-丁烯。
[0238]
4.用途
[0239]
本发明还涉及谷胱甘肽s-转移酶、特别是产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌菌株的谷胱甘肽s-转移酶用于降解基于以下的环氧树脂r的用途：
[0240]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0241]-至少一种固化剂r2。
[0242]
谷胱甘肽s-转移酶是如以上在段落“步骤b)”中所描述的。
[0243]
环氧树脂r对应于如在本发明的方法中使用的环氧树脂并且如以上在段落“环氧树脂”中所描述的。
[0244]
另外，本发明涉及对羟基苯甲酸羟化酶、优选产生自绿脓杆菌的对羟基苯甲酸羟化酶、更优选呈现出如在seq id no.1中所示出的肽序列的突变的对羟基苯甲酸羟化酶用于降解基于以下的环氧树脂r的用途：
[0245]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0246]-至少一种固化剂r2。
[0247]
对羟基苯甲酸羟化酶是如以上段落“步骤c)”中所描述的。
[0248]
环氧树脂r对应于如本发明的方法中使用的环氧树脂并且如以上在段落“环氧树脂”中所描述的。
[0249]
5.用于回收复合材料的方法
[0250]
本发明涉及一种用于回收复合材料的方法，该方法包括以下步骤：
[0251]
a’)提供包含基于以下的环氧树脂r的复合材料cm：
[0252]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0253]-至少一种固化剂r2，
[0254]
b’)处理步骤a’)之后获得的复合材料cm，该处理包括用根据本发明的方法降解该环氧树脂r的步骤，在这种情况下步骤a)中的该环氧树脂r是该复合材料cm，
[0255]
c’)步骤b’)之后获得环氧树脂含量减少的复合材料。
[0256]
因此，在步骤b’)中，降解环氧树脂r的步骤对应于：
[0257]
a)向溶剂中添加包含根据本发明的环氧树脂r的复合材料以获得混合物ma，
[0258]
b)酶处理步骤a)之后获得的该混合物ma，该处理包括使该混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶接触以获得混合物mb的步骤，
[0259]
c)任选地与步骤b)同时酶处理混合物ma或者酶处理步骤b)之后获得的混合物mb，该处理包括使混合物ma或混合物mb与对羟基苯甲酸羟化酶接触以获得混合物mc的步骤，
[0260]
d)任选地化学处理混合物mb或混合物mc，该化学处理包括使混合物mb或混合物mc与包含强布朗斯台德碱的水溶液接触以获得混合物md的步骤。
[0261]
复合材料是由两种或更多种具有显著不同物理或化学特性的成分材料制成的材料，当将该两种或更多种成分材料组合时，产生具有与单独组分不同的特征的材料。因此，典型地，复合材料包含基质和增强物。
[0262]
在本发明中，复合材料包含增强物和包含至少一种如以上所描述的环氧树脂r的基质。
[0263]
增强物优选地是增强纤维。它可以是无机、有机或植物纤维，尤其是玻璃纤维或碳纤维。更优选地，增强物是碳纤维。
[0264]
该基质包含至少一种如以上所描述的环氧树脂r。因此，该基质可以包含一种或多种如以上所描述的环氧树脂。
[0265]
该基质还可以包含其他热固性树脂，如不饱和的聚酯、聚乙烯酯、酚醛树脂和聚氨酯。
[0266]
该基质还可以包含另一种基于至少一种如以上所描述的额外的化合物r3和至少一种如以上所描述的固化剂r2的环氧树脂。
[0267]
该基质还可以包含热塑性树脂，如聚醚酰亚胺(pei)、聚醚砜(pes)、聚砜、聚酰胺酰亚胺(pai)、聚酰胺(pa)、聚酰亚胺、聚苯硫醚(pps)、聚醚醚酮(peek)、聚烯烃或其组合。
[0268]
有利地，该基质包含聚酰胺颗粒、聚酰亚胺颗粒或其组合。
[0269]
特别地，该基质包含聚醚酰亚胺、聚醚砜或其组合。这些热塑性树脂可以用作增韧剂。因而该基质是热塑性增韧环氧树脂。
[0270]
该基质还可以包含增强或促进环氧树脂固化的促进剂。
[0271]
该基质可以包含性能改性剂如核壳橡胶、阻燃剂、润湿剂、颜料、染料、uv吸收剂、填料、导电颗粒和粘度调节剂。
[0272]
优选地，环氧树脂是该基质的主要成分。更优选地，它代表至少50wt.％的基质。
[0273]
如以上段落“轮次”中所描述的，在进行了根据本发明的用于降解环氧树脂的方法的第一轮后，可以使步骤b’)之后获得的混合物再次经受根据本发明的用于降解环氧树脂的方法，并且因此替换步骤b’)中的复合材料cm。然后进行根据本发明的方法的第二轮。可以以这种方式进行多轮。
[0274]
因而用于回收复合材料的方法包括以下步骤：
[0275]
a’)提供包含基于以下的环氧树脂r的复合材料cm：
[0276]-至少一种芳香族化合物r1，该化合物每分子带有至少两个环氧基团并且包含至少一个带有至少一个缩水甘油氧基的芳香族环，以及
[0277]-至少一种固化剂r2，
[0278]
b1’)处理步骤a’)之后获得的复合材料cm，该处理包括用根据本发明的方法降解该环氧树脂r的步骤，在这种情况下步骤a)中的该环氧树脂r是该复合材料cm，
[0279]
b2’)通过处理在步骤b1’)之后获得的环氧树脂含量减少的复合材料来重复步骤b1’)，该处理包括用根据本发明的方法降解环氧树脂r的步骤，在这种情况下步骤a)中的环氧树脂r是步骤b1’)之后获得的环氧树脂含量减少的复合材料，
[0280]
c’)步骤b’)之后获得环氧树脂含量减少的复合材料。
[0281]
有利地，复合材料cm包含碳纤维。因此，在步骤c’)中，获得了环氧树脂含量减少的复合材料并且可以将碳纤维分离。
[0282]
根据本发明的用于回收复合材料的方法因而允许从复合材料中回收碳纤维。
[0283]
实例
[0284]
实例中测试的环氧树脂如下：
[0285]
树脂r1是通过双酚a二缩水甘油醚(也记为badge或dgeba)在4,4
′‑
亚甲基双(2,6-二乙基苯胺)的存在下聚合来获得，并且具有以下一般结构：
[0286][0287]
树脂r2是通过双酚a二缩水甘油醚(也记为badge或dgeba)在咪唑衍生物(5-乙基-2-甲基咪唑)的存在下聚合来获得，并且具有以下一般结构：
[0288][0289]
在实例中，gst作为裂解的表达gst的细菌的肉汤添加。它遵循以下方法产生：
[0290]
1.生长表达gst的菌株并离心以获得细胞团块；
[0291]
2.将细胞团块与磷酸盐缓冲液(0.1m ph＝7.0)以1g(团块)/10ml(缓冲液)的比例混合；
[0292]
3.通过在磷酸盐缓冲液中超声裂解细胞以获得含有gst的肉汤。
[0293]
在实例中，phbh作为裂解的表达phbh的细菌的肉汤添加。它遵循以下方法产生：
[0294]
1.生长表达phbh的菌株并离心以获得细胞团块；
[0295]
2.将细胞团块与磷酸盐缓冲液(0.1m ph＝7.0)以1g(团块)/10ml(缓冲液)的比例混合；
[0296]
3.通过在磷酸盐缓冲液中超声裂解细胞以获得含有phbh的肉汤。
[0297]
在实例中，et004作为裂解的表达et004的细菌的肉汤添加。它遵循以下方法产生：
[0298]
1.生长表达et004的菌株并离心以获得细胞团块；
[0299]
2.将细胞团块与磷酸盐缓冲液(0.1m ph＝7.0)以1g(团块)/10ml(缓冲液)的比例混合；
[0300]
3.通过在磷酸盐缓冲液中超声裂解细胞以获得含有et004的肉汤。
[0301]
a-步骤a)将环氧树脂添加至溶剂中
[0302]
该步骤旨在使环氧树脂溶胀并潜在地解交联，以便改善在后续步骤中使用的酶对关键键位的可及性。
[0303]
首先，已经测试了一系列的溶剂(水、na2hpo4的水溶液、h3po4的水溶液、氨的水溶液、乙酸、dmso、dmf、己烷和苯酚)。
[0304]
该测试包括将环氧树脂r1或r2在室温下以0,1g/1ml的树脂/溶剂比例用溶剂浸泡80天。进行这些初步测定以评估一旦暴露于这些溶剂中的材料的行为。
[0305]
选择na2hpo4的水溶液不仅是因为其促进树脂的改性的能力，还因为其操作安全、便宜并且可以回收。
[0306]
已经研究了在步骤a)之后获得的混合物以评估在该步骤期间发生了什么。
[0307]
因此，已经如下针对树脂r2进行了步骤a)：
[0308]
第1步：制备0.21g树脂r2 20.56g na2hpo4*12h2o(m.w.358.14g/mol)的溶液。添加98.05g h2o，在90℃下搅拌1h；
[0309]
第2步：将来自前述步骤的溶液在80℃下在真空下蒸发直至混合物重量从119g变为55g；
[0310]
第3步：将前述浓缩的溶液用300g的去离子h2o在90℃下稀释；
[0311]
第4步：在80℃下在真空下蒸发，直至混合物的重量减少至44g。此后，在90℃下添加456g的水。
[0312]
第5步：将来自前述步骤的溶液离心以便获得淡黄色上清液和两种固体：一种呈淡黄色并且与原始树脂类似，并且另一种呈灰色、易碎且不透明。
[0313]
通过对所得到的混合物进行hplc和ms分析，观察到第一步骤a)导致树脂的降解。尤其可以识别出由树脂的磷酸化和/或树脂的醚键断裂得到的产物。
[0314]
b-步骤b)通过使混合物ma与谷胱甘肽s-转移酶接触来进行酶处理
[0315]
在对树脂r1和树脂r2进行步骤a)并且分别获得了ma1和ma2之后，根据以下描述的方法进行步骤b)，以便评估产生自嗜芳烃新鞘氨醇菌菌株并且命名为“nalige”的酶的活性。
[0316]
乙基香兰素也与ma1和ma2一起作为模型进行了测试。
[0317]
步骤a)混合物ma1和ma2的制备：
[0318]
第1步：在60℃下制备1.98g树脂 50.65g去离子h2o； 90.00g na2hpo4.12h2o、 189g去离子h2o的溶液，直至na2hpo4.12h2o盐完全溶解；
[0319]
第2步：将来自前述步骤的溶液在80℃下在真空下蒸发以去除水，然后添加300g的去离子h2o，然后再次蒸发直至水完全去除；
[0320]
第3步：重复第2步；
[0321]
第4步：在90℃下向步骤3之后获得的干固体添加去离子h2o；
[0322]
第5步：将9.96g的β-环糊精添加至前述溶液(总重量142g)中，并混合；
[0323]
第6步：在90℃下搅拌混合物两天；
[0324]
第7步：稀释混合物以获得200ml的体积；
[0325]
对树脂r1进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma1。
[0326]
对树脂r2进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma2。
[0327]
表a
[0328][0329]
根据表a，向合适体积的反应器中，以以下顺序添加以下组分：第1：底物(乙基香兰素或ma1或ma2)；第2：naoh的水溶液3m；第3：谷胱甘肽；第4：甘氨酸；第5：gst酶。将反应在25℃/220rpm下在5天的期间内进行。对样品进行hplc分析以进行色谱图比较(在0h、16h、40h、66h和120h的时间处采集样品)。
[0330]
hplc表征条件：
[0331]
(1)流动相
[0332]
溶液a：甲醇；
[0333]
溶液b：ddh2o中的1％甲酸；
[0334]
a:b比率＝35％:65％
[0335]
(2)柱：agilent c18，250mm*4.6mm
[0336]
(3)检测波长：280nm
[0337]
(4)柱温度：25℃
[0338]
(5)流速：1ml/min
[0339]
结果：
[0340]
通过hplc色谱法，随着时间推移观察到混合物ma1和ma2二者的峰的演变。在0小时处观察到在2.7min、3.1min和3.5min处的三个主要峰。2.7min处的峰值随时间增加，表明在用gst酶处理期间混合物进一步降解。
[0341]
推测谷胱甘肽s-转移酶的作用机制是芳基醚键的断裂。通过用乙基香兰素进行以下模型反应来证实:
[0342][0343]
通过hplc确实观察到乙基香兰素底物的消耗。
[0344]
用谷胱甘肽s-转移酶进行酶处理的步骤b)导致树脂的部分寡聚化。
[0345]
c-步骤c)通过使混合物ma与对羟基苯甲酸羟化酶接触进行酶处理
[0346]
在对树脂r1和树脂r2进行步骤a)并且分别获得了混合物ma1和ma2后，根据以下方法进行步骤c)，以便评估以下产生自绿脓杆菌的突变酶的活性：
[0347]-m010-2(产生自绿脓杆菌的l199v和y385f突变酶)，
[0348]-m012-2(产生自绿脓杆菌的l199g、y385f突变酶)，
[0349]-ym322-2(产生自谷氨酸棒状杆菌的l200v、y385f、d39y突变酶)以及
[0350]-m020-1(产生自谷氨酸棒状杆菌的野生型酶)。
[0351]
步骤a)混合物ma1和ma2的制备：
[0352]
第1步：在60℃下制备1.98g树脂 50.65g去离子h2o； 90.00gna2hpo4.12h2o、 189g去离子h2o的溶液，直至na2hpo4.12h2o盐完全溶解；
[0353]
第2步：在80℃下在真空下蒸发以去除水，然后添加300g的去离子h2o，然后再次蒸发直至水完全去除。
[0354]
第3步：重复第2步；
[0355]
第4步：在90℃下向干固体添加去离子h2o；
[0356]
第5步：将9.96g的β-环糊精添加至前述溶液(总重量142g)中，并混合；
[0357]
第6步：在90℃下搅拌混合物两天；
[0358]
第7步：将混合物稀释至200ml；
[0359]
对树脂r1进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma1。
[0360]
对树脂r2进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma2。
[0361]
表b
[0362]
[0363]
根据表b，在合适体积的反应器中，以以下顺序添加以下组分：第1底物(步骤a的步骤7之后获得的ma1或ma2)、第2葡萄糖、第3nadp、第4fad、第5et004和第6phbh。将反应在35℃/220rpm下进行98小时。对样品进行hplc分析以进行色谱图比较(在0h、30h、96h的时间处采集样品)。
[0364]
hplc测定条件：
[0365]
(1)流动相
[0366]
溶液a：甲醇；
[0367]
溶液b：ddh2o中的1％磷酸；
[0368]
a:b＝30％:70％
[0369]
(2)柱：agilent c18，250mm*4.6mm
[0370]
(3)检测波长：210nm
[0371]
(4)柱温度：25℃
[0372]
(5)流速：1ml/min
[0373]
结果：
[0374]
通过hplc色谱法，随着时间推移观察到混合物ma1和ma2二者的峰的演变，表明在用phbh酶处理期间混合物进一步降解。特别地，用m010-2酶处理ma1观察到最有趣的结果，通过hplc示出了随着时间推移在3.5min和4.2min处的峰值显著增加(参见表1和表2)。
[0375]
表1-树脂r1
[0376][0377]
[0378]
表2-树脂r2
[0379][0380]
推测对羟基苯甲酸羟化酶(phbh)的作用机制是芳基环的羟基化。通过进行以下模型反应来证实：
[0381]
a.模型反应1-用3,4-二羟基苯甲酸作为底物：
[0382][0383]
b.模型反应2-用双酚a(bfa)作为底物：
[0384][0385]
d-通过同时进行步骤b)和步骤c)进行酶处理
[0386]
步骤a)：
[0387]
(1)制备1.98g树脂 50.65g去离子h2o； 90.00g na2hpo4.12h2o、 189g去离子h2o的溶液，在60℃下混合直至na2hpo4.12h2o盐完全溶解；
[0388]
(2)将来自前述步骤的溶液在80℃下在真空下蒸发以去除水，然后添加约300g的去离子h2o，然后再次蒸发直至水完全去除；
[0389]
(3)再次重复第2步骤；
[0390]
(4)在90℃下向步骤3之后获得的干固体添加去离子h2o；
[0391]
(5)将9.96g的β-环糊精添加至步骤4之后获得的混合物(总重量142g)中，并混合；
[0392]
(6)在90℃下搅拌混合物两天；
[0393]
(7)稀释混合物以获得200ml的体积；
[0394]
对树脂r1进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma1。
[0395]
对树脂r2进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma2。
[0396]
步骤b)和步骤c)：
[0397]
表c
[0398][0399]
根据表c，将化合物以以下顺序添加至合适的反应器中：第1底物(混合物ma1或ma2)、第2 naoh的水溶液(ph 9)、第3葡萄糖、第4还原的谷胱甘肽(gsh)、第5甘氨酸、第6 nadp、第7 fad、第8 et004、第9 phbh和第10 gst。将反应介质搅拌直至达到均匀。将反应在30℃/220rpm下进行72-96h。将反应介质在0h、20h、48h、72h和96h处采样。也进行其中不使用酶的对照实验。
[0400]
对ma1进行步骤b)和步骤c)之后获得的混合物记为mc1。
[0401]
对ma2进行步骤b)和步骤c)之后获得的混合物记为mc2。
[0402]
对ma1进行没有酶的实验之后获得的混合物记为mc1-ctrl。
[0403]
对ma2进行没有酶的实验之后获得的混合物记为mc2-ctrl。
[0404]
hplc试验条件
[0405]
(1)流动相
[0406]
溶液a：甲醇；
[0407]
溶液b：ddh2o中的1％磷酸；
[0408]
a:b＝30％:70％
[0409]
(2)柱：agilent c18，250mm*4.6mm
[0410]
(3)检测波长：210nm
[0411]
(4)柱温度：25℃
[0412]
(5)流速：1ml/min
[0413]
表3
[0414][0415]
以上表3示出了酶gst和phbh存在的影响以及当它们同时使用时的效果。峰面积根据时间的演变示出，对于衍生自树脂r1和r2并用gst和phbh处理的混合物mc1和mc2在特定保留时间中逃逸或共逃逸的分子种类的富集。相反，未经酶处理的树脂r1和r2样品(mc1-ctrl和m2-ctrl)几乎什么也没发生。
[0416]
e-放大
[0417]
步骤a)
[0418]
第1步：制备10.04g树脂r1 102.08g去离子h2o； 100.01g na2hpo4.12h2o的溶液，在60℃下混合直至na2hpo4.12h2o盐完全溶解；
[0419]
第2步：将来自前述步骤的溶液在80℃下在真空下蒸发以去除水，然后添加约300g的去离子h2o，然后再次蒸发直至水完全去除；
[0420]
第3步：重复第2步；
[0421]
第4步：在90℃下向步骤3之后获得的干固体添加去离子水；
[0422]
第5步：将50.72g的β-环糊精添加至前述溶液中，并混合；
[0423]
第6步：在90℃下搅拌混合物两天；
[0424]
第7步：稀释混合物以在反应器中获得约1200ml的体积；
[0425]
将第7步材料稀释之后获得的肉汤实际用于研究树脂r2和r2的降解。
[0426]
对树脂r1进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma1。
[0427]
对树脂r2进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma2。
[0428]
步骤b)和步骤c)
[0429]
表d
[0430][0431]
根据表d，将化合物以以下顺序添加至5l的反应器中：第1底物(ma1或ma2)、第2 naoh 3m、第3葡萄糖、第4 gsh、第5甘氨酸、第6 nadp、第7 fad、第8 et004、第9 phbh和第10 gst。将反应介质在200rpm下搅拌直至达到均匀。将压缩空气以1l/min的速率泵入反应器中。将反应在30℃/200rpm下进行66h。将获得的混合物过滤并干燥。
[0432]
起始自ma1，将获得的干燥的混合物记为mc1。
[0433]
起始自ma2，将获得的干燥的混合物记为mc2。
[0434]
对ma1进行没有酶的实验之后获得的混合物记为mc1-ctrl。
[0435]
对ma2进行没有酶的实验之后获得的混合物记为mc2-ctrl。
[0436]
表4-树脂r1
[0437][0438]
表5-树脂r2
[0439][0440]
表4和表5示出了，当用gst和phbh处理树脂r1和r2二者时，观察到材料的损失。
[0441]
步骤d)
[0442]
将干燥的混合物mc1和mc2取样(大约1g的质量)并用2m naoh水溶液在90℃下在搅拌下处理96h(4天)。然后将混合物过滤、洗涤并在90℃下干燥5小时，并将质量损失登记在以下表6中。
[0443]
起始自mc1，将获得的干燥的混合物记为md1。
[0444]
起始自mc2，将获得的干燥的混合物记为md2。
[0445]
对ma1进行没有酶的实验之后获得的混合物记为md1-ctrl。
[0446]
对ma2进行没有酶的实验之后获得的混合物记为md2-ctrl。
[0447]
表6
[0448][0449]
与未经处理的树脂r1和r2相比，经化学酶处理的树脂r1和r2对naoh的作用更敏感、损失的质量更高。化学酶处理负责提高r1和r2部分在碱性介质中的溶解度。
[0450]
f-两轮根据本发明的方法
[0451]
第1轮：
[0452]-步骤a)
[0453]
(1)制备1.98g树脂r2 50.65g ddh2o； 90.00g na2hpo4.12h2o、 189g ddh2o的溶液，在60℃下混合直至na2hpo4.12h2o盐完全溶解；
[0454]
(2)在80℃下在真空下蒸发以去除水，然后添加约300g的去离子水，然后再次蒸发直至水完全去除；
[0455]
(3)重复第2步；
[0456]
(4)在90℃下向干固体添加去离子水；
[0457]
(5)将9.96g的β-环糊精添加至前述溶液(总重量142g)中，并混合；
[0458]
(6)在90℃下搅拌混合物两天；
[0459]
(7)将混合物稀释至200ml；
[0460]
(8)使树脂r1进行(1)-(7)的相同处理。
[0461]
对树脂r1进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma1。
[0462]
对树脂r2进行步骤1至7之后获得的混合物记为ma2。
[0463]-步骤b)和步骤c)
[0464]
表e
[0465][0466]
根据表e，将化合物以以下顺序添加至合适的反应器中：第1底物(ma1或ma2)、第2 naoh 3m、第3葡萄糖、第4 gsh(gst酶的底物)、第5甘氨酸、第6 nadp(辅因子)、第7 fad(辅因子)、第8 et004(酶)、第9 phbh(酶)和第10 gst(酶)。将反应介质搅拌直至达到均匀。将反应在30℃/220rpm下进行72-96h。
[0467]
(1)将所得到的混合物倾析并且去除上清液。
[0468]
(2)添加水，再次倾析，然后去除上清液。
[0469]
(3)重复步骤(2)直至上清液澄清。
[0470]
(4)去除上清液。
[0471]
起始自ma1，将获得的混合物记为mc1。
[0472]
起始自ma2，将获得的混合物记为mc2。
[0473]-步骤d)
[0474]
(1)将50ml的2m naoh溶液添加至混合物mc1或mc2中；
[0475]
(2)在90℃下搅拌混合物4天；
[0476]
(3)将上清液从混合物中去除，并且将固体用水洗涤三次。
[0477]
起始自mc1，将获得的混合物记为md1。
[0478]
起始自mc2，将获得的混合物记为md2。
[0479]
还进行了没有酶phbh和gst的对照实验。
[0480]
第2轮：
[0481]-在第2轮中的酶处理(步骤b和c)：
[0482]
将来自第1轮的固体以以下顺序与其他化学品和酶再次混合：第1底物(来自第1轮的md1)、第2 naoh 3m、第3葡萄糖、第4 gsh、第5甘氨酸、第6 nadp、第7 fad、第8 et004、第9 phbh和第10 gst。将反应介质搅拌直至达到均匀。将反应在30℃、220rpm下进行120h(5天)。
[0483]
(1)将所得到的混合物倾析并且去除上清液。
[0484]
(2)添加水，再次倾析，然后去除上清液。
[0485]
(3)重复步骤(2)直至上清液澄清。
[0486]
(4)去除上清液。
[0487]
起始自md1，将获得的混合物记为mc1’。
[0488]-在第2轮中的naoh处理(步骤d)：
[0489]
(1)将50ml的2m naoh溶液添加至mc1’中；
[0490]
(2)在90℃下搅拌混合物4天；
[0491]
(3)将上清液从混合物中去除，并且将固体用水洗涤三次；
[0492]
(4)在70℃下将固体干燥。
[0493]
起始自mc1’，将获得的混合物记为md1’。
[0494]
表7
[0495] 重量损失对照r12％r1-第1轮后31％r1-第2轮后53％
ꢀꢀ
对照r24％r2-第1轮后24％