3-AP在制备抑制痘病毒的药物中的应用

3-ap在制备抑制痘病毒的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及3-ap在制备抑制痘病毒的药物中的应用。


背景技术：

2.猴痘病毒(monkeypox virus,mpv)属于痘病毒科(poxviridae)，脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)，正痘病毒属(orthopoxvirus)，mpv是线性双链dna病毒，编码超过200条基因，基因大小从130-300kbp不等，其两条dna两端通过倒置的末端重复序列和发卡环结构相连。mpv可感染多种节肢动物，尚不清楚其自然宿主。猴痘通过密切接触感染动物的血液、体液、皮肤或者黏膜伤口、沾有猴痘病毒的物质传给人类。猴痘的人际传播可以通过破损伤口、体液、呼吸飞沫、床单等进行。要通过呼吸道飞沫进行传播，需要长时间的面对面接触，这就给一些需要与患者密切接触的同事、家庭成员等带来一定感染风险。目前人际传播有记录的最长传播链是6-9人，这也解释了停止接种牛痘疫苗后，群体抗猴痘免疫力下降的原因。猴痘还可以通过胎盘传给胎儿，或者通过亲密接触传给婴儿。猴痘的临床表现类似于天花，但是它比天花的传染性弱，临床表现也比较轻。猴痘患者会出现发烧、红疹、淋巴结肿大，有时也出现其他的医疗并发症。猴痘通常是一种自限性疾病，症状一般会持续2-4周，有时也会出现病情严重的病例，目前病死率为3-6％。另外，性接触也是猴痘传播的一个重要渠道。截至2022年9月28日太平洋夏令时17时，世卫组织共接到了了67556例实验室确诊病例、3193例可能病例报告，包括27例死亡报告。世卫组织将全球风险评估为中度。目前欧洲药物局(ema)已经批准了一款针对天花的抗病毒药tecovirimat，该药目前还未广泛使用，且缺乏更多临床数据证实其安全性和有效性。目前也没有报导相关抗痘病毒的广谱药物。因此，筛选对痘病毒具有广谱效果的药物有望减少人民群众的生命财产损失。
3.3-ap(triapine)是一种核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，rr)的m2亚基抑制剂，是有效的放射致敏剂，处于临床三期。目前没有其应用抗病毒方面的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供3-ap(triapine)的药物新用途。
5.第一方面，本发明要求保护a1)3-ap，或a2)3-ap药学上可接受的盐，或a3)以3-ap或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：
6.(a1)制备用于抑制痘病毒活性的产品；
7.(a2)抑制痘病毒活性。
8.第二方面，本发明要求保护a1)3-ap，或a2)3-ap药学上可接受的盐，或a3)以3-ap或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：
9.(b1)制备用于抗痘病毒感染的产品；
10.(b2)抗痘病毒感染。
11.第三方面，本发明要求保护a1)3-ap，或a2)3-ap药学上可接受的盐，或a3)以3-ap
或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：
12.(c1)制备用于预防和/治疗由痘病毒感染所致疾病的产品；
13.(c2)预防和/治疗由痘病毒感染所致疾病。
14.第四方面，本发明要求保护a1)3-ap，或a2)3-ap药学上可接受的盐，或a3)以3-ap或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：
15.(d1)制备痘病毒抑制剂；
16.(d2)作为痘病毒抑制剂。
17.第五方面，本发明要求保护一种产品。
18.本发明所要求保护的产品，其活性成分为3-ap或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：
19.(a1)抑制痘病毒活性；
20.(a2)抗痘病毒感染；
21.(a3)预防和/治疗由痘病毒感染所致疾病。
22.本发明中所述产品具体可为药品。
23.需要的时候，在上述药品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
24.上述药品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
25.上述药品可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
26.第六方面，本发明要求保护一种痘病毒抑制剂。
27.本发明所要求保护的痘病毒抑制剂，其活性成分为3-ap或其药学上可接受的盐。
28.在上述各方面中，所述痘病毒为可致人生病以及动物生病的痘病毒，所述痘病毒为正痘病毒属病毒，优选猕猴痘病毒，阿赫梅塔痘病毒，骆驼痘病毒，牛痘病毒，鼠痘病毒，猴痘病毒，浣熊痘病毒，臭鼬痘病毒，沙鼠痘病毒，痘苗病毒，天花病毒，田鼠痘病，更优选猴痘病毒、牛痘病毒、天花病毒和痘苗病毒。
29.在上述各方面中，所述产品均可为药品。
30.第七方面，本发明要求保护一种抑制痘病毒活性的方法。
31.本发明所要求保护的抑制痘病毒活性的方法，是使用3-ap或其药学上可接受的盐或以3-ap或其药学上可接受的盐为活性成分的物质抑制痘病毒活性。
32.其中，所述痘病毒为可致人生病以及动物生病的痘病毒，所述痘病毒为正痘病毒属病毒，优选猕猴痘病毒，阿赫梅塔痘病毒，骆驼痘病毒，牛痘病毒，鼠痘病毒，猴痘病毒，浣熊痘病毒，臭鼬痘病毒，沙鼠痘病毒，痘苗病毒，天花病毒，田鼠痘病，更优选猴痘病毒、牛痘病毒、天花病毒和痘苗病毒。
33.在所述方法中，所述3-ap或其药学上可接受的盐或以3-ap或其药学上可接受的盐为活性成分的物质的用量不小于其对待抑制的所述痘病毒的最小抑制浓度。
34.所述方法为非疾病诊断治疗方法。如作为阳性对照用于开发痘病毒敏感药物。
35.在上述各方面中，所述3-ap的结构式如式i所示：
[0036][0037]
本发明的发明人经过广泛而深入的研究，通过对已报导的药物进行筛选，得到一个痘病毒小分子抑制剂3-ap，本发明首次证明该抑制剂能够在低细胞毒性的情况下有效抑制痘病毒。本发明对于痘病毒的有效防治具有重要意义。
附图说明
[0038]
图1为3-ap化学结构式。
[0039]
图2为mpvr2凝胶过滤层析。
[0040]
图3为monkeypox virus\cowpox virus\variola virus\vaccinia virus的核糖核苷酸还原酶小亚基r2的蛋白质序列比对。
[0041]
图4为3-ap抑制痘病毒效果epr检测结果图。
[0042]
图5为3-ap对感染细胞中痘病毒复制的抑制效果噬斑图。
[0043]
图6为3-ap对感染细胞中痘病毒复制的抑制效果以及3-ap对细胞活力的影响。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0045]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046]
3-ap(triapine)其结构式如图1所示。
[0047]
3-ap(triapine)，购买自targetmol。
[0048]
实施例1、mpvr2的纯化及序列比对
[0049]
材料准备：
[0050]
纯化缓冲液：a液：20mm hepes，500mm nacl，ph 7.0，5％(v/v)甘油。
[0051]
b液：20mm hepes，500mm nacl，ph 7.0，5％(v/v)甘油，2.5mm
[0052]
脱硫生物素。
[0053]
质粒准备：实验中所用的大肠杆菌bl21(de3)为本实验室所保存。pet-21a( )载体来自于苏州金唯智生物科技有限公司。实验中所用蛋白质mpvr2的氨基酸参考序列来自美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)。将mpvr2蛋白(genbank:aie41356.1)序列通过pspxi和bamhi酶切位点克隆于pet-21α载体的t7启动子下，同时在mpvr2蛋白的n端添加了strep标签，以便于重组蛋白的亲和层析纯化，从而得到pet-21α-strep重组质粒。
[0054]
mpvr2蛋白准备：质粒转化进感受态细胞，挑取单克隆进行小量表达，将诱导表达
的培养物进行超声，上清和沉淀重悬液分别制备电泳样品。根据电泳图判断蛋白有无表达、表达形式、表达量、分子量等，从而判断目的蛋白的最适表达条件。同时切下目的条带进行质谱鉴定。然后进行目的蛋白的大量表达。将诱导表达后的培养物依次经过strep亲和层析和凝胶过滤层析，并通过sds-page鉴定纯化过的目的蛋白纯度在95％以上，如图2。
[0055]
序列比对：在genbank下载四种痘病毒(monkeypox virus\cowpox virus\variola virus\vaccinia virus)核糖核苷酸还原酶小亚基序列，用clustalw网站(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)，采用clustal算法进行序列比对，然后再用endscript/espript网站(http://espript.ibcp.fr/espript/cgi-bin/espript.cgi)对序列比对结果进行作图，如图3。
[0056]
结果显示，四种痘病毒的核糖核苷酸还原酶小亚基序列相似度达到95％以上，说明该蛋白靶点具有保守性，以此推断该药物可能具有广谱抗痘病毒能力。
[0057]
实施例2、电子顺磁共振检测mpvr2自由基抑制效果
[0058]
三种药物：hydroxyurea(hu)，购自上海源叶生物科技有限公司。triapine(3-ap)购自美国陶素生化科技有限公司。resveratrol(res)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
[0059]
三种待测药物(hu\3-ap\res)母液配制：用双蒸水将hu和res配置为1m母液，用dmso将3-ap配置成50mm母液。
[0060]
每个药物设置两个药物浓度梯度，将三种药物分别加到10mg/ml痘病毒核糖核苷酸还原酶mpvr2蛋白中，室温反应10分钟。再用brukeresp-300x-bandspectrometer记录样品在100k的自由基波谱。
[0061]
图4为三种药物抑制mpvr2的epr波谱图。r2表示mpvr2，形成自由基特征波谱。(r2/3-ap(3.5:1)表示r2与3-ap以摩尔比3.5:1形成的混合物)。图1的横坐标表示磁场强度，用高斯(g)表示。纵坐标是信号强度(intensity)，用a.u.表示。
[0062]
从图4中分析可知：通过低温epr实验，观察到了mpvr2具有的epr特征波谱。加上较低浓度药物后，观察到自由基波谱明显降低。提高药物浓度后，自由基波谱几乎完全消失。证明药物对mpvr2蛋白具有抑制作用。三种药物抑制mpvr2自由基的效果区别为：3-ap》res》hu。
[0063]
实施例3、细胞水平抑制痘病毒的功效评价实验及抑制剂对细胞毒性评价实验一、细胞水平抑制痘病毒的功效评价实验
[0064]
(1)96孔板初筛
[0065]
1、提前一天将生长状态良好的vero细胞铺至96孔板中，上液量为每孔100μl；
[0066]
2、第二天，去掉培养基，将pfu为100的痘苗病毒(vaccinia virus strain wr)加入到细胞中，37℃1h；
[0067]
3、用移液枪将孔中液体吸除干净，并用pbs洗去残留病毒。随后，用维持液配不同浓度的小分子药物。设置不加药物的阴性对照孔，不同浓度设置2个复孔(终浓度为50μμ、10μμ、2μμ、0.4μμ、0.08μμ、0μμ)。混合后至于37℃待用；
[0068]
4、加入药物后继续培养48h，加入4％多聚甲醛，染色2h，加入0.5％结晶紫溶液染色1-2h，拍照。结果如图5。
[0069]
(2)12孔板噬斑实验
[0070]
1、提前一天将生长状态良好的vero细胞铺至12孔板中，上液量为每孔1ml；
[0071]
2、第二天，去掉培养基，将pfu为100的痘苗病毒(vaccinia virus strain wr)加入到细胞中，37℃2h，期间每隔25-30min晃动一次培养板；
[0072]
3、用移液枪将孔中液体吸除干净，并用pbs洗去残留病毒。随后，将2％的羧甲基纤维素50℃预热，与常温的2
×
dmem高糖培养基(cr12902浙江森瑞生物)1:1混合，并加入不同浓度的小分子药物。设置不加药物的阴性对照孔，不同浓度设置3个复孔(终浓度为4μμ、2μμ、1μμ、0.5μμ、0.25μμ、0μμ)。混合后至于37℃待用；
[0073]
4、加入药物后继续培养48h，弃掉甲基纤维素。直接加入4％多聚甲醛，染色2h，加入0.5％结晶紫溶液染色1-2h，计数。利用graphpad prism拟合药物浓度对数与抑制率的非线性曲线，根据曲线得出抑制率为50％的药物浓度即为ec
50
。
[0074]
噬斑实验结果如图5，ec
50
如图6(b)。
[0075]
二、抑制剂对细胞毒性评价实验
[0076]
1、接种细胞，在96孔板接种vero细胞悬液(100μl/孔)，将培养板放在培养箱中，37℃、5％co2预培养24h；
[0077]
2、向培养板中加入不同浓度的3-ap(终浓度为200μμ、40μμ、8μμ、1.6μμ、0.32μμ)；
[0078]
3、将培养板在培养箱中继续培养48h，更换新鲜培养基，每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0079]
4、将培养板在培养箱中培养2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，检测细胞存活率，计算小分子药物对vero细胞的细胞毒性。细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]
×
100％。
[0080]
as:实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物溶液)；
[0081]
ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，不含药物)；
[0082]
ab:空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液，不含细胞、药物)。
[0083]
图6为3-ap抑制痘病毒效果以及细胞毒性实验结果图。图6的结果显示，3-ap的病毒复制50％抑制效果及其细胞毒性，3-ap抑制痘病毒在vero细胞中复制的ec
50
为2.62μm。当3-ap在200μm时，细胞存活率在50％以上。si(cc
50
/ec
50
)指数大于76。
[0084]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。