低变应原性重组乳蛋白和包含其的组合物
发明领域
1.本发明总体上涉及重组乳蛋白、包含此类重组乳蛋白的组合物以及用于生产此类重组乳蛋白和组合物的方法。具体而言，本发明涉及具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白。
2.发明背景
3.牛奶是一种流行的营养来源。它包含优质蛋白质、必需矿物质和维生素。此外，牛奶包含具有有利功能特性的蛋白质，这些特性允许生产多种衍生产品(例如，酸奶、奶酪、奶油、黄油)，并且可用于工业应用(例如，聚合物、治疗剂、家用产品的生产)。
4.尽管牛奶和乳制品营养丰富且用途广泛，但越来越多的人不能食用牛奶和乳制品，因为它会引起变应原反应。变应原性是乳清蛋白β-乳球蛋白的一个特殊问题。β-乳球蛋白的变应原性可能是由于存在t细胞和b细胞抗原表位(例如，t细胞表面抗原[例如，主要组织相容性复合物(mhc)i类和ii类蛋白质]和b细胞产生的免疫球蛋白[例如，ige])识别的氨基酸序列或二级或三级结构，结合溶剂暴露的蛋白酶识别或切割序列的不存在，以及蛋白质在胃的酸性环境中针对变性的相对稳定性。因此，包含抗原表位的未消化β-乳球蛋白可以到达胃肠粘膜中的主动免疫取样位点并引发变应原反应。
[0005]
乳蛋白的变应原性是努力开发牛奶和乳制品的替代品(例如，基于植物和基于坚果的牛奶/乳类食品)的重要动机。然而，迄今为止，这些努力在匹配牛奶和乳制品的风味和营养特征谱以及重新创造与乳蛋白具有相同或相似的营养成分和功能的蛋白质方面都存在不足。
[0006]
因此，需要具有减弱或基本上消除变应原性的低变应原性乳蛋白，以及包含此类乳蛋白的组合物(例如，食品)。
[0007]
通过引用并入
[0008]
本文提及的所有出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物和其他参考文献通过引用的方式整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物或其他参考文献被具体地和单独地指出以引用的方式并入。在通过引用并入的材料与本公开内容相矛盾或不一致的程度上，本公开内容，包括定义，将取代任何此类材料。
[0009]
发明概述
[0010]
在一个方面，本文提供了一种重组乳蛋白，其与相应的天然乳蛋白相比包含修饰，该修饰与相应的天然乳蛋白相比减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性。修饰可以从包含在相应天然乳蛋白中的重组乳蛋白中消除变应原表位，消除包含在相应天然乳蛋白中的重组乳蛋白中的翻译后修饰(ptm；例如o-糖基化)，与相应的天然乳蛋白的稳定性相比降低重组乳蛋白的蛋白质结构在酸性ph下的稳定性，和/或在重组乳蛋白中产生非天然蛋白酶识别或切割序列。非天然蛋白酶识别或切割序列可以是哺乳动物(例如人)胃肠道中所含蛋白酶的非天然识别或切割序列。上述任一项的重组乳蛋白可以是重组β-乳球蛋白。上述任一项的重组乳蛋白可以是重组α-乳清蛋白。
[0011]
在另一个方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含乳蛋白组分并且与相应的组合物相比具有减弱或基本上消除的变应原性，其中乳蛋白组分包含根据上文任一项的重组乳蛋白或由其组成。
[0012]
在其他方面，本文提供了能够产生根据上文任一项的重组乳蛋白的重组宿主细胞，以及可用于产生重组宿主细胞的重组表达构建体和重组载体，以及用于获得重组宿主细胞和用于产生重组乳蛋白和包含重组乳蛋白的组合物的方法。
附图说明
[0013]
将通过使用附图以附加的具体性和细节来描述和解释示例实施方案，其中：
[0014]
图1是根据本发明的代表性实施方案，用于生产具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白的基础里氏木霉(trichoderma reesei)靶向载体的图谱。
[0015]
图2是根据本发明的代表性实施方案，用于生产具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白的基础毕赤酵母(pichia pastoris)(法夫驹形酵母(komagataella phaffii))靶向载体的图谱。
[0016]
发明详述
[0017]
在此使用的术语和描述仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
[0018]
定义
[0019]
氨基酸在本文中可以通过它们的单字母代码、氨基酸名称或三字母代码来指代。单字母代码、氨基酸名称、三字母代码如下：g-甘氨酸(gly)、p-脯氨酸(pro)、a-丙氨酸(ala)、v-缬氨酸(val)、l-亮氨酸(leu)、i-异亮氨酸(ile)、m-甲硫氨酸(met)、c-半胱氨酸(cys)、f-苯丙氨酸(phe)、y-酪氨酸(tyr)、w-色氨酸(trp)、h-组氨酸(his)、k-赖氨酸(lys)、r-精氨酸(arg)、q-谷氨酰胺(gln)、n-天冬酰胺(asn)、e-谷氨酸(glu)、d-天冬氨酸(asp)、s-丝氨酸(ser)、t-苏氨酸(thr)。氨基酸残基由氨基酸的第一个字母后跟指定氨基酸在参考序列(例如，seq id no：1或2)中的位置的数字来表示。氨基酸取代由要被取代的氨基酸的第一个字母、后跟指定要被取代的氨基酸在参考序列(例如，seq id no：1或2)中的位置的数字和将在该位置取代要被取代的氨基酸的第二个字母来表示。
[0020]
本文使用的术语“一个”和“一种”和“该”以及类似的提及指的是单数和复数(例如，意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。例如，术语“一种化合物”与术语“至少一种化合物”和“一种或多种化合物”同义，可以指单一化合物或多种化合物，包括它们的混合物。
[0021]
如本文与所述数值或数值范围相结合所用的术语“约”意在涵盖所述数值或数值范围的变体(即，表示比所述数值或数值范围多或少一些，在所述数值或数值范围的
±
10％范围内)。
[0022]
如本文所用，术语“变应原表位”是指在人或其他动物中引发变应原反应的氨基酸序列。通常，由于t细胞表面抗原(例如mhci类和ii类蛋白)或b细胞产生的免疫球蛋白(例如ige)分别与t细胞变应原性表位或b-细胞抗原表位的结合引起这样的变应原反应。
[0023]
如本文所用，术语“和/或”是指相互结合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“(x和z)或y”、“(y和z)或x”、单独的“x和y”、单独的“x和z”、单独的“y和z”或“x或y或z”。
[0024]
如本文所用，术语“至少”或“一个或多个”是指随后列出的元素的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、至少一个、至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个或全部。
[0025]
如本文所用，术语“b细胞抗原表位”是指由b细胞产生的免疫球蛋白(例如，ige)识别(例如，结合)的氨基酸序列。
[0026]
如本文所用，术语“酪蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的酪蛋白(即，对于哺乳动物产生的乳汁是天然的酪蛋白；例如，天然酪蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。酪蛋白的非限制性实例包括β-酪蛋白(例如，uniprot序列p02666的氨基酸16至224；uniprot序列p11839或p33048的氨基酸16至222；p05814的氨基酸16至226)、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白(例如，uniprot序列p02668的氨基酸22至190；uniprot序列p02669或p02670的氨基酸22至192；uniprot序列p07498的氨基酸21至182)，α-s1-酪蛋白(例如，uniprot序列p02662、p04653或p18626的氨基酸16至214；uniprot序列p47710的氨基酸16至185)和α-s2-酪蛋白(例如分别uniprot序列p02663的氨基酸16至222；uniprot序列p04654或p33049的氨基酸16至223)。
[0027]
如本文所用，术语“相应组合物”或“相应食品”分别是指通过与分别用于生产分别与“相应的组合物”或“相应的食品”进行比较的组合物或食品的方法相同的方法生产的组合物或食品，除了分别生产“相应组合物”或“相应食品”的方法不包括其中“相应组合物”或“相应食品”的变应原性分别被如本文提供的方法中所提供地减弱或基本上消除的步骤。
[0028]
如本文所用，术语“相应的天然乳蛋白”、“相应的天然β-乳球蛋白”或“相应的天然α-乳清蛋白”分别是指分别与重组乳蛋白、重组β-乳球蛋白或重组α-乳清蛋白(分别与“相应的天然乳蛋白”、“相应的天然β-乳球蛋白”或“相应的天然α-乳清蛋白”进行比较)相同的天然乳蛋白、β-乳球蛋白或α-乳清蛋白，除了它不包含分别在重组乳蛋白、重组β-乳球蛋白或重组α-乳清蛋白中提供的修饰。
[0029]
如本文所用，术语“消化率”是指药剂在人或其他动物胃肠道中降解的速率。
[0030]
如本文所用，术语“基本上不含”是指指示的组分在指示的组合物中不能通过常用的分析方法检测到，或者指指示的组分以没有功能的痕量存在。在此上下文中使用的术语“功能”是指对包含痕量的指示组分的组合物的性质没有贡献，或在包含痕量的指示组分的指示组合物中不具有活性(例如，化学活性、酶活性)，或在使用或消费包含痕量指示组分的组合物时不会对健康产生不利影响。
[0031]
如本文所用，术语“丝状真菌”指真菌门和卵菌门的任何丝状形式(如由hawksworth等人,in,ainsworth and bisby's dictionary of the fungi,8th edition,1995,cab international,university press,cambridge,uk定义的)。丝状真菌与酵母的区别在于其在营养生长期间的菌丝伸长。如本文所用，术语“丝状真菌宿主细胞”是指从丝
状真菌获得的宿主细胞。
[0032]
如本文所用，术语“食品”是指可以被人类或动物(包括驯养动物(例如狗、猫)、农场动物(例如牛、猪、马)和野生动物(例如非驯养的食肉动物))摄取以用于饮食目的的组合物(即，没有不良健康影响，但由于消化的物质在胃肠道中的摄取而具有显著的营养和/或热量摄取)。该术语包括可以与一种或多种其他成分组合或添加到一种或多种其他成分中以制备可以被人或动物摄取的食品的组合物。
[0033]
如本文所用，术语“真菌”是指子囊菌门、担子菌门、接合菌门和壶菌门、卵菌门和球囊菌门的生物体。然而，将理解，真菌分类学在不断发展，因此真菌界的这一具体定义可能会在未来进行调整。如本文所用，术语“真菌宿主细胞”是指从真菌获得的宿主细胞。
[0034]
如本文所用，术语“胃肠道”包括口、食道、胃、小肠、大肠和肛门。
[0035]
如本文所用，术语“同源物”是指包含与包含在参考蛋白中的相似长度(即，长度在查询氨基酸序列长度的 /-20％范围内)的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％)相同的氨基酸序列，并且具有与参考蛋白质的功能性质相似(例如，在50％以内、40％以内、30％以内、20％以内或10％以内)的功能性质的蛋白质。该术语包括蛋白质的多态变体、种间同源物(例如直系同源物)、旁系同源物和等位基因。
[0036]
如本文所用，术语“宿主细胞”不仅指特定的主题细胞，而且指此类细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代实际上可能与主题细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
[0037]
如本文所用，关于药剂的术语“低变应原性”和/或“减弱或基本上消除的变应原性”是指减少或消除在摄入或接触该药剂时在人中引起的变应原反应。减少通常与参考药剂相比评分，参考药剂在本文提供的重组乳蛋白(例如，本文提供的重组β-乳球蛋白)的上下文中是相应的天然乳蛋白(例如，天然β-乳球蛋白)，并且在本文提供的组合物(例如，本文提供的食品)的上下文中，是相应的组合物(例如，相应的食品)。这种减少可以是不超过相应天然乳蛋白或相应组合物的变应原性的0％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的变应原性。可以使用本领域已知的多种方法测量变应原性，包括本文提供的方法。
[0038]
如本文所用，在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的上下文中的术语“同一性”或“相同”是指当两个或更多个多核苷酸或多肽序列分别对齐以实现最大对应时相同的核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“同一性”可以存在于被比较的序列区域上(例如，在功能结构域的长度上)或序列的全长上。“区域”被认为是至少6、9、14、19、24、29、34、39或更多个核苷酸或至少2、6、10、14、18、22、26、30或更多个氨基酸的连续区段。为了比较，通常一个序列充当一个或多个测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过
pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性方法搜索，通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(gcg)的序列分析软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，可以以默认参数使用)，或通过目视检查(一般参见ausubel等人，下文)。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是blast算法(参见例如altschul等人1990j.mol.biol.215:403-410；gish&states.1993nature genet.3:266-272；madden等人1996meth.enzymol.266:131-141；altschul等人1997nucleic acids res.25:3389-3402；zhang 7madden.1997genome res.7:649-656)。执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。在两个或更多个多肽序列因保守取代而彼此不同的情况下(即用化学上相似的氨基酸取代氨基酸；提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的)，百分比序列同一性或同源性程度可以向上调整以纠正取代的保守性质。用于进行这种调整的工具对于本领域技术人员来说是众所周知的。参见，例如，pearson,1994,methods mol.biol.24:307-31和25:365-89。
[0039]
如本文所用的术语“包括”、“含有”、“具有”、“拥有”、“有”或其变体旨在以类似于术语“包含”的方式具有包容性。
[0040]
如本文所用，术语“乳蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的蛋白质(即，对于哺乳动物产生的乳汁是天然的蛋白质；例如，天然乳清蛋白或天然酪蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。乳蛋白的非限制性实例包括α-乳清蛋白(例如，uniprot序列p00709、p00711、p00712或p09462的氨基酸20-142)、β-乳球蛋白(uniprot序列p02754的氨基酸17-178、uniprot序列p67976或p02756的氨基酸19-180)，乳铁蛋白(例如，uniprot序列p24627、d3g9g3或q29477的氨基酸20至708；uniprot序列p02788的氨基酸20至710)，转铁蛋白(例如，uniprot序列q29443或w5pf65的氨基酸20至704；uniprot序列a0a452fjf9或p02787的氨基酸20至698)，血清白蛋白(例如uniprot序列p02769或p14639的氨基酸25至607；uniprot序列a0a452f7y5的氨基酸19至608；uniprot序列p02768的氨基酸25至609)、乳过氧化物酶蛋白、糖巨肽(gmp)、β-酪蛋白(例如uniprot序列p02666的氨基酸16至224；uniprot序列p11839或p33048的氨基酸16至222；p05814的氨基酸16至226)，γ-酪蛋白，κ-酪蛋白(例如uniprot序列p02668的氨基酸22至190；uniprot序列p02669或p02670的氨基酸22至192；uniprot序列p07498的氨基酸21至182)、α-s1-酪蛋白(例如uniprot序列p02662、p04653或p18626的氨基酸16至214；uniprot序列p47710的氨基酸16至185)和α-s2-酪蛋白(例如，分别地uniprot序列p02663的氨基酸16至222；uniprot序列p04654或p33049的氨基酸16至223)。编码乳蛋白的多核苷酸和多肽序列的非限制性实例在2015年8月21日提交的pct申请pct/us2015/046428和2017年8月25日提交的pct申请pct/us2017/48730中公开，其在此整体并入本文。乳蛋白可以来源于任何哺乳动物物种，包括但不限于牛、人、绵羊、野羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、山羊、猴、猿、猫、狗、小袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔子、鲸、狒狒、长臂猿、红毛猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、虎、针鼹和长毛象。
[0041]
如本文所用，术语“乳蛋白组分”是指由乳清蛋白子集或乳清蛋白子集和酪蛋白子集的混合物组成的组分(即，由一些但不是所有存在于例如乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、酪蛋白分离物、酪蛋白浓缩物、酪蛋白水解物、乳蛋白分离物、乳蛋白浓缩物、乳蛋白水解物、胶束酪蛋白浓缩物、酪蛋白酸钠或酸性酪蛋白酸盐中的蛋白质组成)。该术语暗示组成乳蛋白组分的乳蛋白是包含在本文提供的组合物中的唯一乳蛋白(即，组合物不包含除了组成乳蛋白组分的乳蛋白之外的其他乳蛋白)。
[0042]
如本文所用，术语“天然的”是指在自然界中以其未修饰状态发现的(例如，未经人类遗传修饰，并且在不是由人类定义的条件[例如，氧合水平、ph、盐浓度、温度和营养物质(例如碳、氮、硫)可用性]下维持的细胞)。
[0043]
如本文所用，术语“一个或多个”是指随后列出的元素的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、至少一个、至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个或全部。
[0044]
如本文所用，术语“可操作地连接”是指允许它们在功能上相关的元件布置。例如，如果启动子序列控制蛋白质编码序列的转录，则启动子序列与蛋白质编码序列可操作地连接，如果分泌信号序列引导蛋白质通过细胞的分泌系统，则分泌信号序列与蛋白质可操作地连接。“可操作地连接”的元件可以与另一个元件连续连接，或以反式作用或与另一个元件相距一定距离。可以可操作地连接的功能的非限制性例子包括转录控制、翻译控制、蛋白质折叠和蛋白质分泌。
[0045]
如本文所用的术语“任选地”或“任选的”是指特征或结构存在或不存在，或事件或情况发生或不发生。该描述包括存在特征或结构的实例、不存在特征或结构的实例、发生事件或情况的实例以及不发生事件或情况的实例。
[0046]
如本文所用，术语“多核苷酸”是指至少2个(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1,000个)核苷酸的聚合形式。该术语包括dna分子(例如cdna、基因组dna、合成dna)和rna分子(例如mrna、合成rna)的有义链和反义链，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键和/或化学修饰的dna或rna的类似物。多核苷酸可以进行化学或生物化学修饰，或者可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记；甲基化；用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)、带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)、悬垂的部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键联(例如，α异头核酸)。本领域中描述了修饰核苷酸的实例(参见，例如，malyshev等人2014.nature 509:385；li等人2014.j.am.chem.soc.136:826)。还包括模拟多核苷酸通过氢键合或其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。此类分子是本领域已知的并且包括例如其中肽键替代分子骨架中的磷酸键的分子。其他修饰可以包括例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构的类似物，例如在“锁定”多核苷酸中发现的修饰。多核苷酸可以是任何拓扑构象。例如，多核苷酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、分支的、发夹的、环状的或锁式构象。如本文所用，术语“多核苷酸序列”是指包含在多核苷酸中或组成多核苷酸的核苷酸序列。
[0047]
如本文所用，术语“蛋白酶”是指可以水解(即切割)肽键的蛋白质(例如，酶分类组
ec3.4的成员)。
[0048]
如本文所用，术语“蛋白酶识别或切割序列”或“蛋白酶的识别或切割序列”是指多肽中优选地被蛋白酶识别并且其中肽键被蛋白酶切割的氨基酸序列。蛋白酶识别或切割序列中位置的一般命名法如schechter&berger(1967biochem biophys res commun,27(2):157-162；1968biochem biophys res commun,32(5):898-902)所述定义，其指定切割位点位于氨基酸残基p1和p1'之间，并且在切割的肽键的n端方向(即p1、p2、p3、p4等)和c端(即p1'、p2'、p3'、p4'等)中递增编号。
[0049]
如本文所用，术语“纯化”是指蛋白质基本上与化学物质和细胞组分(例如，细胞壁、膜脂质、染色体、其他蛋白质)分离。该术语不要求(尽管允许)将蛋白质与所有其他化学物质和细胞组分分开。
[0050]
如本文所用，术语“重组宿主细胞”是指包含重组多核苷酸的宿主细胞。因此，例如，重组宿主细胞可以产生在宿主细胞的天然(非重组)形式中不存在的多核苷酸或多肽，或者重组宿主细胞可以以不同于宿主细胞的天然(非重组)形式中的水平产生多核苷酸或多肽。应当理解，这样的术语不仅意指特定的主题细胞，而且意指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，因此此类后代可能与主题细胞不同，但仍包括在本文所用术语“重组宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养中生长的分离的细胞或细胞系，或者可以是存在于活组织或生物体中的细胞。
[0051]
如本文所用，术语“重组β-乳球蛋白”是指重组产生的多肽，其包含与天然β-乳球蛋白中的氨基酸序列(例如，牛(bos taurus)β-乳球蛋白[uniprot序列p02754的氨基酸17至178；seq id no：1或2]，欧洲盘羊(ovis aries musimon)β-乳球蛋白)[uniprot序列p67975；seq id no：4]，绵羊(ovis aries)β-乳球蛋白[uniprot序列p67976；seq id no：5]，马(equus caballus)β-乳球蛋白[uniprot序列p02758的氨基酸19-180；seq id no：6]，驴(equus asinus)β-乳球蛋白蛋白[uniprot序列p13613；seq id no：7]，马β-乳球蛋白[uniprot序列p07380的氨基酸19至181；seq id no：8]，驴β-乳球蛋白[uniprot序列p19647；seq id no：9]，山羊(capra hircus)β-乳球蛋白[uniprot序列p02756的氨基酸19-180；seq id no：10]))。
[0052]
如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指从其天然存在的环境中移出的多核苷酸，或多核苷酸当在自然界中发现时与邻接或接近该多核苷酸的多核苷酸的全部或部分不相关，或与在自然界中未连接至的多核苷酸可操作地连接的多核苷酸，或在自然界中不存在的多核苷酸，或含有在自然界中未在该多核苷酸中发现的修饰(例如人工引入的插入、缺失或点突变，例如，通过人为干预)的多核苷酸，或在异源位点整合到染色体中的多核苷酸。该术语可用于例如描述克隆的dna分离物，或包含化学合成的核苷酸类似物的多核苷酸。如果多核苷酸包含非天然存在的遗传修饰，它也被认为是“重组的”。例如，如果内源多核苷酸包含人工引入(例如，通过人为干预)的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，则它被认为是“重组多核苷酸”。这种修饰可以将点突变、取代突变、缺失突变、插入突变、错义突变、移码突变、重复突变、扩增突变、易位突变或倒位突变引入多核苷酸。该术语包括宿主细胞染色体中的多核苷酸，以及不在宿主细胞染色体中的多核苷酸(例如，包含在附加体中的多核苷酸)。宿主细胞或生物体中的重组多核苷酸可以使用宿主细胞的体内细胞机制进行复制；然而，用于本发明的目的，这种重组多核苷酸(虽然随后在细胞内复制)仍被认为是重组的。
[0053]
我们在此使用的术语“相似”是指关于指定属性在大约 /-15％内。该术语包括关于指定属性在 /-9％、 /-8％、 /-7％、 /-6％、 /-5％、 /-4％、 /-3％、 /-2％或 /-1％内。
[0054]
如本文所用，术语“t细胞抗原表位”是指被t细胞表面抗原(例如，mhci类和ii类蛋白质)识别(例如，结合)的氨基酸序列。
[0055]
如本文所用的术语“两个或更多个”是指随后列出的元素的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个或全部。
[0056]
如本文所用，术语“乳清蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的乳清蛋白(即，对于哺乳动物产生的乳汁是天然的乳清蛋白；例如，天然乳清蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。乳清蛋白的非限制性实例包括α-乳清蛋白(例如，uniprot序列p00709、p00711、p00712或p09462的氨基酸20-142)、β-乳球蛋白(uniprot序列p02754的氨基酸17-178、uniprot序列p67976或p02756的氨基酸19-180)，乳铁蛋白(例如，uniprot序列p24627、d3g9g3或q29477的氨基酸20至708；uniprot序列p02788的氨基酸20至710)，转铁蛋白(例如，uniprot序列q29443或w5pf65的氨基酸20至704；uniprot序列a0a452fjf9或p02787的氨基酸20至698)，血清白蛋白(例如uniprot序列p02769或p14639的氨基酸25至607；uniprot序列a0a452f7y5的氨基酸19至608；uniprot序列p02768的氨基酸25至609)、乳过氧化物酶蛋白和糖巨肽(gmp；例如uniprot序列p02668的氨基酸127至190)。
[0057]
如本文所用，术语“载体”是指可以携带待引入宿主细胞的多核苷酸序列的核酸。载体的非限制性实例包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)、病毒颗粒(例如，包含异源多核苷酸)、dna构建体(例如，通过克隆或pcr扩增产生)和线性双链分子(例如，pcr片段)。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
[0058]
如本文所用，术语“酵母”是指酵母目的生物体。酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽/起泡，并且碳分解代谢可能是发酵的。
[0059]
除非本文另有说明，否则本文中值范围的列举仅旨在用作单独引用落入包括列举的最小值和最大值的范围内的每个单独值(分数或整数)的速记方法，并且每个单独的值被并入到说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。此外，应当理解，本文所述的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围。还应理解，以下描述的所有范围和数量均为近似值，并非旨在限制本发明。在使用范围和数字的情况下，这些可能是近似的以包括统计范围或测量误差或变化(例如，测量值可能是正负10％)。
[0060]
具有减弱或消除的变应原性的重组乳蛋白
[0061]
在一个方面，本文提供了一种重组乳蛋白，其与相应的天然乳蛋白相比包含修饰，其中与相应的天然乳蛋白相比，该修饰减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性。
[0062]
减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是以下修饰：将蛋白酶识别
或切割序列引入不包含在相应天然乳蛋白(即，非天然蛋白酶识别或切割序列)中的重组乳蛋白中；和/或从包含在相应天然乳蛋白中的重组乳蛋白中消除变应原表位。
[0063]
修饰可以是单个修饰，或者两个或更多个修饰。合适修饰的非限制性实例包括：一个或多个氨基酸取代、一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸添加、以及它们的组合。
[0064]
根据上文任一项的重组乳蛋白可以保留相应天然乳蛋白的一种或多种功能属性。
[0065]
引入非天然蛋白酶识别和切割序列的修饰
[0066]
减弱或基本上消除根据上文任一项的重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是在以下之中或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰：相应天然乳蛋白的溶剂暴露区域(即，相应的天然乳蛋白的三维结构的表面)；相应的天然乳蛋白的脂质结合区(即，相应的天然乳蛋白的三维结构中可以结合脂质的区域)；和/或包含在相应的天然乳蛋白中的变应原表位。
[0067]
非天然蛋白酶识别或切割序列可以是单个非天然蛋白酶识别或切割序列或两个或更多个非天然蛋白酶识别或切割序列。
[0068]
通过将非天然蛋白酶识别或切割序列引入重组乳蛋白中，哺乳动物胃肠道中包含的蛋白酶可以切割重组乳蛋白并破坏重组乳蛋白中包含的表位的序列或构象结构，从而减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性。
[0069]
哺乳动物胃肠道中包含的蛋白酶可以由哺乳动物产生。包含在哺乳动物的胃肠道中并且由哺乳动物(例如人)产生的蛋白酶的非限制性实例包括胰蛋白酶(例如阳离子胰蛋白酶原、阴离子胰蛋白酶原、中胰蛋白酶、pancreasin)、糜蛋白酶(例如糜蛋白酶原b1、糜蛋白酶原b2、降钙因子)、弹性蛋白酶(例如，弹性蛋白酶2a、弹性蛋白酶2b、弹性蛋白酶3a、弹性蛋白酶3b)、羧肽酶a(例如，羧肽酶a1、羧肽酶a2)、羧肽酶b(例如，羧肽酶b1、羧肽酶b2)和胃蛋白酶。
[0070]
或者，哺乳动物胃肠道中包含的蛋白酶可以由哺乳动物胃肠道中包含的微生物(例如，包含在生物组中)产生。由哺乳动物(例如，人)胃肠道中包含的微生物产生的蛋白酶的非限制性实例包括由以下产生的分泌的和细胞壁结合的胞外蛋白酶：腐烂别样杆菌(alistipes putredinis)、结肠厌氧杆菌(anaerotruncus colihominis)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、产酸拟杆菌(bacteroides acidofacients)、粪拟杆菌(bacteroides caccae)、多毛拟杆菌(bacteroides capillosus)、多氏拟杆菌(bacteroides dorei)、埃氏拟杆菌(bacteroides eggerthii)、芬氏拟杆菌(bacteroides finegoldii)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、肠道拟杆菌(bacteroides intestinalis)、卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)、嗜果胶拟杆菌(bacteroides pectinophilus)、拟杆菌属的种(bacteroides sp)、粪便拟杆菌(bacteroides stercosis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌(bacteroides uniformis)、普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、溶木聚糖拟杆菌(bacteroides xylanisolvens)、乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、blautia hansenii、穗状丁酸弧菌(butyrivibrio crossotus)、枯草芽孢杆菌(例如，丝氨酸肽酶枯草杆菌蛋白酶、bpn、枯草杆菌蛋白酶e、枯草杆菌蛋白酶dy、枯草杆菌蛋白酶解淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶nat和枯草杆菌蛋白酶s41)、白色念珠菌(candida albicans)(例如，分泌的天冬氨酸蛋白酶sap1、sap2、sap3、sap6、sap9和sap10)、天冬氨酸梭菌(clostridium asparagiforme)、柔嫩梭菌
(clostridium leptum)、流放梭菌(clostridium nexile)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)(例如，胶原酶/cola)、梭状芽孢杆菌(clostridium scindens)、梭菌属的种(clostridium sp)、产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、陪伴粪球菌(coprococcus comes)、规则粪球菌(coprococcus eutactus)、屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus)、dorea formicigenerans、dorea longicatena、脱硫弧菌(desulfovibrio desulfuricans)、desulfovibrio fairfieldensis、desulfovibrio piger、溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)(例如,金属肽酶明胶酶/gele)、凸腹真杆菌(eubacterium ventriosum)、霍氏真杆菌(eubacteruim hallii)、直肠真杆菌(eubacteruim rectale)、惰性真杆菌(eubacteruim siraeum)、普氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)(例如htra)、纤维状霍尔德曼氏菌(holdemania filiformis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、胚芽乳杆菌(lactobacillus plantarum)、吉勒蒙迪振荡螺菌(oscillospira guillermondii)、青春双歧杆菌(parabacteroides distasonis)、约氏副拟杆菌(parabacteroides johnsonii)、屎副拟杆菌(parabacteroides merdae)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)(例如，半胱氨酸肽酶牙龈素rgpa、牙龈素rgpb和牙龈素kgp)、肠道罗氏菌(roseburia intestinalis)、布氏瘤胃球菌(ruminococcus bromii)、活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus)、乳瘤胃球菌(ruminococcus lactaris)、卵形瘤胃球菌(ruminococcus obeum)、瘤胃球菌属的种(ruminococcus sp)、扭链瘤胃球菌(ruminococcus torques)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(例如，半胱氨酸肽酶staphopain a、staphopain b和staphopain c)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)(例如，金属肽酶弹性蛋白酶/sepa)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)、变形罕见小球菌(subdoligranulum variabile)、粪萨特氏菌(sutterella faecalis)、sutterella parvirubra、sutterella stercoricanis和华德萨特氏菌(sutterella wadsworthensis)(参见例如qin等人2010.nature,464(7285):59
–
65)。
[0071]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是在非天然蛋白酶识别或切割序列的p1位置提供赖氨酸或精氨酸氨基酸残基的修饰，使得非天然蛋白酶识别或切割序列被胰蛋白酶识别。根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是在非天然蛋白酶识别或切割序列的p1位置提供亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸氨基酸残基的修饰，使得非天然蛋白酶识别或切割序列被胃蛋白酶识别。根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是在非天然蛋白酶识别或切割序列的p1位置提供色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸氨基酸残基的修饰，使得非天然蛋白酶识别或切割序列被糜蛋白酶识别。可以从肽酶数据库merops(hyperlink“https://www.ebi.ac.uk/merocs/”)中包含的数据推导出哺乳动物胃肠道中包含的由哺乳动物或微生物产生的蛋白酶的进一步优选的蛋白酶识别或切割序列。与相应的天然乳蛋白相比，该修饰通常对重组乳蛋白的蛋白质结构的影响最小。这种最小的影响可以通过保守的氨基酸取代(即，具有相似生化特性的氨基酸的取代)和/或不会在重组乳蛋白的三维构象(例如，如通过使用pymol[new york,ny]和多序列比对[例如，天然乳蛋
白的直系同源物；例如，使用muscle(edgar,2004,nucleic acids res,32:1792
–
1797)]的检查确定的)中的氨基酸侧链之间产生空间位阻的氨基酸缺失、取代和/或添加来实现。
[0072]
去除变应原表位的修饰
[0073]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以是消除变应原表位的修饰。
[0074]
变应原表位可以是t细胞抗原表位或b细胞抗原表位。t细胞抗原表位和b细胞抗原表位的非限制性实例包括mhc i类(例如，hla-a、hla-b、hla-c、hla-a1、hla-a2、hla-a3、hla-a11及其亚型)结合位点、mhc ii类(例如，hla-dpa、hla-dpb、hla-dp1、hla-dp4、hla-dp5、hla-dp9、hla-dq、hla-dr、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5及其亚型)结合位点，非经典(例如hla-e、hla-g、btn3a1、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、mr1及其亚型)结合位点和ige结合位点。例如，可以通过改变(即，取代、删除和/或添加)在变应原表位中或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个)氨基酸来去除变应原表位，使得该位点不再引发变应原反应。变应原表位也可以用不包含变应原表位并且不破坏重组乳蛋白结构的多肽(例如，从另一种蛋白质[例如，另一种乳蛋白质]的结构相似区域或从直向同源乳蛋白的结构相似区域获得的多肽)取代。通过随机或定点诱变编码乳蛋白的多核苷酸，然后筛选减弱或基本上消除的变应原性，可以去除或修饰变应原表位。作为这种修饰的结果，与相应的天然乳蛋白的相应的连续氨基酸区段相比，根据上文任一项的具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白的连续氨基酸区段可以具有较小的与已知变应原表位的同一性。
[0075]
重组β-乳球蛋白
[0076]
根据上文任一项的具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白可以是重组β-乳球蛋白。
[0077]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是在相应天然β-乳球蛋白的溶剂暴露区域中或附近(例如，在1，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰。溶剂暴露区域的非限制性例子包括跨越天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)、天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)、欧洲盘羊β-乳球蛋白(seq id no：4)和绵羊β-乳球蛋白(seq id no：5)的氨基酸1到氨基酸14、氨基酸16到氨基酸20、氨基酸27到氨基酸31、氨基酸33到氨基酸36、氨基酸40到氨基酸41、氨基酸44至氨基酸72、氨基酸74至氨基酸79、氨基酸83至氨基酸103、氨基酸105至氨基酸117、氨基酸124至氨基酸139、氨基酸141至氨基酸146、氨基酸148至氨基酸155和氨基酸157至氨基酸160的区域，以及同源物和直向同源物中的相应区域。
[0078]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是在相应天然β-乳球蛋白的脂质结合区中或附近(例如，在1，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰。脂质结合区的非限制性实例包括跨越天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)、天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)、欧洲盘羊β-乳球蛋白(seq id no：4)和绵羊β-乳球蛋白(seq id no：5)的氨基酸136到氨基酸149的区域，以及同源物和直向同源物中的相应区域。
[0079]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是在包含在相应的天然β-乳球蛋白中的变应原表位中或附近(例如，在1，2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰。变应原表位(例如，t细胞抗原表位、b细胞抗原表位)的非限制性实例包括跨越天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)氨基酸1到氨基酸8、氨基酸2到氨基酸18、氨基酸9到氨基酸14、氨基酸25至氨基酸40、氨基酸35至氨基酸48、氨基酸41至氨基酸60、氨基酸43至氨基酸68、氨基酸47至氨基酸62、氨基酸67至氨基酸78、氨基酸75至氨基酸86、氨基酸78至氨基酸83、氨基酸84至氨基酸91、氨基酸86至氨基酸100、氨基酸92至氨基酸100、氨基酸97至氨基酸117、氨基酸102至氨基酸124、氨基酸122至氨基酸146、氨基酸125至氨基酸135、氨基酸127至氨基酸144、氨基酸135至氨基酸147、氨基酸141至氨基酸152、氨基酸149至氨基酸162的区域，以及天然牛β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中的相应区域。
[0080]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是产生一个或多个非天然蛋白酶识别或切割序列的单个氨基酸取代。
[0081]
此类单个氨基酸取代可选自：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i12l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t18k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t18r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),i29l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s30k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),s36y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s36l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s36k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),k47l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),k47p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t49k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),q59r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),i72l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),i72f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i72w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i72y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),i78y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a86y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),n90r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),y102f(例如，以产生更可及的胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s110l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s110y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t125f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),e127l(例如，以产生非天然
胃蛋白酶识别或切割序列),e127w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v128l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),d137r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a142p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a142l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),h146r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),和q159r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列)，以及天然牛β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中的相应单个氨基酸取代。
[0082]
此类单个氨基酸取代可选自：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的i12l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t18k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t18r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),i29l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s30k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),s36y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s36l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s36k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),k47l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),k47p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t49k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),q59r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),i72l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),i72f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i72w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i72y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),i78y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),i78f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a86y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),n90r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),y102f(例如，以产生更可及的胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s110l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s110y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s110k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t125f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切
割序列),e127l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),e127w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),e127y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v128l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),d137r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a142p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a142l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),h146r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),和q159r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列)，以及天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中相应的单个氨基酸取代。
[0083]
此类单个氨基酸取代可选自：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的i29l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s30k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),s36y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s36l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s36k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),r47l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),r47p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t49k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),f72l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),f72w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),f72y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s78y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),d90r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),y102f(例如，以产生更可及的胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t125f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v128l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),和t154f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列)，以及天然马β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中的相应单个氨基酸取代。
[0084]
此类单个氨基酸取代可选自：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的i29l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s30k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),r47l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),r47p(例如，以产生非天然胃蛋
白酶识别或切割序列),t49k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),f72l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),f72w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),f72y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s78y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s78f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),d90r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),y102f(例如，以产生更可及的胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),a111l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),a111y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),a111f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t125f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t125y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v128l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t154y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t154l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t154w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),和t154f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列)，以及天然驴β-乳球蛋白的同源物和直系同源物的相应单个氨基酸取代。
[0085]
此类单个氨基酸取代可选自：天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的i29l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s30k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),s36y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),s36l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),s36k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),r47l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),r47p(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),t49k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),v72l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),v72f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v72w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v72y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),d78l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),d78y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),d78w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),d78f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),y102f(例如，以产生更可及的胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t126k(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列),t126f(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t126w(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),t126y(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列),v129l(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列),和s138r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列)，以及天然马或驴β-乳球蛋白的同源物和直系同源物中的相应单个氨基酸取代。
[0086]
这样的单个氨基酸取代可以选自天然马β-乳球蛋白(seq id no：9)的h147r(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列)，以及天然马β-乳球蛋白的同源物和直向同源
物中的相应单个氨基酸取代。
[0087]
或者，根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以由产生一个或多个非天然蛋白酶识别或切割序列的两个或更多个氨基酸取代组成。
[0088]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i12l,t18k,t18r,i29l,s30k,s36y,s36l,s36k,k47l,k47p,t49k,q59r,i72l,i72f,i72w,i72y,i78l,i78y,i78w,i78f,a86y,n90r,y102f,s110p,s110l,s110y,s110w,s110f,s110k,a111p,a111k,a111l,a111y,a111w,a111f,t125k,t125f,t125w,t125y,e127k,e127l,e127w,e127f,e127y,v128l,d137r,a142p,a142l,h146r,t154k,t154y,t154l,t154w,t154f,q159r及其组合，以及在天然牛β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中相应的两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i12l和以下的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的t18k或t18r,i29l,s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t18k或t18r和以下的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i29l,s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下的一个或多个或由前组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s36y或s36l或s36k和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含k47l或k47p和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白
(seq id no：1或2)的t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含q59r和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i72l或i72f或i72w或i72y和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i78l或i78y或i78w或i78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a86y和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含n90r和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含y102f和以下的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的a111p或a111k或a111l或a111y,a111w或
a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a111p或a111k或a111l或a111y、a111w或a111f和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t125k或t125f或t125w或t125y和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含e127k或e127l或e127w或e127f或e127y和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含v128l和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含d137r和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a142p或a142l以及以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含h146r和以下中的一个或多个或由其组成：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的t154k或t154y或t154l或t154w或t154f和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的t154k或t154y或t154l或t154w或t154f和q159r或由其组成。
[0089]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的i12l,t18k,t18r,i29l,s30k,s36y,s36l,s36k,k47l,k47p,t49k,q59r,i72l,i72f,i72w,i72y,i78l,i78y,i78w,i78f,a86y,n90r,y102f,s110p,s110l,s110y,s110w,s110f,s110k,a111p,a111k,a111l,a111y,a111w,a111f,t125k,t125f,t125w,t125y,e127k,e127l,e127w,e127f,e127y,v128l,d137r,a142p,a142l,h146r,t154k,t154y,t154l,t154w,t154f,q159r，以及它们的组合，以及在天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中相应的两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i12l和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的t18k或t18r,i29l,s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t18k或t18r和以下中的一个或多个或由以下组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的i29l,s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或
s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的s30k,s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的s36y或s36l或s36k,k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s36y或s36l或s36k和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的k47l或k47p,t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含k47l或k47p和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的t49k,q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的q59r,i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含q59r和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的i72l或i72f或i72w或i72y,i78l或i78y或i78w或i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i72l或i72f或i72w或i72y和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的i78l或i78y或i78w或
i78f,a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i78l或i78y或i78w或i78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的a86y,n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a86y和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的n90r,y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含n90r和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的y102f,s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含y102f和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s110p或s110l或s110y或s110w或s110f或s110k和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的t125k或t125f或t125w或t125y,e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t125k或t125f或t125w或t125y和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的e127k或e127l或e127w或e127f或e127y,v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含e127k或e127l或e127w或e127f或e127y和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的v128l,d137r,a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含v128l和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的d137r,a142p或a142l,h146r,t154k
或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含d137r和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的a142p或a142l,h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a142p或a142l以及以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的h146r,t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含h146r和以下中的一个或多个或由其组成：天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4、5或10)的t154k或t154y或t154l或t154w或t154f,和q159r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然欧洲盘羊、绵羊或山羊β-乳球蛋白(分别seq id no：4、5或10)的t154k或t154y或t154l或t154w或t154f和q159r或由其组成。
[0090]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的i29l,s30k,s36y,s36l,s36k,r47l,r47p,t49k,f72l,f72w,f72y,s78l,s78y,s78w,s78f,d90r,y102f,a111p,a111k,a111l,a111y,a111w,a111f,t125k,t125f,t125w,t125y,v128l,t154k,t154y,t154l,t154w,t154f及其组合，以及在天然马β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中的相应两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含：i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的s30k,s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s36y或s36l或s36k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的r47l或r47p,t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含r47l或r47p和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含f72l或f72w或f72y和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s78l或s78y或s78w或s78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y
或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含d90r和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含y102f和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含t125k或t125f或t125w或t125y和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然马β-乳球蛋白(seq id no：6)的v128l和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f或由其组成。
[0091]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的i29l,s30k,r47l,r47p,t49k,f72l,f72w,f72y,s78l,s78y,s78w,s78f,d90r,y102f,a111p,a111k,a111l,a111y,a111w,a111f,t125k,t125f,t125w,t125y,v128l,t154k,t154y,t154l,t154w,t154f及其组合，以及在天然驴β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中相应的两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的s30k,r47l或r47p,t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的r47l或r47p,t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含r47l或r47p和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的t49k,f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的f72l或f72w或f72y,s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含f72l或f72w或f72y和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的s78l或s78y或s78w或s78f,d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s78l或s78y或s78w或s78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的d90r,y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸
取代可包含d90r和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的y102f,a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含y102f和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f,t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含a111p或a111k或a111l或a111y或a111w或a111f和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的t125k或t125f或t125w或t125y,v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含t125k或t125f或t125w或t125y和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的v128l,和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然驴β-乳球蛋白(seq id no：7)的v128l和t154k或t154y或t154l或t154w或t154f或由其组成。
[0092]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的i29l,s30k,s36y,s36l,s36k,r47l,r47p,t49k,v72l,v72f,v72w,v72y,d78l,d78y,d78w,d78f,y102f,t126k,t126f,t126w,t126y,v129l,s138r及其组合，和天然马β-乳球蛋白的同源物和直向同源物的相应的两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的s30k,s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s36y或s36l或s36k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含r47l或r47p和以下中的一个或多个或由以下组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含v72l或v72f或v72w或v72y以及天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的d78l或d78y或d78w或d78f、y102f、t126k或t126f或t126w或t126y、v129l和s138r中的一个或多个或由其组成。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含d78l或d78y或d78w或d78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含y102f和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,和s138r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t126k或t126f或t126w或t126y和以下中的一个或多个或由其组成：天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的v129l和s138r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以
包含天然马β-乳球蛋白(seq id no：8)的v129l和s138r或由其组成。
[0093]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含两个或更多个选自以下的氨基酸取代或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的i29l,s30k,s36y,s36l,s36k,r47l,r47p,t49k,v72l,v72f,v72w,v72y,d78l,d78y,d78w,d78f,y102f,t126k,t126f,t126w,t126y,v129l,s138r,h147r以及它们的组合，以及天然驴β-乳球蛋白的同源物和直向同源物的相应的两个或更多个氨基酸取代。此类两个或更多个氨基酸取代可包含i29l和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的s30k,s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含s30k和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的s36y或s36l或s36k,r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含s36y或s36l或s36k和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的r47l或r47p,t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含r47l或r47p和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的t49k,v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含：t49k和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的v72l或v72f或v72w或v72y,d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含v72l或v72f或v72w或v72y和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的d78l或d78y或d78w或d78f,y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含d78l或d78y或d78w或d78f和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的y102f,t126k或t126f或t126w或t126y,v129l,s138r,和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可包含y102f和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的t126k或t126f或t126w或t126y、v129l、s138r和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含t126k或t126f或t126w或t126y和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的v129l、s138r和h147r。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含v129l和以下中的一个或多个或由其组成：天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的s138r和h147r。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然驴β-乳球蛋白(seq id no：9)的s138r和h147r或由其组成。
[0094]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的k47l、g52d和d53n或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置47至53处的氨基酸序列kptpegd被转化为氨基酸序列lptpedn(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的i72l、a73g、k77e、i78n、a80k和v81k或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置72至81处的氨基酸序列iaektkipav被转化为氨基酸序列lgektenpkk(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或
更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的k83t、i84v、d85n、a86y、l87q、n88g和n90r或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置83至90处的氨基酸序列kidalnen被转化为氨基酸序列tvnyqger(例如，以产生非天然胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的d85n、a86y、n88d和n90d或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置85至90处的氨基酸序列dalnen被转化为氨基酸序列nylded(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1)的e108g、n109p、s110p、a111l、e112p、p113s、e114a、q115e、s116hg和l117m或由其组成，例如使得将天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1)的氨基酸位置108至117处的氨基酸序列ensaepeqsl转化为氨基酸序列gpplpsaehgm(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：2)的e108g、n109p、s110p、a111l、e112p、p113s、e114a、q115e、s116hg、l117m和a118v或由其组成，例如，使得将天然牛β-乳球蛋白(seq id no：2)的氨基酸位置108至118处的氨基酸序列ensaepeqsla转化为氨基酸序列gpplpsaehgmv(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的e127k和d130k或由其组成，例如使得天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置127至130处的氨基酸序列evdd被转化为氨基酸序列kvdk(例如，以产生非天然胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的k141q、a142p、m145g和h146r或由其组成，例如使得天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置141至146处的氨基酸序列kalpmh被转化为氨基酸序列qplpgr(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的p153l和q155r或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置153至155处的氨基酸序列ptq被转化为氨基酸序列ltr(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的f151l、n152d、p153l、t154k和l156m或由其组成，例如使得在天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1或2)的氨基酸位置151至156处的氨基酸序列fnptql被转化为氨基酸序列ldlkqm(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。
[0095]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的k47l和g52d或由其组成，例如使得在天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的氨基酸位置47至52处的氨基酸序列kptpeg被转化为氨基酸序列lptped(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。例如，此类两个或更多个氨基酸取代可以包含天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的i72l、a73g、k77e、i78n、a80k和v81k或由其组成，例如使得将天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的氨基酸位置72至81处的氨基酸序列iaektkipav转化为氨基酸序列lgektenpkk(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的k83t、i84v、d85n、a86y、l87q、n88g和n90r或由其组成，例如使得将天然欧洲盘羊或绵羊β-乳球蛋白(分别为seq id no：4或5)的氨基酸位置83至90处的氨基酸序列kidalnen转化为氨基酸
no：8或9)的氨基酸位置47至52处的氨基酸序列rptpeg转化为氨基酸序列lptped(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的v72l、a73g、q74e、d78n、a80k和v81k或由其组成，例如使得将天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的氨基酸位置72至81处的氨基酸序列vaqktedpav转化为氨基酸序列lgektenpkk(例如，以产生非天然的胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的p154l、s155t和g156r或由其组成，例如使得在天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的氨基酸位置154至156处的氨基酸序列psg被转化为氨基酸序列ltr(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可以包含天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的q152l、p154l、s155k、g156q和g157m或由其组成，例如使得将天然马或驴β-乳球蛋白(分别为seq id no：8或9)的氨基酸位置152至157处的氨基酸序列qdpsgg转化为氨基酸序列ldlkqm(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。
[0098]
这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的k47l和g52d或由其组成，例如使得在天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置47至52处的氨基酸序列kptpeg被转化为氨基酸序列lptped(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的i72l、a73g、k77e、i78n、a80k和v81k或由其组成，例如使得在天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置72至81处的氨基酸序列iaektkipav被转化为氨基酸序列lgektenpkk(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的k83t、i84v、d85n、a86y、l87q、n88g和n90r或由其组成，例如使得在天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置83至90处的氨基酸序列kidalnen被转化为氨基酸序列tvnyqger(例如，以产生非天然胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的d85n、a86y、n88d和n90d或由其组成，例如使得将天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置85至90处的氨基酸序列dalnen转化为氨基酸序列nylded(例如，以产生非天然胃蛋白酶和糜蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的e108g、n109p、s110p、a111l、e112p、p113s、e114a、q115e、s116hg、l117m和a118v或由其组成，例如使得在天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置108至118处的氨基酸序列ensaepeqsla被转化为氨基酸序列gpplpsaehgmv(例如，以产生非天然胃蛋白酶识别或切割序列)。此类两个或更多个氨基酸取代可包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的k141q、a142p、m145g和h146r或由其组成，例如使得天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置141至146处的氨基酸序列kalpmh被转化为氨基酸序列qplpgr(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的p153l和q155r或由其组成，例如使得天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置153至155处的氨基酸序列ptq被转化为氨基酸序列ltr(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。这样的两个或更多个氨基酸取代可以包含天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的f151l、n152d、p153l、t154k和l156m或由其组成，
例如使得天然山羊β-乳球蛋白(seq id no：10)的氨基酸位置151至156处的氨基酸序列fnptql被转化为氨基酸序列ldlkqm(例如，以产生非天然胃蛋白酶和胰蛋白酶识别或切割序列)。
[0099]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是消除包含在天然β-乳球蛋白中的变应原性表位的修饰。消除变应原表位的修饰的非限制性实例包括一个或多个选自以下的氨基酸取代：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：1)的a111g,a111i,a111l,a111v,v118g,v118i,v118l,a132g,a132i,a132l,a132v,a139g,a139i,a139l,a139v,a142g,a142i,a142l,a142v,a16g,a16i,a16l,a16v,a23c,a23g,a23h,a23k,a23p,a23w,a25c,a25d,a25e,a25g,a25p,a25w,a26c,a26d,a26e,a26g,a26p,a26w,a34g,a34i,a34l,a34v,a37g,a37i,a37l,a37v,a67g,a67i,a67l,a67v,a73g,a73i,a73l,a73v,a80g,a80i,a80l,a80v,a86g,a86i,a86l,a86q,a86v,d11e,d11n,d11q,d129e,d129n,d129q,d130e,d130n,d130q,d137e,d137n,d137q,d33e,d33n,d33q,d53e,d53n,d53q,d85e,d85n,d85q,d98e,d98n,d98q,e108d,e108n,e108q,e112d,e112n,e112q,e114d,e114n,e114q,e127d,e127n,e127q,e131d,e131n,e131q,e134d,e134n,e134q,e157c,e157d,e157g,e157h,e157n,e157p,e157q,e158d,e158n,e158q,e44d,e44g,e44n,e44q,e45d,e45n,e45q,e51d,e51g,e51n,e51q,e55d,e55n,e55q,e62d,e62n,e62q,e65d,e65n,e65q,e74d,e74n,e74q,f105w,f105y,f136w,f136y,f151a,f151c,f151d,f151e,f151g,f151h,f151i,f151k,f151n,f151p,f151q,f151r,f151s,f151t,f151v,f151w,f151y,f82w,f82y,g52a,g52i,g52l,g52v,d64a,d64i,d64l,d64v,g9a,g9i,g9l,g9v,h146k,h146p,h146r,h161k,h161r,i12a,i12g,i12l,i12v,i147a,i147c,i147d,i147e,i147g,i147h,i147k,i147l,i147n,i147p,i147q,i147r,i147s,i147t,i147v,i162a,i162g,i162l,i162v,i29c,i29d,i29e,i29g,i29h,i29k,i29n,i29p,i29r,i2a,i2g,i2l,i2v,i56a,i56g,i56l,i56v,i71a,i71g,i71l,i71v,i72a,i72g,i72l,i72v,i78a,i78g,i78l,i78v,i84a,i84g,i84l,i84v,k100h,k101h,k47h,k47r,k75h,k77h,k83h,k8h,k8r,l103a,l103g,l103i,l103v,l104a,l104g,l104i,l104v,l10a,l10g,l10i,l10v,l117a,l117g,l117i,l117v,l122a,l122g,l122i,l122v,l133a,l133g,l133i,l133v,l140a,l140g,l140i,l140v,l143a,l143g,l143i,l143v,l149a,l149c,l149d,l149e,l149g,l149h,l149i,l149k,l149n,l149p,l149q,l149r,l149s,l149t,l149v,l156a,l156c,l156d,l156e,l156g,l156h,l156i,l156k,l156m,l156n,l156p,l156q,l156r,l156s,l156t,l156v,l1a,l1g,l1i,l1v,l22c,l22d,l22e,l22g,l22h,l22k,l22n,l22p,l22q,l22r,l22s,l22t,l22w,l31a,l31c,l31d,l31e,l31g,l31h,l31i,l31k,l31m,l31n,l31p,l31q,l31r,l31s,l31t,l31v,l31w,l32a,l32c,l32d,l32e,l32g,l32h,l32i,l32k,l32m,l32n,l32p,l32q,l32r,l32t,l32v,l32w,l39a,l39g,l39i,l39v,l46a,l46g,l46i,l46v,l54a,l54g,l54i,l54v,l57a,l57g,l57i,l57v,l58a,l58g,l58i,l58v,m107s,m107t,m145s,m145t,m24a,m24c,m24d,m24e,m24g,m24n,m24p,m24q,m24s,m7s,m7t,n109d,n109e,n109q,n152c,n152d,n152e,n152g,n152q,n63d,n63e,n63q,p48g,p50g,q115d,q115e,q115n,q120d,q120e,q120n,q13d,q13e,q13n,q155d,q155e,q155n,q159d,q159e,q159n,q35d,q35e,q35n,q59d,q59e,q59n,q5d,q5e,q5n,q68d,q68e,q68n,r124h,r40h,s110m,s110t,s116m,s116t,s150c,s150d,s150e,s150g,s150m,s150n,s150t,s21d,s21g,s27c,s27d,s27g,s30c,s30d,s30g,s36m,s36t,
t125m,t125s,t154g,t154h,t154m,t154s,t49g,t49m,t49s,t4m,t4s,t6m,t6s,t76m,t76s,t97m,t97s,v123a,v123g,v123i,v123l,v128a,v128g,v128i,v128l,v15a,v15g,v15i,v15l,v3a,v3g,v3i,v3l,v41a,v41g,v41i,v41l,v43a,v43g,v43i,v43l,v81a,v81g,v81i,v81l,w19c,w19d,w19e,w19f,w19g,w19h,w19k,w19n,w19p,w19q,w19r,w19s,w19t,w19y,w61f,w61y,y20a,y20c,y20d,y20e,y20g,y20h,y20m,y20n,y20q,y20r,y20s,y20t,y20v,y42g及其组合，以及在天然牛β-乳球蛋白的同源物和直向同源物中相应的氨基酸取代。
[0100]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组β-乳球蛋白的变应原性的修饰可以是消除包含在天然β-乳球蛋白中的变应原性表位的修饰。消除变应原表位的修饰的非限制性实例包括一个或多个选自以下的氨基酸取代：天然牛β-乳球蛋白(seq id no：2)的a111g,a111i,a111l,a111v,a118g,a118i,a118l,a118v,a132g,a132i,a132l,a132v,a139g,a139i,a139l,a139v,a142g,a142i,a142l,a142v,a16g,a16i,a16l,a16v,a23c,a23g,a23h,a23k,a23p,a23w,a25c,a25d,a25e,a25g,a25p,a25w,a26c,a26d,a26e,a26g,a26p,a26w,a34g,a34i,a34l,a34v,a37g,a37i,a37l,a37v,a67g,a67i,a67l,a67v,a73g,a73i,a73l,a73v,a80g,a80i,a80l,a80v,a86g,a86i,a86l,a86q,a86v,d11e,d11n,d11q,d129e,d129n,d129q,d130e,d130n,d130q,d137e,d137n,d137q,d33e,d33n,d33q,d53e,d53n,d53q,d85e,d85n,d85q,d98e,d98n,d98q,e108d,e108n,e108q,e112d,e112n,e112q,e114d,e114n,e114q,e127d,e127n,e127q,e131d,e131n,e131q,e134d,e134n,e134q,e157c,e157d,e157g,e157h,e157n,e157p,e157q,e158d,e158n,e158q,e44d,e44g,e44n,e44q,e45d,e45n,e45q,e51d,e51g,e51n,e51q,e55d,e55n,e55q,e62d,e62n,e62q,e65d,e65n,e65q,e74d,e74n,e74q,f105w,f105y,f136w,f136y,f151a,f151c,f151d,f151e,f151g,f151h,f151i,f151k,f151n,f151p,f151q,f151r,f151s,f151t,f151v,f151w,f151y,f82w,f82y,g52a,g52i,g52l,g52v,g64a,g64i,g64l,g64v,g9a,g9i,g9l,g9v,h146k,h146p,h146r,h161k,h161r,i12a,i12g,i12l,i12v,i147a,i147c,i147d,i147e,i147g,i147h,i147k,i147l,i147n,i147p,i147q,i147r,i147s,i147t,i147v,i162a,i162g,i162l,i162v,i29c,i29d,i29e,i29g,i29h,i29k,i29n,i29p,i29r,i2a,i2g,i2l,i2v,i56a,i56g,i56l,i56v,i71a,i71g,i71l,i71v,i72a,i72g,i72l,i72v,i78a,i78g,i78l,i78v,i84a,i84g,i84l,i84v,k100h,k101h,k47h,k47r,k75h,k77h,k83h,k8h,k8r,l103a,l103g,l103i,l103v,l104a,l104g,l104i,l104v,l10a,l10g,l10i,l10v,l117a,l117g,l117i,l117v,l122a,l122g,l122i,l122v,l133a,l133g,l133i,l133v,l140a,l140g,l140i,l140v,l143a,l143g,l143i,l143v,l149a,l149c,l149d,l149e,l149g,l149h,l149i,l149k,l149n,l149p,l149q,l149r,l149s,l149t,l149v,l156a,l156c,l156d,l156e,l156g,l156h,l156i,l156k,l156m,l156n,l156p,l156q,l156r,l156s,l156t,l156v,l1a,l1g,l1i,l1v,l22c,l22d,l22e,l22g,l22h,l22k,l22n,l22p,l22q,l22r,l22s,l22t,l22w,l31a,l31c,l31d,l31e,l31g,l31h,l31i,l31k,l31m,l31n,l31p,l31q,l31r,l31s,l31t,l31v,l31w,l32a,l32c,l32d,l32e,l32g,l32h,l32i,l32k,l32m,l32n,l32p,l32q,l32r,l32t,l32v,l32w,l39a,l39g,l39i,l39v,l46a,l46g,l46i,l46v,l54a,l54g,l54i,l54v,l57a,l57g,l57i,l57v,l58a,l58g,l58i,l58v,m107s,m107t,m145s,m145t,m24a,m24c,m24d,m24e,m24g,m24n,m24p,m24q,m24s,m7s,m7t,n109d,n109e,n109q,n152c,n152d,n152e,n152g,n152q,n63d,n63e,n63q,p48g,p50g,q115d,q115e,q115n,q120d,q120e,q120n,q13d,q13e,
q13n,q155d,q155e,q155n,q159d,q159e,q159n,q35d,q35e,q35n,q59d,q59e,q59n,q5d,q5e,q5n,q68d,q68e,q68n,r124h,r40h,s110m,s110t,s116m,s116t,s150c,s150d,s150e,s150g,s150m,s150n,s150t,s21d,s21g,s27c,s27d,s27g,s30c,s30d,s30g,s36m,s36t,t125m,t125s,t154g,t154h,t154m,t154s,t49g,t49m,t49s,t4m,t4s,t6m,t6s,t76m,t76s,t97m,t97s,v123a,v123g,v123i,v123l,v128a,v128g,v128i,v128l,v15a,v15g,v15i,v15l,v3a,v3g,v3i,v3l,v41a,v41g,v41i,v41l,v43a,v43g,v43i,v43l,v81a,v81g,v81i,v81l,w19c,w19d,w19e,w19f,w19g,w19h,w19k,w19n,w19p,w19q,w19r,w19s,w19t,w19y,w61f,w61y,y20a,y20c,y20d,y20e,y20g,y20h,y20m,y20n,y20q,y20r,y20s,y20t,y20v,y42g以及它们的组合，和天然牛β-乳球蛋白的同源物和直向同源物的相应的氨基酸取代。
[0101]
重组α-乳清蛋白
[0102]
根据上文任一项的具有减弱或基本上消除的变应原性的重组乳蛋白可以是重组α-乳清蛋白。
[0103]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组α-乳清蛋白的变应原性的修饰可以是在相应天然α-乳清蛋白(例如，牛α-乳清蛋白)的溶剂暴露区域中或附近(例如，在1，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰。溶剂暴露区域的非限制性例子包括跨越天然牛α-乳清蛋白(seq id no：3)的氨基酸5到氨基酸18的区域，以及天然牛α-乳清蛋白的同源物和直向同源物的相应区域。
[0104]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组α-乳清蛋白的变应原性的修饰可以是在包含在相应的天然α-乳清蛋白蛋白(例如，牛α-乳清蛋白)的变应原表位中或附近(例如，在1，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之内)引入非天然蛋白酶识别或切割序列的修饰。变应原表位(例如，t细胞抗原表位、b细胞抗原表位)的非限制性实例包括跨越天然牛β-乳清蛋白(seq id no：3)的氨基酸1到氨基酸16、氨基酸13到氨基酸26、氨基酸47到氨基酸58或氨基酸93至氨基酸102的区域，以及天然牛α-乳清蛋白的同源物和直向同源物的相应区域。
[0105]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组α-乳清蛋白的变应原性的修饰可以是消除包含在天然α-乳清蛋白中的变应原性表位的修饰。消除变应原表位的修饰的非限制性实例包括一个或多个选自以下的氨基酸取代：天然牛α-乳清蛋白(seq id no：3)的e1d,e1n,e1q,q2d,q2e,q2n,l3g,l3a,l3v,l3i,t4s,t4m,k5h,k5r,e7d,e7n,e7q,v8g,v8a,v8l,v8i,f9y,f9w,r10h,r10k,e11d,e11n,e11q,l12g,l12a,l12v,l12i,k13h,k13r,d14e,d14n,d14q,l15g,l15a,l15v,l15i,k16h,k16r,g17a,g17v,g17l,g17i,y18f,y18w,g19a,g19v,g19l,g19i,g20a,g20v,g20l,g20i,v21g,v21a,v21l,v21i,s22t,s22m,l23g,l23a,l23v,l23i,e25d,e25n,e25q,w26f,w26y,s47t,s47m,t48s,t48m,e49d,e49n,e49q,y50f,y50w,g51a,g51v,g51l,g51i,l52g,l52a,l52v,l52i,f53y,f53w,q54d,q54e,q54n,i55g,i55a,i55v,i55l,n56d,n56e,n56q,n57d,n57e,n57q,k58h,k58r,k93h,k93r,k94h,k94r,i95g,i95a,i95v,i95l,l96g,l96a,l96v,l96i,d97e,d97n,d97q,k98h,k98r,v99g,v99a,v99l,v99i,g100a,g100v,g100l,g100i,i101g,i101a,i101v,i101l,n102d,n102e,n102q,a109g,a109v,a109l,a109i,l110g,l110a,l110v,l110i,s112t,s112m,e113d,e113n,e113q,k114h,k114r,l115g,l115a,l115v,l115i,d116e,d116n,d116q,q117d,q117e,q117n,w118f,w118y,l119g,l119a,l119v,l119i,e121d,e121n,e121q,k122h,k122r,l123g,
l123a,l123v,和l123i及其组合，以及天然牛α-乳清蛋白的同源物和直向同源物的相应的氨基酸取代。
[0106]
修饰的其他效果
[0107]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以消除包含在相应天然乳蛋白中的重组乳蛋白的翻译后修饰(ptm)。如本文所用，术语“翻译后修饰”或其首字母缩写词“ptm”是指生物合成后化学基团与多肽的共价连接。ptm可以出现在多肽的氨基酸侧链或其c端或n端。ptm的非限制性实例包括糖基化(即通过c-键联(即，c-糖基化)、n-键联(即，n-糖基化)或o-键联(即o-糖基化)，或通过糖基磷脂酰肌醇化(即添加糖基磷脂酰肌醇锚)或磷酸糖基化(即通过磷酸丝氨酸的磷酸酯连接)共价连接到聚糖基团的蛋白质(例如，单糖、二糖、多糖、线性聚糖、支链聚糖、具有呋喃半乳糖残基的聚糖、具有硫酸盐和/或磷酸盐残基的聚糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、d-甘露糖、l-岩藻糖、n-乙酰基-d-半乳糖胺、n-乙酰基-d-葡萄糖胺、n-乙酰基-d-神经氨酸、呋喃半乳糖、磷酸二酯、n-乙酰氨基葡萄糖、n-乙酰半乳糖胺、唾液酸及其组合；参见，例如，deshpande等人2008.glycobiology 18(8):626))，磷酸化(即与磷酸基团的蛋白质共价连接)，烷基化(即与烷烃基团的蛋白质共价连接(例如，甲基化中的甲烷基团))，脂化(即，脂质基团的共价连接(例如，异戊二烯化和异戊二烯化中的类异戊二烯基团(例如，法呢基化中的法尼醇基团，香叶基化中的香叶醇基团，香叶基香叶基化中的香叶基香叶醇基团)，脂肪酰化中的脂肪酸基团(例如，肉豆蔻酰化中的肉豆蔻酸，棕榈酰化中的棕榈酸)，糖基磷脂酰肌醇化中的糖基磷脂酰肌醇锚))，羟基化(即，羟基基团的共价连接)，sumo化(即，与小泛素样修饰剂(或sumo)蛋白质的蛋白质的连接)、亚硝基化(即附着于no基团的蛋白质；例如，s-亚硝基化)、亚硝基硫醇化(即与no基团的蛋白质中的半胱氨酸硫醇连接以形成s-亚硝基硫醇))、s-谷胱甘肽化(即与谷胱甘肽基团的蛋白质中的半胱氨酸硫醇连接)和酪氨酸硝化(即与硝酸盐基团蛋白质的酪氨酸残基连接)。通过消除重组乳蛋白中的ptm，修饰可以产生更容易接近哺乳动物(例如人)的胃肠道中包含的蛋白酶的蛋白酶识别或切割序列(例如，天然蛋白酶识别或切割序列，或非天然蛋白酶识别或切割序列[例如，根据上文任一项的非天然蛋白酶识别或切割序列])，使得蛋白酶可以切割重组乳蛋白，从而减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性。
[0108]
根据上文任一项的减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性的修饰可以与相应的天然乳蛋白相比降低重组乳蛋白的蛋白质结构在酸性ph(例如，小于7、小于6.5、小于6、小于5.5、小于5、小于4.5、小于4、小于3.5、小于3、小于2.5、小于2、小于1.5或小于1的ph)下的稳定性。通过降低重组乳蛋白的蛋白质结构的稳定性，修饰可以影响蛋白酶识别或切割序列(例如，天然蛋白酶识别或切割序列，或非天然蛋白酶识别或切割序列[例如，根据上文任一项的非天然蛋白酶识别或切割序列])的溶剂暴露，使得包含在哺乳动物(例如人)的胃肠道中的蛋白酶可以切割重组乳蛋白，从而减弱或基本上消除重组乳蛋白的变应原性。
[0109]
重组宿主细胞
[0110]
在另一方面，本文提供了一种重组宿主细胞，其能够产生根据上文任一项的重组乳蛋白(即，其包含编码根据上文任一项的重组乳蛋白的多核苷酸)，其中重组宿主细胞包含根据以下任一项的重组表达构建体。
[0111]
重组表达构建体可以由单个重组表达构建体组成，或者由两个或更多个重组表达构建体组成。在重组表达构建体由两个或更多个重组表达构建体组成的实施方案中，两个
或更多个重组表达构建体可以是相同的，或者两个或更多个重组表达构建体中的至少两个可以彼此不同(例如，在启动子序列、蛋白质编码序列、分泌信号序列、终止序列和/或附加调节元件中)。重组表达构建体可以稳定整合到重组宿主细胞的基因组中(例如，通过靶向整合(例如，通过同源重组)或随机(即，非靶向)整合)，或者可以不是稳定整合而是维持在染色体外(例如，在本文提供的自主复制重组载体上)。重组表达构建体可以由两种或更多种重组表达构建体组成，其中至少一种重组表达构建体稳定整合在重组宿主细胞的基因组中，并且至少一种重组表达构建体不稳定整合。
[0112]
重组表达构建体
[0113]
在另一个方面，本文提供了一种重组表达构建体，其可用于产生根据上文任一项的重组宿主细胞。
[0114]
重组表达构建体由包含一个或多个表达盒的多核苷酸组成，其中每个表达盒包含：
[0115]-启动子序列(例如，本文公开的任何启动子的多核苷酸序列)，
[0116]-任选的分泌信号序列(即，编码肽的序列，该肽介导附着于肽的新生蛋白递送至其中合成新生蛋白的细胞的外部；例如，编码本文公开的任何分泌信号的多核苷酸序列)，
[0117]-乳蛋白编码序列(即，编码根据上文任一项的重组乳蛋白的多核苷酸序列)，和
[0118]-终止序列(例如，本文公开的任何终止子的多核苷酸序列)；
[0119]
其中：
[0120]-启动子序列以正义方向可操作地连接到任选的分泌信号序列和乳蛋白编码序列(即，启动子序列和任选的分泌信号序列和乳蛋白编码序列被放置为使得启动子序列有效介导或调节任选的分泌信号序列和乳蛋白编码序列的转录)，
[0121]-任选的分泌信号序列以正义方向可操作地连接至乳蛋白编码序列(即，任选的分泌信号序列和乳蛋白编码序列被放置为使得转录和翻译产生包含任选分泌信号的重组乳蛋白)，和
[0122]-一种或多种终止子序列与乳蛋白编码序列可操作地连接(即，乳蛋白编码序列和一种或多种终止子序列被放置为使得一种或多种终止子序列在终止乳蛋白编码序列的转录中有效)。
[0123]
重组表达构建体可以进一步包含用于通过同源(即靶向整合)或非同源重组整合到宿主细胞基因组中的序列。重组表达构建体可以包含与宿主细胞基因组中的靶序列具有足够同一性以提高重组表达构建体的同源重组的可能性的至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1,000个或至少10,000个碱基对。这种同源序列可以是非编码的或编码的。
[0124]
包含在根据上文任一项的重组表达构建体中的任选的分泌信号序列和/或乳蛋白编码序列可以针对在根据上文任一项的重组宿主细胞中的表达进行密码子优化。
[0125]
可以分离和/或纯化根据上文任一项的重组表达构建体。
[0126]
可以在将重组表达构建体的片段整合到宿主细胞的基因组(例如，根据上文任一项的重组宿主细胞的基因组)中后产生根据上文任一项的重组表达构建体。例如，包含乳蛋白编码序列(任选可操作地连接到分泌信号序列)的多核苷酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，使得内源基因座的一个或多个调节元件变得可操作地连接到乳蛋白编码序
列，从而产生根据上文任一项的重组表达构建体。
[0127]
启动子序列
[0128]
根据上文任一项的重组表达构建体可以包含在根据上文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何启动子序列。
[0129]
启动子序列可以是组成型启动子序列(即，在大多数环境和发育条件下有活性的启动子序列)，或诱导型或阻抑型启动子序列(即，仅在某些环境或发育条件[例如，在存在或不存在某些因素的情况下，例如但不限于碳(例如，葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、纤维素、槐糖、龙胆二糖、山梨糖、诱导纤维素酶启动子的二糖、淀粉、色氨酸、硫胺素、甲醇)、磷酸盐、氮或其他营养物质；温度；ph；渗透压；重金属或重金属离子；抑制剂；应激；分解代谢物；以及它们的组合]下有活性的启动子序列)。
[0130]
启动子序列可以由单个启动子序列组成，或由两个或更多个启动子序列组成(例如，按顺序排列的两个或更多个启动子或其功能部分的组合，诱导型和组成型启动子的组合)。两个或更多个启动子序列可以相同，或者两个或更多个启动子序列中的至少两个可能不相同。
[0131]
启动子序列可以包含双向启动子序列或由其组成(即，通过募集转录因子以两个方向启动转录的多核苷酸，例如通过在相反方向融合两个相同或不同启动子而产生)。
[0132]
合适的启动子序列的非限制性实例包括在根据上文任一项的重组宿主细胞来源于的细菌宿主细胞中起作用的启动子序列，包括t7启动子、t5启动子、tac启动子、pl/pr启动子、phoa启动子、lacuv5启动子、trc启动子、trp启动子、csta启动子、xyla启动子、manp启动子、mala启动子、laca启动子、apre启动子、δapre启动子、srfa启动子、p43启动子、ylba启动子、σb启动子、veg启动子、pg1启动子、pg6启动子、λpl启动子、λpr启动子和spa启动子，以及它们的功能部分和组合。
[0133]
合适的启动子序列的非限制性实例包括在根据上文任一项的重组真菌宿主细胞来源于的真菌宿主细胞中起作用的启动子序列，包括xlna启动子、xynl启动子、xyn2启动子、xyn3启动子、xyn4启动子、bxl1启动子、cbh1启动子、cbh2启动子、egl1启动子、egl2启动子、egl3启动子、egl4启动子、egl5启动子、glaa启动子、agda启动子、gpda启动子、gpd1启动子、aox1启动子、gap1启动子、met3启动子、eno1启动子、gpd1启动子、pdc1启动子、tef1启动子、axe1启动子、cip1启动子、gh61启动子、pki1启动子、rp2启动子、adh1启动子、cup1启动子、gal1启动子、pgk1启动子、ypt1启动子、lac4启动子、lac4-pb1启动子、fld1启动子、mox启动子、das1启动子、das2启动子、gap1启动子、str3启动子、adh3启动子、gut2启动子、cyc1启动子、tdh3启动子、pgl1启动子、adh2启动子、hxt7启动子、clb1启动子和pho5启动子，以及它们的功能部分和组合。
[0134]
分泌信号序列
[0135]
根据上文任一项的重组表达构建体可以任选地包含在根据上文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何分泌信号序列。
[0136]
任选的分泌信号序列可以编码分泌信号，该分泌信号介导新生重组乳蛋白在翻译后(即，蛋白质合成先于易位，使得新生重组乳蛋白在易位到er中之前存在于细胞胞质溶胶中)或在翻译同时(即蛋白质合成和易位到er中同时发生)易位到er中。
[0137]
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在根据上文任一项的重组宿主细胞来
源于的细菌宿主细胞中起作用的分泌信号序列，包括编码以下蛋白质中任一项的基因的分泌信号序列：pelb、ompa、bla、phoa、phos、male、livk、livj、mglb、araf、ampc、rbsb、merp、cpdb、lpp、lamb、ompc、phoe、ompf、tolc、btub和luta，以及它们的功能部分和组合。
[0138]
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在根据上文任一项的重组宿主细胞来源于的真菌宿主细胞中起作用的分泌信号序列，包括编码以下蛋白质中任一项的基因的分泌信号序列：cbh1、cbh2、egl1、egl2、xyn1、xyn2、bxl1、hfb1、hfb2、glaa、amya、amyc、aama、α交配因子、suc2、pho5、inv、amy、lip、pir、ost1和β-葡萄糖苷酶，以及它们的功能部分和组合。
[0139]
终止序列
[0140]
根据上文任一项的重组表达构建体可以包含在根据上文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何终止序列。
[0141]
合适的终止序列的非限制性实例包括在根据上文任一项的重组宿主细胞来源于的宿主细胞中起作用的终止序列，包括adhl、amaa、amds、amya、aoxl、cbh1、cbh2、cyc1、egl1、egl2、gal1、gap1、glaa、gpd1、gpda、pdc1、pgk1 tef1、tps1、trpc、xyn1、xyn2、xyn3和xyn4基因的终止序列以及它们的功能部分和组合。
[0142]
终止序列可以由单个终止序列组成，或者由两个或更多个终止序列组成，其中两个或更多个终止序列可以相同，或者两个或更多个终止序列中的至少两个可以不相同。终止序列可以由双向终止序列组成。
[0143]
其他调节元件
[0144]
根据上文任一项的重组表达构建体可以进一步包含额外的调节元件。
[0145]
调节元件的非限制性实例包括启动子序列、终止序列、转录起始序列、翻译起始序列、翻译终止序列、增强子序列、激活子序列、响应元件、蛋白质识别位点、诱导性元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、上游激活序列(uas)、内含子、操纵子(即与启动子相邻的核酸序列，其包含蛋白质结合结构域，其中阻遏蛋白可以结合并降低或消除启动子的活性)、有效的rna加工信号(例如，剪接信号、多聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mrna的序列、提高翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点[例如，shine-dalgarno序列])、提高蛋白质稳定性的序列、增强蛋白质分泌的序列及其组合。
[0146]
重组载体
[0147]
在另一方面，本文提供了一种重组载体，其包含根据上文任一项的重组表达构建体或其片段(例如，包含乳蛋白编码序列和任选的分泌信号序列的多核苷酸，其在整合进入宿主细胞的基因组后产生根据上文任一项的重组表达构建体)。
[0148]
重组载体可以包含根据上述任何一种的单一重组表达构建体，或根据上述任何一种的两个或更多个重组表达构建体，它们可以是相同的或其中的至少两个可以是不相同的(例如，在启动子序列、分泌信号、蛋白质编码序列、终止序列和/或附加调节元件方面彼此不同)。在重组载体包含两种或更多种重组表达构建体的实施方案中，两种或更多种重组表达构建体可以编码相同的重组乳蛋白。在一些此类实施方案中，编码相同重组乳蛋白的两种或更多种重组表达构建体在启动子序列、分泌信号序列、终止序列和/或额外的调节元件方面彼此不同。
[0149]
重组载体可以进一步包含一种或多种适合于在重组宿主细胞中繁殖重组载体的
sp.)、产朊念珠菌(candida utilis)、皱状念珠菌(candida versatilis))、枝孢菌属(cladosporium)、隐球菌属(例如，cryptococcus terricolus、弯曲隐球(cryptococcus curvatus))、德巴利酵母属(例如，汉斯德巴氏酵母菌(debaryomyces hansenii)、内孢霉属(例如，产脂内孢霉(endomyces vernalis))、拟内孢霉属(例如，产脂拟内孢霉(endomycopsis vernalis)、假囊酵母属(例如阿氏假囊酵母(eremothecium ashbyii))、汉逊酵母属(例如汉逊酵母属的种(hansenula sp.)、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(例如克鲁维酵母属的种(kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母乳酸变种(kluyveromyces marxianus var.lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans))、油脂酵母属(例如斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母(lipomyecs lipofer)、ogataea(例如ogataea minuta)、毕赤酵母属(例如毕赤酵母属的种(pichia sp.)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii)、芬兰毕赤酵母(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(pichia minuta)、pichia lindneri)、pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(pichia salictaria)、pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母(pichia pijperi)、树干毕赤酵母(pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica))、红冬孢酵母属(例如圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides))、红酵母属(例如红酵母属的种(rhodotorula sp.)、瘦弱红酵母(rhodotorula gracilis)、粘红酵母(rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(rhodotorula graminis))、酵母属(例如酵母属的种(saccharomyces sp.)、贝酵母(saccharomyces bayanus)、saccharomyces beticus、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(saccharomyces chevalieri)、糖化酵母(saccharomyces diastaticus)、葡萄酒酵母(saccharomyces ellipsoideus)、少孢酵母(saccharomyces exiguus)、弗罗棱酵母菌(saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(saccharomyces fragilis)、巴斯德酵母(saccharomyces pastorianus)、裂殖酵母(saccharomyces pombe)、清酒酵母(saccharomyces sake)、葡萄汁酵母(saccharomyces uvarum)、掷孢酵母属(例如粉红掷孢酵母(sporobolomyces roseus))、锁掷孢酵母属(例如约翰逊锁掷孢酵母(sporidiobolus johnsonii)、鲑色锁掷酵母(sporidiobolus salmonicolor))、丝孢酵母属(例如trichosporon cacaoliposimilis、trichosporon oleaginosus sp.nov.、trichosporon cacaoliposimilis sp.nov.、纤细丝孢酵母(trichosporon gracile)、trichosporon dulcitum、trichosporon jirovecii、trichosporon insectorum)、法夫酵母属(例如红法夫酵母(xanthophyllomyces dendrorhous))、耶氏酵母属(例如解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、和接合酵母属(例如鲁氏接合酵母(zygosaccharomyces rouxii)。
[0157]
合适的丝状真菌的非限制性实例包括真菌的任何全纯(holomorphic)型、有性(teleomorphic)型和无性(anamorphic)型形式，包括以下任何属的成员，及其衍生物和杂交：支顶孢属(例如，亚拉巴马支顶孢(acremonium alabamense))、曲霉属(例如，刺曲霉(aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、棒曲霉(aspergillus clavatus)、黄曲霉(aspergillus flavus)、臭曲霉(aspergillus foetidus)、烟曲霉
(aspergillus fumigatus)、日本曲霉(aspergillus japonicus)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、黑曲霉泡盛变种(aspergillus niger var.awamori)、棕曲霉(aspergillus ochraceus)、米曲霉(aspergillu soryzae)、酱油曲霉(aspergillus sojae)、土曲霉(aspergillus terreus)以及裸孢壳属、新萨托菌属(neosartorya)和石座菌属(petromyces)物种)、短梗霉属(aureobasidium)、canariomyces、毛壳属(chaetonium)、chaetomidium、棒囊壳属(corynascus)、金孢子菌属(chrysosporium)(例如chrysosporium botryoides、chrysosporium carmichaeli、chrysosporium crassitunicatum、chrysosporium europae、chrysosporium evolceannui、chrysosporium farinicola、法斯特金孢子菌(chrysosporium fastidium)、chrysosporium filiforme、chrysosporium georgiae、chrysosporium globiferum、chrysosporium globiferum var.articulatum、chrysosporium globiferum var.niveum、chrysosporium hirundo、chrysosporium hispanicum、chrysosporium holmii、chrysosporium indicum、chrysosporium iops、嗜角质金孢子菌(chrysosporium keratinophilum)、chrysosporium kreiselii、chrysosporium kuzurovianum、chrysosporium lignorum、chrysosporium obatum、chrysosporium lucknowense、chrysosporium lucknowense garg 27k、chrysosporium medium、chrysosporium medium var.spissescens、chrysosporium mephiticum、chrysosporium merdarium、chrysosporium merdarium var.roseum、微小金孢子菌(chrysosporium minor)、chrysosporium pannicola、短小金孢子菌(chrysosporium parvum)、短小金孢子菌新月变种(chrysosporium parvum var.crescens)、chrysosporium pilosum、chrysosporium pseudomerdarium、梨形金孢菌(chrysosporium pyriformis)、chrysosporium queenslandicum、chrysosporium sigleri、硫磺金孢子菌(chrysosporium sulfureum)、chrysosporium synchronum、热带金孢子菌(chrysosporium tropicum)、chrysosporium undulatum、chrysosporium vallenarense、chrysosporium vespertilium、chrysosporium zonatum)、coonemeria、小克银汉霉属(例如短刺小克银汉霉(cunninghamella ehinulata))、指形囊菌属(dactylomyces)、裸孢壳属(emericella)、线黑粉酵母属(filibasidium)、镰刀菌属(例如串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)、镰孢霉(fusarium venenatum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、层生镰孢菌(fusarium proliferatum)、轮枝镰刀菌(fusarium verticiollioides)、黄色镰刀菌(fusarium culmorum)、克地镰刀菌(fusarium crookwellense)、梨孢镰刀菌(fusarium poae)、拟枝孢镰刀菌(fusarium sporotrichioides)、接骨木镰刀菌(fusarium sambuccinum)、茄腐镰刀菌(fusarium torulosum)以及其相关的gibberella teleomorphic形式)、赤霉属、腐质霉属、肉座菌属、香菇属、畸枝霉属(例如，malbranchea filamentosa)、稻瘟菌属、malbranchium、melanocarpus、被孢霉属(例如，高山被孢霉1s-4(mortierella alpina 1s-4)、mortieralla isabelline、葡酒色被孢霉(mortierrla vinacea)、mortieralla vinaceae var.raffinoseutilizer)、毛霉属(例如，mucor miehei cooney et emerson(米黑根毛霉(rhizomucor miehei)(cooney&r.emerson)schipper、mucor pusillus lindt、mucor circinelloides mucor mucedo)、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、漆斑菌属、新美鞭菌属、脉孢菌属(例如粗糙脉孢菌
hyaline))、双眉藻属(例如咖啡形双眉藻(amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线状变种(amphora coffeiformis linea)、咖啡形双眉藻斑点变种(amphora coffeiformis punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(amphora coffeiformis taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(amphora coffeiformis tenuis)、优美双眉藻(amphora delicatissima)、优美双眉藻头状变种(amphora delicatissima capitata)、双眉藻属的种(amphora sp.)、鱼腥藻属、纤维藻属(例如镰形纤维藻(ankistrodesmus falcatus))、泡叶藻属(例如岩衣藻(ascophyllum nodosum))、boekelovia(例如黄金色藻(boekelovia hooglandii))、包特氏菌属(例如包特氏菌属的种(borodinella sp.))、葡萄藻属(例如布朗葡萄藻(botryococcus braunii)、苏台德葡萄籽(botryococcus sudeticus))、四鞭藻、角毛藻属(例如纤细角毛藻(chaetoceros gracilis)、牟氏角毛藻(chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻亚盐变种(chaetoceros muelleri subsalsum)、角毛藻属的种(chaetoceros sp.))、小球藻属(例如无硝小球藻(chlorella anitrata)、南极小球藻(chlorella antarctica)、金绿小球藻(chlorella aureoviridis)、卡氏小球藻(chlorella candida)、包囊小球藻(chlorella capsulate)、脱水小球藻(chlorella desiccate)、椭圆小球藻(chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(chlorella emersonii)、淡褐小球藻(chlorella fusca)、淡褐小球藻空腔变种(chlorella fusca var.vacuolate)、谷氏小球藻(chlorella glucotropha)、水溪小球藻(chlorella infusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(chlorella infusionum var.actophila)、水溪小球藻增大变种(chlorella infusionum var.auxenophila)、凯氏小球藻(chlorella kessleri)、匍扇小球藻(chlorella lobophora)(sag 37.88株)、黄绿小球藻(chlorella luteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种(chlorella luteoviridis var.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变种(chlorella luteoviridis var.lutescens)、红藻小球藻(chlorella miniata)、微小小球藻(chlorella minutissima)、突变小球藻(chlorella mutabilis)、夜间小球藻(chlorella nocturna)、巴夫氏小球藻(chlorella parva)、嗜光小球藻(chlorella photophila)、普氏小球藻(chlorella pringsheimii)、原始小球藻(chlorella protothecoides)、原始小球藻耐酸变种(chlorella protothecoides var.acidicola)、小球藻(chlorealla)、规则小球藻(chlorella regularis)、规则小球藻小型变种(chlorella regularis var.minima)、规则小球藻伞状变种(chlorella regularis var.umbricata)、瑞氏小球藻(chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻(chlorella saccharophila)、嗜糖小球藻椭圆变种(chlorella saccharophila var.ellipsoidea)、盐生小球藻(chlorella salina)、简单小球藻(chlorella simplex)、耐热性小球藻(chlorella sorokiniana)、小球藻的种(chlorella sp.)、球形小球藻(chlorella sphaerica)、斯蒂格小球藻(chlorella stigmatophora)、万尼氏小球藻(chlorella vanniellii)、普通小球藻(chlorella vulgaris)、普通小球藻(chlorella vulgaris)、普通小球藻粗皮变种(chlorella vulgaris f.tertia)、普通小球藻自养变种(chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(chlorella vulgaris var.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变种(chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia)、普通小球藻普通变种绿色变种(chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis)、黄色小球藻(chlorella xanthella)、左氏小球藻(chlorella zofingiensis)、他伯氏小球藻
dissipata)、碎片菱形藻(nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(nitzschia hantzschiana)、平庸菱形藻(nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(nitzschia intermedia)、小头菱形藻(nitzschia microcephala)、微小菱形藻(nitzschia pusilla)、微小菱形藻椭圆变种(nitzschia pusilla elliptica)、微小菱形藻莫纳变种(nitzschia pusilla monoensis)、四边形菱形藻(nitzschia quadrangular)、菱形藻属的种(nitzschia sp.))、掠鞭藻属(例如掠鞭藻属的种(ochromonas sp.)、卵胞藻属(例如小卵胞藻(oocystis parva)、极小卵胞藻(oocystis pusilla)、卵胞藻属的种(oocystis sp.))、颤藻属(例如沼泽颤藻(oscillatoria limnetica)、颤藻属的种(oscillatoria sp.)、亚短颤藻(oscillatoria subbrevis))、掌形藻属(例如掌形藻(palmaria palmata))、帕氏藻属(例如嗜酸帕氏藻(pascheria acidophila))、巴夫藻属(例如巴夫藻属的种(pavlova sp.))、幅叶藻属(例如幅叶藻(petalonia fascia))、噬菌体属(phagus)、席藻属(phormidium)、扁藻属(例如扁藻属的种(platymonas sp.))、颗石藻属(例如卡氏颗石藻(pleurochrysis camerae)、齿状颗石藻(pleurochrysis dentate)、颗石藻属的种(pleurochrysis sp.))、紫菜属(例如哥伦比亚紫菜(porphyra columbina)、皱紫菜(porphyra crispata)、porhyra deutata、porhyra perforata、porhyra suborbiculata、甘紫菜(porphyra tenera))、紫球藻属(例如porphyridium cruentum、淡色紫球藻(porphyridium purpureum)、铜绿紫球藻(porphyridium aerugineum))、原壁藻属(例如魏氏原壁藻(prototheca wickerhamii)、雍滞原壁藻(prototheca stagnora)、波多黎各原壁藻(prototheca portoricensis)、桑堪形原壁藻(prototheca moriformis)、饶氏原壁藻(prototheca zopfii))、塔胞藻属(例如塔胞藻属的种(pyramimonas sp.))、桑堪藻属(pyrobotrys)、蔷薇藻属(rhodella)(例如rhodella maculate、蔷薇藻(rhodella reticulata)、rhodella violacea)、红皮藻属(例如掌状红皮藻(rhodymenia palmata))、金藻属(例如囊状金藻(sarcinoid chrysophyte))、栅藻属(例如被甲栅藻(scenedesmus armatus))、萱藻属(例如scytosiphon lome)、水绵属(spirogyra)、螺旋藻属(例如钝顶螺旋藻(spirulina platensis))、裂丝藻属(例如裂丝藻属的种(stichococcus sp.))、聚球藻属(例如聚球藻属的种(synechococcus sp.))、四角藻(tetraedron)、四爿藻属(例如四爿藻属的种(tetraselmis sp.)、亚心形扁藻(tetraselmis suecica))、海链藻属(例如威氏海链藻(thalassiosira weissflogii))和鲜绿球藻属(例如弗雷德鲜绿球藻(viridiella fridericiana))。
[0160]
根据上文任一项的重组宿主细胞可以包含改进重组乳蛋白的生产的遗传修饰。合适的遗传修饰的非限制性实例包括改变的激酶活性、改变的磷酸酶活性、改变的蛋白酶活性、改变的基因表达诱导途径、改变的参与蛋白质折叠的蛋白质的产生和/或活性，以及改变的参与蛋白质分泌(例如，囊泡运输)的蛋白质的产生和/或活性。
[0161]
用于将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞的方法是本领域众所周知的。此类方法的非限制性实例包括磷酸钙转染、树枝状大分子转染、脂质体转染(例如阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、deae-葡聚糖转染、细胞挤压、声穿孔、光学转染、原生质体融合、原生质体转化、穿刺转染、流体动力学递送、基因枪、磁转染、病毒转导、电穿孔和化学转化(例如，使用peg)。
[0162]
用于鉴定重组宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且包括筛选由多核苷酸、
重组表达构建体或重组载体编码的允许对于或针对细胞的生长进行选择的药物抗性或营养缺陷型标记物的表达，或通过其他方式(例如，检测包含在多核苷酸、重组表达构建体或重组载体中的发光肽，个体重组宿主细胞集落的分子分析[例如，通过限制酶作图、pcr扩增、southern分析，或分离的染色体外载体或染色体整合位点的序列分析])。
[0163]
可以使用本领域已知的任何合适的方法，例如在rna水平上最合适的是在蛋白质水平上进行的测定，或通过使用测量重组蛋白质的产生或活性的功能性生物测定，来评估根据上文任一项所述的重组宿主细胞的重组乳蛋白产生。这种测定的非限制性实例包括northern印迹、斑点印迹(dna或rna)、rt-pcr(逆转录酶聚合酶链式反应)、rna-seq、原位杂交、southern印迹、酶活性测定、免疫测定(例如，免疫组织化学染色、免疫测定、western印迹、elisa)和游离硫醇测定(例如，用于测量包含游离半胱氨酸残基的蛋白质的产生)。
[0164]
生产重组乳蛋白的方法
[0165]
在另一个方面，本文提供了生产根据上文任一项的重组乳蛋白的方法，其中该方法包括在培养基中在适合生产重组乳蛋白的条件下发酵根据上文任一项的重组宿主细胞的步骤。
[0166]
该方法可以进一步包括以下步骤：从发酵液中纯化重组乳蛋白以获得包含重组乳蛋白的制剂；和/或对重组乳蛋白进行后处理。
[0167]
或者，可以使用体外方法(例如，使用无细胞转录和/或翻译系统)获得重组乳蛋白。
[0168]
发酵
[0169]
用于产生重组乳蛋白的合适条件通常是根据上文任一项的重组宿主细胞可以生长和/或保持活力并产生重组乳蛋白的那些条件。
[0170]
合适条件的非限制性实例包括合适的培养基(例如，具有合适的营养含量[例如，合适的碳含量、合适的氮含量、合适的磷含量]、合适的补充剂含量、合适的痕量金属含量、合适的ph的培养基)、合适的温度、合适的进料速率、合适的压力、合适的氧化水平、合适的发酵持续时间(即包含重组宿主细胞的培养基的体积)、合适的发酵体积(即包含重组宿主细胞的培养基的体积)和合适的发酵容器。
[0171]
合适的培养基包括重组宿主细胞可以在其中生长和/或保持活力并产生重组乳蛋白的所有培养基。通常，培养基是包含碳源、可同化氮源(即，能够以适合重组宿主细胞的代谢利用的形式释放氮的含氮化合物)和磷酸盐源的水性培养基。
[0172]
碳源的非限制性实例包括单糖、二糖、多糖、乙酸盐、乙醇、甲醇、甘油、甲烷及其组合。单糖的非限制性实例包括右旋糖(葡萄糖)、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及其组合。二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、直链淀粉、半纤维素、麦芽糖糊精及其组合。
[0173]
可同化氮源的非限制性实例包括无水氨、硫酸铵、氢氧化铵、硝酸铵、磷酸二铵、磷酸一铵、焦磷酸铵、氯化铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨、蛋白质水解物、玉米浆、玉米浆固体、酒糟、酒糟提取物和酵母提取物。使用氨气便于大规模操作，并且可通过适当量的水性发酵液(发酵培养基)鼓泡使用。同时，这种氨也可用于辅助ph控制。
[0174]
培养基可以进一步包含无机盐、矿物质(例如，镁、钙、钾、钠；例如，以合适的可溶性可同化离子和组合形式)、金属或过渡金属(例如，铜、锰、钼、锌、铁、硼、碘；例如，以合适
的可溶可同化形式)、维生素和任何其他营养或功能成分(例如，可以防止重组乳蛋白降解的蛋白酶[例如，基于植物的蛋白酶]、可降低可降解重组乳蛋白的蛋白酶的活性的蛋白酶抑制剂和/或可虹吸掉蛋白酶活性的牺牲蛋白、消泡剂、抗微生物剂、表面活性剂，乳化油)。
[0175]
合适的培养基可从商业供应商处获得或可根据公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。
[0176]
合适的ph值可以是在2和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5、3或2.5之间；在2.5和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5或3之间；在3和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4或3.5之间；在3.5和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5或4之间；在4和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5之间；在4.5和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7或4.6之间；在4.6和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8或4.7之间；在4.7和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9或4.8之间；在4.8和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5或4.9之间；在4.9和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5之间；在5和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2或5.1之间；在5.1和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3或5.2之间；在5.2和8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4或5.3之间；在5.3和8、7.5、7、6.5、6、5.5或5.4之间；在5.4和8、7.5、7、6.5、6或5.5之间；在5.5和8、7.5、7、6.5或6之间；在6和8、7.5、7或6.5之间；在6.5和8、7.5或7之间；在7和8或7.5之间；或在7.5和8之间。
[0177]
合适的温度可以是20℃和46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃、24℃或22℃之间；22℃和46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃或24℃之间；24℃和46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃或26℃之间；26℃和46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃或28℃之间；28℃和46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃或30℃之间；30℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃或32℃之间；32℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃或34℃之间；36℃至46℃、44℃、42℃、40℃或38℃之间；38℃至46℃、44℃、42℃或40℃之间；40℃至46℃、44℃或42℃、42℃至46℃或44℃之间；或44℃和46℃之间的温度。
[0178]
合适的进料速率可以是每小时每克细胞干重(dcw)0.01g和0.2g葡萄糖当量之间的进料速率。
[0179]
合适的压力可以是介于0psig和50psig、40psig、30psig、20psig或10psig之间；介于10psig和50psig、40psig、30psig或20psig之间；介于20psig和50psig、40psig或30psig之间；介于30psig和50psig或40psig之间；或介于40psig和50psig之间的压力。
[0180]
合适的氧合可以是每分钟每发酵罐中液体体积0.1体积氧气(vvm)和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm、0.5vvm或0.3vvm之间；在0.3vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm或0.5vvm之间；在0.5vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm或0.7vvm之间；在0.7vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm或0.9vvm之间；在0.9vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm或1.1vvm之间；在1.1vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm或1.3vvm之间；在1.3vvm和2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm或1.5vvm之间；在1.5vvm和2.1vvm、1.9vvm或1.7vvm之间；在1.7vvm和2.1vvm或1.9vvm之间；或在1.9vvm和2.1vvm之间的通气
速率。
[0181]
合适的发酵持续时间可以是10小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时、30小时或20小时之间；20小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时或30小时之间；30小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时或40小时之间；40小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时或50小时之间；50小时至500小时、400小时、300小时、200小时或100小时之间；100小时至500小时、400小时、300小时或200小时之间；200小时至500小时、400小时或300小时之间；300小时至500小时或400小时之间；或在400小时和500小时之间的发酵持续时间。
[0182]
合适的发酵体积可以在1l和10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l、5,000l、1,000l、500l、100l、50l或10l之间；在10l和10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l、5,000l、1,000l、500l、100l或50l之间；在50l和10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l、5,000l、1,000l、500l或100l之间；在100l和10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l、5,000l、1,000l或500l之间；在500l和10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l、5,000l或1,000l之间；1,000l至10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l、10,000l或5,000l之间；5,000l至10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l、50,000l或10,000l之间；10,000l至10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l、100,000l或50,000l之间；50,000l至10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l、500,000l或100,000l之间；100,000l至10,000,000l、5,000,000l、1,000,000l或500,000l之间；500,000l至10,000,000l、5,000,000l或1,000,000l之间；1,000,000l至10,000,000l或5,000,000l之间；或在5,000,000l和10,000,000l之间。
[0183]
合适的发酵容器可以是本领域已知的任何发酵容器。合适的发酵容器的非限制性实例包括培养板、摇瓶、发酵罐(例如，搅拌罐发酵罐、气升式发酵罐、气泡柱发酵罐、固定床生物反应器、实验室发酵罐、工业发酵罐或它们的任何组合)，以任何合适的规模(例如，小规模、大规模)和在任何过程中(例如，固体培养、浸没培养、分批、补料分批或连续流)使用。
[0184]
纯化
[0185]
用于纯化重组蛋白(例如，从发酵液)以获得包含重组蛋白的制剂的方法是本领域众所周知的(分别参见，例如，protein purification,jc janson and l ryden,eds.,vch publishers,new york,1989；protein purification methods:a practical approach,elv harris and s angel,eds.,irl press,oxford,england,1989)，并且可以经调适以纯化根据上文任一项的重组乳蛋白。
[0186]
根据上述任何一项的重组乳蛋白可以基于其分子量进行纯化，例如，通过尺寸排阻/交换色谱法、通过膜的超滤、凝胶渗透色谱法(例如，制备盘-凝胶电泳)或密度离心。
[0187]
根据上文任一项的重组乳蛋白还可以基于其表面电荷或疏水性/亲水性进行纯化，例如通过等电沉淀、阴离子/阳离子交换色谱、等电聚焦(ief)或反向相色谱。
[0188]
根据上文任一项的重组乳蛋白也可以基于其溶解度进行纯化，例如通过硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、去污剂或溶剂萃取。
[0189]
根据上文任一项的重组乳蛋白也可以基于其对另一分子的亲和力进行纯化，例如
通过亲和层析、活性染料或羟基磷灰石。亲和层析可包括使用对重组乳蛋白具有特异性结合亲和性的抗体，或与重组乳蛋白上的糖部分结合的凝集素，或与重组乳蛋白特异性结合的任何其他分子。重组乳蛋白可包含与其c-或n-末端可操作连接的标签肽或多肽，以促进重组乳蛋白的基于亲和性的纯化。合适的标签肽或多肽的非限制性实例包括亲和标签(即，与某些试剂或基质结合的肽或多肽)、增溶标签(即，有助于蛋白质正确折叠和防止沉淀的肽或多肽)、色谱标签(即改变蛋白质色谱特性以在特定分离技术中提供不同分辨率的肽或多肽)、表位标签(即与抗体结合的肽或多肽)、荧光标签、显色标签、酶底物标签(即，作为特定酶促反应底物的肽或多肽)、化学底物标签(即，作为特定化学修饰底物的肽或多肽)、自切割标签(具有可诱导蛋白水解活性的肽或多肽；例如，分选酶标签、npro标签、frpc模块、cpd)、疏水标签(高度疏水并引导蛋白质用于包涵体形成的蛋白质或多肽；例如，ksi标签、trpe标签)或其组合。合适的亲和标签的非限制性实例包括麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签、聚(his)标签、sbp-标签、strep-标签和钙调蛋白-标签。合适的溶解度标签的非限制性例子包括硫氧还蛋白(trx)标签、聚(nanp)标签、mbp标签、sumo标签、gb1标签、nusa cbd标签和gst标签。色谱标签的非限制性实例包括聚阴离子氨基酸标签(例如，flag-标签)和聚谷氨酸标签。表位标签的非限制性实例包括v5-标签、vsv-标签、e-标签、ne-标签、血凝素(ha)-标签、myc-标签和flag-标签。荧光标签的非限制性例子包括绿色荧光蛋白(gfp)标签、蓝色荧光蛋白(bfp)标签、青色荧光蛋白(cfp)标签、黄色荧光蛋白(yfp)标签、橙色荧光蛋白(ofp)标签、红色荧光蛋白质(rfp)标签及其衍生物。酶底物标签的非限制性实例包括在适合生物素化的序列内包含赖氨酸的肽或多肽(例如，avitag、生物素羧基载体蛋白[bccp])。化学底物标签的非限制性例子包括适合与fiash-edt2反应的底物。可以在分离重组乳蛋白后去除标签肽或多肽(例如，通过蛋白酶切割)。
[0190]
在根据上文任一项的重组乳蛋白由根据上文任一项的重组宿主细胞分泌的实施方案中，可以直接从培养基中纯化重组乳蛋白。在其他实施方案中，重组乳蛋白可以从细胞裂解物中纯化。
[0191]
重组乳蛋白可以纯化至相对于发酵液或制剂中包含的其他组分大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度，或相对于发酵液中包含的其他组分至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍更高的丰度，或按重量计大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度。
[0192]
重组乳蛋白的身份可以通过高效液相色谱(hplc)、蛋白质印迹分析、western印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失和二维质谱(2d-ms/ms)序列鉴定来确认和/或定量。
[0193]
后处理
[0194]
后处理可以改变重组乳蛋白的某些化学和/或物理性质，包括但不限于大小、电荷、疏水性、亲水性、溶剂化、蛋白质折叠和化学反应性。
[0195]
后处理可以包括重组蛋白的再折叠(例如，通过去除变性剂)、片段化(例如，通过化学方式或通过暴露于蛋白酶[例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶])、加热(例如，以去除蛋白质聚
集体)、去除反应位点(例如，通过氧化去除甲硫氨酸和/或色氨酸残基的反应位点)、调节(例如，通过化学、光化学和/或酶促策略)、去矿物质(通过例如，透析、超滤、反向渗透，离子交换色谱)、环化、去除标签和/或融合多肽(例如，通过暴露于位点特异性蛋白酶)、生物素化(即，附着生物素)，以及与其他元件(例如，聚乙二醇，抗体、脂质体、磷脂、dna、rna、多核苷酸、糖、二糖、多糖、淀粉、纤维素、去污剂、细胞壁)缀合。
[0196]
后处理可以以随机方式或以位点特异性方式发生(例如，在半胱氨酸残基的巯基处[例如，用于氨乙基化、碘乙酰胺的形成、马来酰亚胺的形成、dha的形成、通过二硫键的共价连接和脱硫]、在赖氨酸残基的伯胺基处[例如，用于连接活化酯、磺酰氯、异硫氰酸酯、不饱和醛酯和醛]、在酪氨酸残基的酚羟基处、在特定的变应原表位处[例如，聚糖基团])。
[0197]
重组乳蛋白可以经喷雾干燥或通过蒸发浓缩(例如，以获得粉末)。
[0198]
包含重组乳蛋白的组合物
[0199]
在另一方面，本文提供了包含乳蛋白组分的组合物，其中所述乳蛋白组分包含根据上文任一项的重组乳蛋白或由其组成，并且其中所述组合物与相应的组合物相比具有减弱或基本上消除的变应原性。
[0200]
组合物可包含按质量计0.1％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％,0.7％,0.6％,0.5％,0.4％,0.3％或0.2％；0.2％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％,0.7％,0.6％,0.5％,0.4％或0.3％；0.3％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％,0.7％,0.6％,0.5％或0.4％；0.4％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％,0.7％,0.6％或0.5％；0.5％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％,0.7％或0.6％；0.6％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％,0.8％或0.7％；0.7％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.9％或0.8％；0.8％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％或0.9％；0.9％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％；1％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％或2％；2％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,
70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％或3％；3％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％或4％；4％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％或5％；5％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％或6％；6％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％或7％；7％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％或8％；8％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％,10％或9％；9％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％,11％或10％；10％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％,12％或11％；11％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％,13％或12％；12％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,14％或13％；13％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或14％；14％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％或15％；15％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％或20％；20％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％或25％；25％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％或30％；30％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％或35％；35％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％或40％；40％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％或45％；45％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％或50％；50％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％或55％；55％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％或60％；60％至100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％或65％；65％至100％,95％,90％,85％,80％,75％或70％；70％至100％,95％,90％,85％,80％或75％；75％至100％,95％,90％,85％或80％；80％至100％,95％,90％或85％；或85％至100％,95％,90％；90％至100％或95％或95％至100％的乳蛋白组分。
[0201]
在标准环境温度和条件下(即，20-30℃和0.95-1.05atm)，根据上文任一项的组合物可以是流体、半固体(例如凝胶状)、固体或粉末。粉末可包含小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％或小于1％；或在0.1％和20％、15％、10％、5％或1％之间；在1％和20％、15％、10％或5％之间；在5％和20％、15％或10％之间；在10％和20％或15％之间；或在15％和20％之间的水分含量。粉末可以以粉末形式使用，或者粉末可以在使用前
用水合剂重构，或者粉末可以在将水合剂添加到混合物中前与其他干燥组分(例如面粉、糖、矿物质、ph或离子强度调节剂)混合。
[0202]
根据上文任一项的组合物可以进一步包含其他成分(例如，本文公开的任何其他成分)。例如，该组合物可以包含按质量计0.001％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％或0.01％；0.01％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％或0.1％；0.1％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％或0.5％；0.5％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％；1％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％或2％；2％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％或3％；3％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％或4％；4％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％或5％；5％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％,7％或6％；6％至50％,25％,20％,15％,10％,9％,8％或7％；7％至50％,25％,20％,15％,10％,9％或8％；8％至50％,25％,20％,15％,10％或9％；9％至50％,25％,20％,15％或10％；10％至50％,25％,20％或15％；15％至50％,25％或20％；20％至50％或25％；或25％至50％的任何一种此类其他成分、两种或更多种此类其他成分的任何组合或所有此类其他成分。
[0203]
根据上文任一项的组合物可以基本上不含哺乳动物产生的乳汁(例如，牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶)中发现的组分，或可以包含较低浓度的在哺乳动物产生的乳汁中发现的至少一种组分。在源自哺乳动物的乳汁中发现的组分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂质。
[0204]
根据上文任一项的组合物可以基本上不含从动物获得的组分(即，对于动物天然的组分，包括动物产品[即，动物的可食用的或通常经制备用于人类食用的部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血液]、动物副产品[即通常不能单独食用，而是屠宰动物以供食用的副产品；例如，动物骨头、动物尸体和从其分离的成分]、由动物生产的产品[例如，哺乳动物来源的乳汁、鸡蛋、蜂蜜]，以及由此产生的消费品[例如，明胶、凝乳酶、从哺乳动物来源的乳汁中提取的乳清蛋白、从哺乳动物来源的乳汁中提取的酪蛋白、从哺乳动物来源的乳汁中提取的乳脂质、动物脂质、动物蛋白])，或包含按质量计2％或更少的此类组分。
[0205]
根据上文任一项的组合物可具有低于可比较组合物的变应原性的变应原性，例如相对于可比较的组合物的变应原性不超过0％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的变应原性。变应原性可以使用皮肤点刺试验、血液试验或口服试验来测量。
[0206]
根据上文任一项的组合物可以是多种产品，包括例如食品(即，为饮食目的而摄入的产品)、化妆品和个人护理产品(例如，软膏、洗剂、乳膏)[例如保湿霜]、清洁剂、按摩霜、肥皂、洗发水、护发素、面膜、精加工产品、生发水、牙膏、口香糖、牙龈清洁剂、润肤露/乳霜)、医药产品(例如，用于递送药剂的产品[例如，包裹治疗剂或营养品以进行递送(例如，受控递送)的微米或纳米颗粒(例如，珠子、胶束)]、片剂、胶囊、压片、水凝胶的包衣)，聚合物(即由相互直接或通过中间分子共价连接的重复分子单元组成的分子)和具有工业用途的组合物(例如电介质)。
[0207]
乳蛋白组分
[0208]
包含在根据上文任一项的组合物中的乳蛋白组分由根据上文任一项的重组乳蛋白和任选地其他乳蛋白组成。
[0209]
重组乳蛋白可以是根据上文任一项的单一重组乳蛋白，或者可以是根据上文任一项的两种或更多种重组乳蛋白的混合物。
[0210]
任选的其他乳蛋白可以是天然乳蛋白或本文未提供的重组乳蛋白。天然或重组乳蛋白可获自任何哺乳动物物种(例如本文公开的任何哺乳动物物种)。2018年3月27日授权的美国专利9,924,728；2019年7月18日公开的美国公开us20190216106；以及2019年11月7日公开的pct公开wo2019213155(其整体并入本文)中公开了提取天然乳蛋白和/或生产重组乳蛋白的方法。
[0211]
任选的其他乳蛋白可以是单一的其他乳蛋白，或者可以是两种或更多种其他乳蛋白。其他乳蛋白的非限制性实例包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、糖巨肽(gmp)、κ-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、α-s1-酪蛋白和α-s2-酪蛋白。不希望受理论限制，据信，与缺乏gmp的相同组合物相比，根据上文任一项的重组乳蛋白与gmp的复合可进一步减弱组合物的变应原性。
[0212]
乳蛋白组分可以例如包含以下或由其组成：根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和本文未提供的天然β-乳球蛋白或重组β-乳球蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组gmp；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组κ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组β-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组β-s1-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白和天然或重组β-s2-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组gmp；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组κ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组β-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组α-s1-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组α-乳清蛋白(例如，根据上文任一项的重组α-乳清蛋白)和天然或重组α-s2-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、以及天然或重组κ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、以及天然或重组β-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、以及天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、以及天然或重组β-s1-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、以及天然或重组α-s2-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组κ-酪蛋白、以及天然或重组β-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组κ-酪蛋白、以及天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组κ-酪蛋白、以及天然或重组α-s1-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组κ-酪蛋白、以及天然或重组α-s2-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组β-酪蛋白、以及天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组
β-乳球蛋白、天然或重组β-酪蛋白、以及天然或重组α-s1-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组β-酪蛋白、以及天然或重组α-s2-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组κ-酪蛋白和天然或重组β-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组κ-酪蛋白和天然或重组γ-酪蛋白；或根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组β-酪蛋白和天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组κ-酪蛋白和天然或重组γ-酪蛋白；根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组β-酪蛋白和天然或重组α-s1-酪蛋白；或根据上文任一项的重组β-乳球蛋白、天然或重组gmp、天然或重组β-酪蛋白和天然或重组α-s2-酪蛋白。
[0213]
乳蛋白组分可以由乳清蛋白和酪蛋白组成，其质量比介于约10比1和约1比10之间(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比15、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9、约1比10)。
[0214]
乳蛋白组分可以由重组乳蛋白和天然乳蛋白组成，其质量比介于约100比1和约1比100之间(例如，约100比1、约90比1、约80比1、约70比1、约60比1、约50比1、约40比1、约30比1、约20比1、约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9、约1比10、约1比20、约1比30、约1比40、约1比50、约1比60、约1比70、约1比80、约1比90或约1比100)。
[0215]
乳蛋白组分可以由重组乳清蛋白和天然乳清蛋白组成，其质量比介于约100比1和约1比100之间(例如，约100比1、约90比1、约80比1、约70比1、约60比1、约50比1、约40比1、约30比1、约20比1、约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9、约1比10、约1比20、约1比30、约1比40、约1比50、约1比60、约1比70、约1比80、约1比90或约1比100)。
[0216]
其他成分
[0217]
任选地包含在根据上文任一项的组合物中的其他成分可以是任何其他成分。
[0218]
合适的其他成分的非限制性实例包括非乳蛋白、生物活性剂、营养剂和功能剂。
[0219]
任选的非乳蛋白可以由源自任何来源的一种或多种天然和/或重组非乳蛋白以及源自各种来源的天然和/或重组非乳蛋白的混合物组成。合适来源的非限制性例子包括动物、植物、藻类、真菌或细菌。动物蛋白的非限制性实例包括结构动物蛋白(例如，胶原蛋白、原弹性蛋白、弹性蛋白)、卵蛋白(例如，本文中的卵类粘蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白、g162m f167a卵类粘蛋白、卵球蛋白g2、卵球蛋白g3、α-卵粘蛋白、β-卵粘蛋白、溶菌酶、卵抑制剂、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、卵抑素、胱抑素、抗生物素蛋白、卵清蛋白相关蛋白x、卵清蛋白相关蛋白y)和球状蛋白(例如白蛋白)。植物蛋白的非限制性实例包括豌豆蛋白(例如豆球蛋白、蚕豆球蛋白、covicillin)和马铃薯蛋白(例如马铃薯球蛋白、蛋白酶抑制剂notate ii)。任选的非乳蛋白可以包含重组非乳蛋白(例如，具有哺乳动物ptm、非哺乳动物ptm或其混合物和/或缺少哺乳动物ptm和/或缺乏可以在人或动物中引发免疫反应的表位的重组非乳蛋白)。
[0220]
生物活性剂的非限制性实例包括营养制品(即，具有生理益处或提供针对疾病的保护的化合物)和治疗剂(即，治疗疾病的化合物)。
[0221]
营养剂的非限制性实例包括营养补充剂、益生元、益生菌、维生素原、维生素、矿物
质、抗氧化剂、碳水化合物、脂质以及必需和半必需氨基酸。
[0222]
维生素的非限制性实例包括脂溶性维生素、水溶性维生素、硫胺素(维生素b1)、核黄素(维生素b2)、烟酸(维生素b3)、泛酸(分别为维生素b5)、维生素b6(吡哆醇)、维生素b12(钴胺素)、维生素c、叶酸、维生素a、维生素d、维生素e、维生素k，以及它们的衍生物和混合物。
[0223]
矿物质的非限制性实例包括钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐、氯化物、磷酸盐、硫酸盐、镁、钾、锌、铁、钼、锰、铜及其混合物。
[0224]
抗氧化剂的非限制性实例包括α-生育酚(例如，包含在牛乳中的生育酚)、低分子量硫醇(例如，包含在牛乳中的低分子量硫醇)、视黄醇(例如，包含在牛乳中的视黄醇)、类胡萝卜素(例如，包含在牛奶中的类胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、虾青素)、维生素e、印楝提取物、核黄素、迷迭香提取物、迷迭香提取物中包含的酚类二萜(例如，鼠尾草酚、鼠尾草酸)、鼠尾草提取物、抗坏血酸(维生素c)及其盐、乳酸及其盐、葡萄渣青贮饲料、葡萄渣青贮饲料中包含的酚类化合物(例如阿魏酸)、大豆(glycine max)提取物、大豆提取物中包含的异黄酮或多酚化合物、大蒜(allium sativum)提取物、酚类或黄酮类化合物、或大蒜提取物中包含的萜类化合物、茴香(foeniculum vulgare mill.)提取物、洋甘菊(matricaria recutita l.)提取物、脂肪酸(例如α-硫辛酸)、褐藻(例如泡叶藻(ascophyllum nodosum)、墨角藻(fucus vesiculosus))、绿粉红辣椒的精油(geo)、成熟粉红辣椒的精油(meo)、绿茶提取物、丁基化羟基茴香醚(e320)、丁基化羟基甲苯(e321)、多酚类(例如姜黄素、类姜黄素、去甲氧基姜黄素(hydroxycirmamoyl feruloylmethane)、双-去甲氧基姜黄素)、儿茶素(例如,包含在绿茶提取物中的表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素、c儿茶素、儿茶素)及其衍生物和混合物。
[0225]
碳水化合物的非限制性实例包括：单糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖及其混合物；二糖，例如麦芽糖、乳糖、蔗糖及其混合物；多糖，例如淀粉(例如，果胶、玉米(玉蜀黍)淀粉、燕麦淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、大米淀粉、豌豆淀粉、小麦淀粉、小豆淀粉、绿豆淀粉、葛根淀粉、片栗淀粉、竹芋淀粉、绿豆淀粉、西米淀粉、木薯淀粉、植物淀粉(例如，从本文公开的任何植物获得的淀粉)及其衍生物，以及它们中的两种或更多种的混合物。在一些实施方案中，淀粉是改性淀粉(例如，预糊化淀粉(例如，玉米、小麦、木薯)、预糊化高直链淀粉含量淀粉、预糊化水解淀粉(例如，麦芽糖糊精、玉米糖浆固体、大米糖浆固体、木薯糖浆固体)、化学改性淀粉，例如预糊化取代淀粉(例如辛烯基琥珀酸改性淀粉)、碱性改性淀粉、漂白淀粉、氧化淀粉、磷酸单淀粉、磷酸二淀粉、磷酸二淀粉磷酸、乙酰化磷酸二淀粉、乙酰化淀粉，醋酸单淀粉，乙酰化淀粉，醋酸单淀粉，乙酰化己二酸二淀粉，甘油二淀粉，羟丙基淀粉，羟丙基二淀粉甘油，羟丙基二淀粉磷酸酯，淀粉辛烯基琥珀酸钠，乙酰化氧化淀粉，糊精，辛烯基琥珀酸钠淀粉，及其衍生物，以及其中两种或更多种的混合物)、面粉(例如，橡子粉、杏仁粉、苋菜粉、阿塔粉、大麦粉、豆粉、荞麦粉、木薯粉、栗子粉、粉、椰子粉、玉米(玉蜀黎)粉、硬粒小麦粉、单粒小麦粉、二粒小麦粉、蚕豆粉、鹰嘴豆粉、磨碎的奇亚籽、磨碎的亚麻籽、大麻粉、呼罗珊粉、扁豆粉、麦达粉、大麦麦芽粉、马萨粉、牧豆树粉,小米粉、坚果粉、燕麦粉、豌豆粉、花生粉、马铃薯粉、藜麦粉、大米粉、黑麦粉、高粱粉、大豆粉、斯佩尔特小麦粉、甜米粉、芋头粉、苔麸粉、小麦粉、活性小麦面筋、磨碎的奇亚籽、磨碎的亚麻籽及其衍生
物，以及其中两种或更多种的混合物)、树胶(例如葛粉、黄原胶、阿拉伯树胶(阿拉伯胶)、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶(角豆胶)、黄蓍胶、角叉菜胶、塔拉胶、小麦胶、魔芋胶、琼脂胶、刺梧桐胶、兰茎粉、改性纤维素(例如甲基纤维素、甲氧基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素)及其衍生物和混合物。在一些实施方案中，树胶是改性树胶(例如，脱乙酰基、脱乙酰基澄清的、部分脱乙酰基、部分脱乙酰基澄清的及其衍生物，以及其两种或更多种的混合物))、可食用纤维(例如，阿拉伯胶纤维、竹纤维、大麦麸、胡萝卜纤维、纤维素(例如木浆纤维素)、柑橘纤维、玉米麸、可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维、燕麦麸、豌豆纤维、米麸、头壳、洋车前子壳、魔芋、大豆纤维、大豆多糖、小麦麸、菊粉和它们的衍生物，以及它们的两种或更多种的混合物)，以及它们的两种或更多种的混合物；以及其两种或多种的混合物。
[0226]
脂质的非限制性实例包括脂肪、油、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸。
[0227]
油的非限制性实例包括植物油(例如，向日葵油、椰子油、芥菜籽油、花生油、亚麻荠油、菜籽油、玉米油、棉籽油、萼距花油、亚麻籽油、橄榄油、棕榈油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、杏仁油、山毛榉坚果油、巴西坚果油、腰果油、榛子油、澳洲坚果油、蒙刚果油、山核桃油、松子油、开心果油、核桃油、鳄梨油、葡萄油)、微生物衍生的油、藻衍生的油、真菌衍生的油、海洋动物油(例如，大西洋鱼油、太平洋鱼油、地中海鱼油、轻压鱼油、碱处理鱼油、热处理鱼油、轻和重棕色鱼油、鲣鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲈鱼油、大比目鱼油、矛鱼油、梭鱼油、鳕鱼油、鲱鱼油、日本沙丁鱼油、鳀鱼油、毛鳞鱼油、大西洋鳕鱼油、大西洋鲱鱼油、大西洋鲭鱼油、大西洋步鱼油、鲑鱼油和鲨鱼油、枪乌贼油、墨鱼油、章鱼油、磷虾油、海豹油、鲸油)、非精油、精油、天然油、非氢化油、部分氢化油、氢化油(例如氢化椰子油)、原油、半精炼(也称为碱精炼)油、酯交换油和精炼油。在一些实施方案中，长链油(例如，向日葵油、玉米油、橄榄油、豆油、花生油、核桃油、杏仁油、芝麻油、棉籽油、菜籽油、红花油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈果油、椰子油、巴巴苏油、乳木果油、芒果油、可可油、小麦胚芽油、米糠油、过量表达油酸400％的工程化葵花油)与短链甘油三酯组合以生产酯交换脂肪酸酯(例如，以产生特定的风味特征)。
[0228]
甘油单酯和甘油二酯的非限制性实例包括植物来源的甘油单酯和甘油二酯(例如，源自向日葵、椰子、花生、棉籽、橄榄、棕榈、油菜籽、红花、芝麻、大豆、杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、蒙刚果、山核桃、松子、开心果、核桃和鳄梨的甘油单酯和甘油二酯)。甘油单酯和甘油二酯可包含本领域已知的任何游离脂肪酸的酰基链，包括本文公开的任何游离脂肪酸的酰基链。
[0229]
游离脂肪酸的非限制性实例包括丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十二烷酸、蜡酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、杉皮酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、ω-脂肪酸(例如,花生四烯酸、ω-3-脂肪酸、ω-6-脂肪酸、ω-7-脂肪酸、ω-9-脂肪酸)、4-16个碳长度的偶数碳脂肪酸、单饱和酸(特别是具有18个碳)、具有低界面张力的脂肪酸(例如，小于20、小于15、小于11、小于9、小于7、小于5、小于3、小于2、小于1或小于0.5达因/厘米，从0.1到20，从1到15，从2到9，从3到9，从4到9，从5到9，从2到7，从0.1到5，从0.3至2，或从0.5至1达因/厘米,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,
7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5,13.0,13.5,14.0,14.5,15.0,15.5,16.0,16.5,17.0,17.5,18.0,18.5,19.0,19.5或20.0)、在sn-3处酯化的丁酸(4:0)酸或己酸(6:0)，中链脂肪酸(8:0
–
14:0)以及在位置sn-1和sn-2处酯化的16:0，其中硬脂酸(18:0)位于位置sn-1的脂肪酸，其中油酸(18:1)位于位置sn-1和sn-3的脂肪酸，具有一系列碳原子(例如，8至40、10至38、12至36、14至34、16至32、18至30或20至28个碳原子)的脂肪酸，包含至少一个不饱和键(即碳碳双键或三键；例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个碳-碳双键和/或三键)的脂肪酸，具有缀合的不饱和键(即，至少一对碳-碳双键和/或三键键合在一起，它们之间没有亚甲基(ch2)基团(例如4ch:chi ch:chi)的脂肪酸，和上述脂肪酸的衍生物(例如酯(例如甲酯和乙酯)、盐(例如钠盐和钾盐)、甘油三酯衍生物、甘油二酯衍生物、甘油单酯衍生物)。游离脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。在一些实施方案中，游离脂肪酸不是来源于哺乳动物或由哺乳动物产生。
[0230]
磷脂的非限制性实例包括卵磷脂(例如，大豆卵磷脂、向日葵卵磷脂、棉花卵磷脂、油菜籽卵磷脂、米糠卵磷脂、玉米卵磷脂、面粉卵磷脂)、心磷脂、神经酰胺磷酸胆碱、神经酰胺磷酸乙醇胺、甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷鞘脂和磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，磷脂不是来源于哺乳动物或由哺乳动物产生。
[0231]
甘油三酯的非限制性实例包括三丁酸甘油酯、短链甘油三酯、包含三种油酸的短链甘油三酯；包含己酸的短链甘油三酯；包含己酸和丁酸的短链甘油三酯；包含己酸和癸酸的短链甘油三酯；以及包含一种丁酸、一种己酸和一种辛酸的短链甘油三酯。
[0232]
必需和半必需氨基酸的非限制性实例包括半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。
[0233]
功能性试剂的非限制性实例包括酸化剂、缓冲剂、保质期延长剂、ph和/或离子强度调节剂、抗微生物剂、抗氧化剂、防腐剂、乳化剂、增塑剂、质地/口感剂、着色剂、调味剂/风味剂、芳香剂、膨松剂和流动剂。
[0234]
保质期延长剂的非限制性实例包括一氧化碳、亚硝酸盐、焦亚硫酸钠、bombal及其衍生物和混合物。
[0235]
防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸酯衍生物、山梨酸、苯甲酸、乳链菌肽、游霉素及其衍生物和混合物。
[0236]
乳化剂的非限制性实例包括阴离子乳化剂、非离子乳化剂、阳离子乳化剂、两性乳化剂、生物乳化剂、空间乳化剂、pickering乳化剂、糖脂(例如海藻糖脂、槐糖脂、鼠李糖脂、甘露糖基赤藓糖醇脂)、寡肽(例如短杆菌肽s,多粘菌素)、脂肽(例如,表面活性素)、磷脂、脂肪酸、中性脂质、聚合生物表面活性剂、两亲性多糖、脂多糖、蛋白质(例如,豌豆蛋白、大豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、藻类蛋白、酵母蛋白、马铃薯蛋白、扁豆蛋白)、甘露糖蛋白、磷酸钠、硬脂酰乳酸钙、甘油单酯的单乙酰和双乙酰酒石酸酯、磷脂、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸镁、脂肪酸的钠/钾/钙盐、硬脂酰二乳酸钙、聚-甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油单酯的乙酸酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的柠檬酸酯、脂肪酸的聚甘油酯、聚甘油聚蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙烷-1,2-二醇酯、糖酯、脂肪酸的蔗糖酯、甘油单酯、乙酰化甘油单酯、乳酰化甘油单酯、甘油二酯、磷酸单甘油酯、二乙酰酒石酸酯、硬脂酰-2-乳酸钠/钙、磷脂铵、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯-80、羧甲基纤维素(cmc)、调制纤维素、柠檬酸酯、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、甲壳素、emulsan、卵磷脂(例如，植物基卵磷脂、鹰嘴豆卵磷脂、蚕豆卵磷脂、大豆卵磷
脂、向日葵卵磷脂、芥花卵磷脂)、表面活性剂(例如，山梨糖醇三油酸酯(分别为span 85)、山梨糖醇三硬脂酸酯(分别为span 65)、山梨糖醇倍半油酸酯(arlacel 83)，甘油单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯(span 80)、失水山梨糖醇单硬脂酸酯(span 60)、失水山梨糖醇单棕榈酸酯(span 40)、失水山梨糖醇单月桂酸酯(span 20)、聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯(分别为tween 65)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(分别为tween 85)、聚乙二醇400单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60(tween 60)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80(tween 80)、聚山梨醇酯40(tween 40)、聚山梨醇酯20(tween 20)、peg 20三硬脂酸酯、peg 20三油酸酯、peg 20单硬脂酸酯、peg 20单油酸酯、peg 20单棕榈酸酯和peg 20单月桂酸酯脱水山梨糖醇)及其衍生物和混合物。
[0237]
增塑剂的非限制性实例包括二乙醇胺、三乙醇胺、甘油、山梨糖醇、peg-300、peg-600、尿素、辛酸、棕榈酸、酒石酸二丁酯和邻苯二甲酸酯、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、果糖、己酸、氢己酸、二-、三-或四-乙二醇、甘油、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、蔗糖及其衍生物和混合物。
[0238]
质地/口感剂的非限制性实例包括树胶(例如，瓜尔胶、角豆树胶、小麦胶、黄原胶)、膨松剂、填充剂、抗粘附化合物、分散剂、吸湿化合物、化学合成剂(chemesthetic agent)、成膜剂、增稠剂、硬化剂、软化剂、稳定剂、抗结块剂、消泡剂及其衍生物和混合物。
[0239]
风味剂/芳香剂的非限制性实例包括丁酸乙酯、2-呋喃甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯、δ-十一内酯、丙二醇、甘油、乙醇、二甲硫醚、2-甲基丁醇、4-顺-庚烯醛2-反式壬烯醛、丙酮、2-十一酮、2-丁酮、戊醇、δ-癸内酯、2-庚酮、δ-十二内酯、2-壬酮、δ-十四内酯、硫化氢、二甲基砜、苯并噻唑、2-戊酮、2-十三酮、δ-辛内酯、2-十五酮、天然香料、人工香料(例如，巧克力调味料、咖啡调味料、草莓调味料、杏仁调味料、榛子调味料、香草调味料、绿茶调味料、爱尔兰奶油调味料、椰子调味料)、甜味剂(例如，非蛋白质甜味剂、蛋白质基甜味剂)及其衍生物和混合物。
[0240]
非蛋白质甜味剂的非限制性实例包括糖、改性糖、天然甜味剂、甜蛋白、人造甜味剂、糖醇、糖纤维、糖提取物，包括：蔗糖、甘蔗汁、玉米糖、高果糖玉米糖浆、玉米甜味剂、龙舌兰糖浆、大麦麦芽糖浆、桦木糖浆、黑糖浆、糙米糖浆、焦糖、玉米糖、葡萄糖、douxmatok糖浆、椰子糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖果糖糖浆、金糖浆,乙酰磺胺酸钾、糖精、阿力糖、阿斯巴甜、阿斯巴甜-安赛蜜盐、环己基氨基磺酸盐(例如环己基氨基磺酸钠)、赤藓糖醇、低聚果糖、阿洛酮糖、葡萄糖醇(山梨糖醇)、甘油(丙三醇)、甘草甜素、金糖浆、hfcs-42、hfcs-55、hfcs-90、高麦芽糖玉米糖浆、蜂蜜、椰枣糖浆、hsh、氢化淀粉水解物(hsh)、异麦芽酮糖、异麦芽寡糖(imo)、异葡萄糖、菊粉、转化糖、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、乳糖、左旋糖(果糖)、罗汉果(又名罗汉果)、麦芽糖醇、麦芽糊精、麦芽糖、甘露醇、枫糖浆、糖蜜、莫纳甜、莫奈林、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、低聚果糖、棕榈糖、聚葡萄糖、rapadura、精炼糖浆、糖精、蔗糖、高粱糖浆、甜叶菊、rebm、reba、rebd、甜菊苷、三氯蔗糖、蔗糖、塔格糖、欧亚水龙骨甜素(osladin)、甘素、甜素、阿磺胺钾(asulfame potassium)、l-天冬氨酰-l-苯丙氨酸、p-4000、罗汉果苷、海藻糖、木糖醇、雪莲果糖浆及其衍生物和混合物。
[0241]
基于蛋白质的甜味剂的非限制性实例包括brazzein(uniprot序列p56552)、仙茅素(分别地uniprot序列p19667氨基酸23至136、q6f495氨基酸23至135)、马槟榔甜蛋白(uniprot序列p80351氨基酸1至32、p80351氨基酸33至104、p30233氨基酸36至68、p30233氨
基酸83至154、p80352氨基酸1至32、p80352氨基酸33至104、p80353氨基酸1至28、p80353氨基酸29至100)、神秘果蛋白(uniprot序列p13087氨基酸30至220)、monelin(uniprot序列p02881、p02882)、培它丁和奇异果甜蛋白(分别地uniprot序列p02883氨基酸23至229、p02884氨基酸23至229)，以及其同源物和片段及混合物。
[0242]
属性
[0243]
根据上文任一项的组合物可具有相应组合物的属性的在50％和150％、140％、130％、120％、110％、100％、90％、80％、70％或60％之间；在60％和150％、140％、130％、120％、110％、100％、90％、80％或70％之间；在70％和150％、140％、130％、120％、110％、100％、90％或80％之间；在80％和150％、140％、130％、120％、110％、100％或90％之间；在90％和150％、140％、130％、120％、110％或100％之间；在100％和150％、140％、130％、120％或110％之间；在110％和150％、140％、130％或120％之间；在120％和150％、140％或130％之间；在130％和150％或140％之间；或140％至150％之间，或相应组合物的属性的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍的这种属性(例如，本文公开的任一种属性，或本文公开的两种或更多种属性的组合)。包含在组合物中的根据上文任一项的重组乳蛋白可以赋予或实质上促成组合物的这种属性。
[0244]
属性可以是一种或多种物理属性、一种或多种机械属性、一种或多种化学/生物属性、一种或多种感官属性、或一种或多种功能属性、或它们的任何组合。
[0245]
物理属性的非限制性示例包括外观(例如褐变、颜色、半透明、不透明)、形状(例如长度、宽度、均匀性)、形状保持、结构(例如分子结构[例如蛋白质折叠/构象]、空气细胞平均大小、空气细胞大小分布、空气细胞壁厚度)，结晶度(例如，提供特定的半透明度、不透明度或透明度；例如，较高的结晶度通常允许较少的光通过组合物，从而影响组合物的半透明度或不透明度，以及机械强度、刚度、耐化学性和稳定性)、分层、通气、固体颗粒的含量/大小/形状、硬度/坚度、内聚力、塑性、粘度、密度、溶解度(例如，在各种溶剂中的溶解度、凝胶点/曲线(即凝胶形成的温度和时间线)以及熔点/曲线。
[0246]
机械属性的非限制性示例包括硬度/坚度、粘合性、恢复力/可恢复能量、结构完整性/内聚性、弹力/弹性/回弹和耐咀性/破裂。
[0247]
功能属性的非限制性实例包括起泡/膨松行为(例如，起泡能力(即，形成泡沫的能力，其中本文使用的术语“泡沫”是指分散在固体或水连续相中的气泡)；如例如通过溢出和/或空气相体积测量的)，泡沫强度(例如作为剪切下的屈服应力或样品中开始流动所需的应力量测量)，泡沫稳定性(即响应物理和/或化学条件的泡沫的半衰期)，泡沫排出(即，泡沫不稳定且水相开始从泡沫中排出的速率)，泡沫渗漏)，胶凝/增稠/凝结行为(例如，具有确定的粘弹性的胶凝/增稠能力(即，形成凝胶的能力，其中如本文所用的术语“凝胶”是指具有充满溶剂的空间的蛋白质网络，该溶剂通过氢键连接到蛋白质分子)，例如通过在流变仪的频率扫描中获得的存储和弹性模数和相位角或通过对物理和/或化学条件(例如，搅拌、温度、ph、离子强度、蛋白质浓度、糖浓度、离子强度)的抵抗力、胶凝曲线(例如,胶凝能力随时间的曲线，粘弹性参数随温度的变化)、凝胶强度(即,破坏指定区域的凝胶表面所需的机械力,如例如通过在流变仪的频率扫描中获得的储能模量测量的)、凝胶时的持水能力、凝胶时的脱水收缩(即，随时间的水渗出))、乳化行为(例如，乳化能力(即稳定乳液的能
soil]；通过aoac国际参考方法aoac990.03和aoac992.15、电泳(例如sds-page)、液相柱色谱法、免疫化学测试或芯片上电泳(例如，使用agilent protein 80试剂盒和agilent 2100生物分析仪)分析营养物含量用于确定蛋白质和氨基酸的类型和/或含量；从成分的营养物含量计算营养物含量；通过测量在限定条件(例如温度、ph、离子强度、蛋白质浓度、碳水化合物浓度)下以特定速度和特定时间量搅打后形成的泡沫中空气的百分比、测量给定质量的泡沫以液体排出或渗出的形式不稳定化所需的时间、测量剪切下的屈服应力或样品中开始流动所需的应力量来分析发泡/发酵行为[参见，例如，pct公开wo2020219595，公开于2020年10月29日]；通过测量在限定条件[例如温度、ph、离子强度、蛋白质浓度、碳水化合物浓度]下形成凝胶所需的时间、测量在流变仪的频率扫描中获得的存储和弹性模数和相位角和测量凝胶对物理力和/或化学条件[例如，搅拌、温度、ph、离子强度、蛋白质浓度、糖浓度、离子强度]的抵抗力来分析胶凝/增稠/凝结行为[参见，例如，pct公开wo2020219595，2020年10月29日公开]；通过在限定条件(例如混合装置、混合速度、混合时间)下制备水包脂质乳液，随后测量脂质和水混合物中相分离随时间变化的稳定性、测量乳化或沉降速率、测量不透明度随时间的变化或测量分散相粒度随时间的变化分析乳化行为；通过测量离心后渗出的水量来分析水结合行为，或开发基于每蛋白质结合质量的水质量作为蒸汽压函数的水分吸附等温线)。
[0251]
食品
[0252]
根据上文任一项的组合物可以是食品，其中该食品包含乳蛋白组分，该乳蛋白组分包含根据上文任一项的重组乳蛋白或由其组成，并且其中该食品与相应的食品相比具有减弱的或基本上消除的变应原性。
[0253]
包含β-乳球蛋白和/或α-乳清蛋白的食品是期望的，特别是对于运动员而言，因为这些乳蛋白具有高含量的必需氨基酸和支链氨基酸，这被认为有助于肌肉组织的产生。此外，β-乳球蛋白作为食品添加剂是期望的，因为它具有良好的水结合能力，该特性使得β-乳球蛋白适用于管理食品的水分活度。此外，β-乳球蛋白作为食品添加剂是期望的，因为它具有抗微生物活性，该特性使得β-乳球蛋白适用于延长食品的保质期。此外，β-乳球蛋白作为食品添加剂是期望的，因为它可以很容易地在界面处吸收，该特性使得β-乳球蛋白适用于在食品中生产高度稳定的分散体。此外，α-乳清蛋白富含氨基酸半胱氨酸，它是谷胱甘肽(其是体内在免疫中起重要作用的强大的抗氧化剂)、神经递质血清素和神经分泌激素褪黑激素(其在调节神经行为影响(例如食欲、睡眠-觉醒节律、疼痛感知、情绪、焦虑和压力控制)中发挥作用)的构造块。此外，包含非变应原性乳蛋白的食品是期望的，因为它们可以被越来越多的对乳制品过敏的人食用。
[0254]
食品可以是选自国家健康和营养检查调查(nhanes)定义的任何食品类别的食品或者可以类似于选自国家健康和营养检查调查(nhanes)定义的任何食品类别的食品(即，可以是“替代食品”)，。
[0255]
nhanes食品类别的非限制性实例包括零食和口香糖(例如，零食棒、饼干、来自谷物产品的咸味零食、口香糖)；面包、谷物和意大利面(例如，燕麦面包和面包卷、玉米面包、玉米松饼、墨西哥面饼、面粉和干混合物、饼干、杂粮面包和面包卷、全麦面包和面包卷、意大利面、黑麦面包和面包卷、碎小麦面包和面包卷、白面包和面包卷)；饮料(例如啤酒和麦芽酒、浓缩饮料、饮料、能量饮料、运动饮料、液体替代品、软饮料、碳酸饮料、果汁、葡萄酒、
啤酒、鸡尾酒、营养饮料、营养粉、富含蛋白质的饮料、咖啡、茶)；糖果和甜点(例如蛋糕、糖果、薯片、饼干、果馅饼、糕点、冰或冰棒、松饼、馅饼、糖替代品或取代品、糖浆、蜂蜜、果冻、果酱、蜜饯、沙拉、薄饼、丹麦酥、早餐糕点、甜甜圈)；早餐食品(例如谷物、麦片、大米、法式吐司、煎饼、华夫饼、咖啡蛋糕)；沙拉酱、油、酱汁、调味品(例如，烹调用脂肪、植物油、沙拉酱、番茄酱、肉汁)；土豆(例如土豆沙拉、土豆汤、薯片和薯条、炸土豆、土豆泥、填馅土豆、泡芙)；和汤(例如蔬菜汤、蔬菜肉汤)、膳食、主菜、蛋白质(例如肉类替代品)和海鲜。
[0256]
根据上文任一项的食品可以是乳制品、补充乳制品(即，补充有根据上文任一项的重组乳蛋白的常规乳制品)或替代乳制品(即类似于常规乳制品的食品)。如本文所用，术语“乳制品”是指乳(例如，全脂奶[至少3.25％乳脂]、部分脱脂奶[1％至2％乳脂]、脱脂奶[少于0.2％乳脂],煮乳、炼乳、调味奶、山羊奶、绵羊奶、奶粉、淡奶、奶泡)，以及从乳中提取的产品，包括但不限于酸奶(例如,全脂酸奶[每170克至少6克脂肪]、低脂酸奶[每170克2至5克脂肪]、脱脂酸奶[每170克0.5克或更少脂肪]、希腊酸奶[去除乳清的过滤酸奶]、生酸奶、山羊奶酸奶、脱乳清酸奶(labneh)[labne]、羊奶酸奶、酸奶饮料[例如，全脂牛奶kefir、低脂牛奶kefir]、lassi)、奶酪(例如乳清奶酪，例如乳清干酪；帕斯特干酪，例如马苏里拉奶酪；半-软奶酪，例如哈瓦蒂干酪和门斯特干酪；中等硬度奶酪，例如瑞士乳酪和亚尔斯贝格奶酪和哈罗米奶酪；硬奶酪，例如切达干酪和帕尔马干酪；水洗凝乳奶酪，例如科尔比氏干酪和蒙特里杰克乳酪；柔软的成熟奶酪，例如布里干酪和卡门培尔干酪；新鲜奶酪，例如白软干酪、菲达奶酪、奶油奶酪、印度奶酪和凝乳)、加工奶酪、加工奶酪食品、加工奶酪产品、加工奶酪涂抹酱、酶调制奶酪；冷包装奶酪)、乳基酱汁(例如沙拉酱、白色调味酱、新鲜酱汁、冷冻酱汁、冷藏酱汁、货架稳定酱汁)、乳制品涂抹酱(例如低脂涂抹酱、低脂黄油)、奶油(例如，干奶油、浓奶油、淡奶油、鲜奶油、稀奶油、咖啡增白剂、咖啡奶精、酸奶油、鲜奶油)、冷冻甜点(例如，冰淇淋、冰沙、奶昔、冷冻酸奶、圣代冰淇淋、意式冰淇淋、奶油冻)、乳制甜点(例如新鲜、冷藏或冷冻)、黄油(例如搅打黄油、培养黄油)、乳粉(例如全脂奶粉、脱脂奶粉、加脂奶粉(即，包含植物脂肪代替全部或部分动物脂肪的奶粉)、婴儿配方奶粉、乳蛋白浓缩物(即，蛋白质含量至少为按重量80％；例如，乳蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、去矿物质乳清蛋白浓缩物、β-乳球蛋白浓缩物、α-乳清蛋白浓缩物、糖巨肽浓缩物、酪蛋白浓缩物)、乳蛋白分离物(即蛋白质含量至少为按重量90％；例如，乳蛋白分离物、乳清蛋白分离物、去矿物质乳清蛋白分离物、β-乳球蛋白分离物、α-乳清蛋白分离物、糖巨肽分离物、酪蛋白分离物)、营养补充剂、质地混合物、调味混合物、着色混合物、即饮或即食产品(例如新鲜、冷藏或货架稳定的乳蛋白饮料、减肥饮料、营养饮料、运动恢复饮料和能量饮料)、布丁、凝胶、咀嚼片、薯片、棒(例如营养棒、蛋白质棒)和发酵乳制品(例如酸奶、奶酪、酸奶油、发酵酪乳、发酵黄油、发酵乳脂肪)。
[0257]
根据上文任一项的食品可以是动物肉或动物肉制品、补充的动物肉或动物肉制品(即补充有由根据上文任一项的重组宿主细胞和/或根据上文任一项的方法产生的上文任一项的重组乳蛋白的常规动物肉或动物肉制品)，或替代动物肉或动物肉制品(即，类似于常规动物肉或动物肉制品的食品)。动物肉和动物肉制品的非限制性例子包括从获自动物的骨骼肌或其他器官(例如，肾、心、肝、胆囊、肠、胃、骨髓、脑、胸腺、肺、舌)或部分获得的肉。动物肉可以是黑肉或白肉。可从中获得动物肉或动物肉制品的动物的非限制性实例包括牛、羔羊、羊、马、家禽(例如鸡、鸭、鹅、火鸡)、飞禽(例如野鸽、鸽子、松鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸸
鹋、雉鸡、鹌鹑)、淡水或咸水鱼(例如，鲶鱼、金枪鱼、旗鱼、鲨鱼、大比目鱼、鲟鱼、三文鱼、鲈鱼、北美狗鱼、梭子鱼、弓鳍鱼、颌针鱼、鳗鱼、白鲟、鲷、鲤鱼、鳟鱼、大眼鱼、黑鱼、莓鲈、姐妹鱼、贻贝、扇贝、鲍鱼、鱿鱼、章鱼、海胆、鱿鱼、被囊动物)、甲壳类动物(如螃蟹、龙虾、虾、藤壶)、野生动物(如鹿、狐狸、野猪、麋鹿、驼鹿、驯鹿、北美驯鹿、羚羊、斑马、松鼠、土拨鼠、兔子、熊、海狸、麝鼠、负鼠、浣熊、犰狳、豪猪、野牛、水牛、野猪、猞猁、山猫、蝙蝠)、爬行动物(例如，蛇、乌龟、蜥蜴、短吻鳄、鳄鱼)、任何昆虫或其他节肢动物、啮齿动物(海狸鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、田鼠、土拨鼠、水豚)、袋鼠、鲸鱼和海豹。动物肉或动物肉制品可以被磨碎、切碎、切丝或以其他方式加工以及未经烹调、正在烹调或已经烹调。
[0258]
根据上文任一项的食品可以是蛋或蛋制品、补充蛋制品(即，补充有根据上文任一项的重组乳蛋白的常规蛋或蛋制品)，或替代蛋或蛋制品(即类似于常规蛋或蛋制品的食品)。蛋或蛋制品的非限制性实例包括全蛋(例如，液体全蛋、喷雾干燥全蛋、冷冻全蛋)、蛋清(例如，液体蛋清、喷雾干燥蛋清、冷冻蛋清)、蛋黄、蛋盘、蛋汤、用蛋清制成的混合物、用蛋替代品制成的混合物、蛋黄酱、蛋奶沙司和沙拉酱。
[0259]
本文提供的替代食品与常规食品的相似性可归因于任何物理属性(例如，本文公开的任何物理属性)、机械属性(例如，本文公开的任何机械属性)、化学/生物属性(例如，本文公开的任何化学/生物属性)、感官属性(例如，本文公开的任何感官属性)和功能属性(例如，本文公开的任何功能属性)，以及它们的任何组合。
[0260]
聚合物
[0261]
根据上文任一项的组合物可包含聚合物或聚合物网络(即，彼此连接的聚合物网络)，其包含连接的重复蛋白质单体，其中重复蛋白质单体包含根据上述任何一项的重组乳蛋白或由其组成。
[0262]
包含在聚合物或聚合物网络中的重复蛋白质单体和/或包含在聚合物网络中的聚合物可以彼此直接连接或通过中间分子连接。包含在聚合物或聚合物网络中的重复蛋白质单体和/或包含在聚合物网络中的聚合物可以通过共价键(酰胺键[例如，内酰胺键、天然化学连接键、施陶丁格连接键]、二硫键)或非共价键(例如，静电相互作用、氢键)连接。
[0263]
组合物可包含按质量计0.001％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,1％,0.1％或0.01％；0.01％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,1％或0.1％；0.1％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％或1％；1％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％或10％；10％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％或20％；20％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％或30％；30％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％或40％；40％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％或50％；50％至100％,99％,95％,90％,80％,70％或60％；60％至100％,99％,95％,90％,80％或70％；70％至100％,99％,95％,90％或80％；80％至100％,99％,95％或90％；90％至100％,99％或95％；95％至100％或99％；或99％至100％的聚合物或聚合物网络。
[0264]
包含在组合物中的聚合物或聚合物网络可以包含按质量计0.001％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,1％,0.1％,或0.01％；0.01％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,1％,或
0.1％；0.1％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,或1％；1％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,或10％；10％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,30％,或20％；20％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,40％,或30％；30％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,50％,或40％；40％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,60％,或50％；50％至100％,99％,95％,90％,80％,70％,或60％；60％至100％,99％,95％,90％,80％,或70％；70％至100％,99％,95％,90％,或80％；80％至100％,99％,95％,或90％；90％至100％,99％,或95％；95％至100％或99％；或99％至100％的重组乳蛋白。
[0265]
组合物可以是补充聚合物，其通过将一种或多种石油衍生的单体与蛋白质单体混合而产生，所述蛋白质单体包含根据上文任一项的重组乳蛋白或由其组成。包含重组乳蛋白或由其组成的单体与石油衍生单体的质量比可以在约1比100和约100比1之间(例如，约100比1、约90比1、约80比1、约70比1、约60比1、约50比1、约40比1、约30比1、约20比1、约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9、约1比10、约1比20、约1比30、约1比40、约1比50、约1比60、约1比70、约1比80、约1比90或约1比100)。
[0266]
合适聚合物的非限制性实例包括粘合剂(即，形成粘合结合的材料；例如，胶水、壁纸粘合剂、木材粘合剂、纸粘合剂、软木粘合剂、刨花板粘合剂、外科/医用胶、水泥、粘液、糊剂)、涂层或饰面(例如光泽涂层、保护涂层、清漆、药片涂层、纸张涂层、油漆、皮革涂饰、纺织品涂层)、油漆或油墨或油墨用颜料粘合剂、硬塑料(例如瓶子、纽扣、窗、笔)、中硬塑料(例如瓶子、纤维[例如,纱线]、纺织品、地毯、窗帘、衣服)、软塑料(例如袋子、包装纸、可食用薄膜、防水薄膜、隐形眼镜、包装材料)、织物(例如纺织品、地毯、窗帘)、工业聚合物(即用于制造合成工业材料的化合物)、药物制剂(例如用于递送药剂的产品(例如封装用于递送(例如，受控递送)的治疗剂或营养制剂、片剂、胶囊、紧致剂、水凝胶的包衣的微米或纳米粒子(例如珠子、胶束))、医学诊断剂(分别参见例如j.berger等人2004.europ j of pharm and biopharm 57:19)、凝胶(例如，用于控制释放治疗剂的水凝胶、用于固定蛋白质(例如酶)的水凝胶)、植入物(例如，骨替代复合材料、支撑神经修复的材料、用于生长细胞的支架、假体植入物)、衣物(例如鞋子)、润滑剂、家具、化妆品或个人护理产品(例如软膏、乳液、乳霜(例如保湿霜)、清洁剂、按摩面霜、肥皂、洗发水、护发素、面膜、精加工产品、生发水)、纸(例如，纸张、纸标签、包装纸、摄影支持体)、家居用品(例如，锅、碗、盘子、杯子)和生物支架(即模拟生物基质的结构、缝合线、骨替代材料、支持神经修复的材料、用于生长细胞的支架、假体植入物、用于促进伤口愈合的膜、组织工程化支架)。
[0267]
根据上文任一项的聚合物可以类似于常规的石油衍生聚合物。这种相似性可能是由于相似的颜色、形状(例如，长度、宽度、均匀性)、形状保持性、粘合强度、对水分的反应、变应原性、电荷、疏水性、亲水性、质地、厚度、光滑度、硬度、拉伸强度、消化率、溶剂化、化学反应性、渗透性、熔化温度、脆性、韧性、蠕变流动或冷流、孔隙率、膨胀、阻隔性、抗冲击性、透气性、电导率、热导率、弹性模量、柔韧性、缔合/结合的化合物的释放、气体含量、断裂强度、玻璃化转变温度、成型温度、结晶度(例如，半透明度、不透明度、透明度)以及粘度和/或密度。
[0268]
产生组合物的方法
[0269]
在另一方面，本文提供了一种用于生产根据上文任一项的组合物(例如，根据上文任一项的食品、包含根据上文任一项的聚合物或聚合物网络的组合物)的方法，其中该方法包括获得根据上文任一项的重组乳蛋白的步骤。
[0270]
当组合物是食品(例如，根据上文任一项的食品)时，本领域已知的多种配方可用于制备食品。根据上文任一项的重组乳可以以纯化/分离形式用于此类配方中，或包含在根据上文任一项的方法获得的发酵液或制剂中。
[0271]
当组合物包含根据上文任一项的聚合物或聚合物网络时，用于聚合蛋白质单体的多种方法是本领域已知的，并且可用于聚合根据上文任一项的重组乳蛋白。此类方法的非限制性实例包括使用交联剂(即，激活蛋白质上的官能团并因此连接蛋白质而不掺入间隔物的化学物质)、交联酶(例如，转移酶[酶委托编号(ec)2；例如，转谷氨酰胺酶]、水解酶[ec3]、氧化(例如，使用氧化剂)、还原(例如，使用还原剂)、辐射(例如，使用uv、γ、电子束)、加热、机械搅拌、压力(例如，挤压)、湍流、摩擦、ph变化、光氧化处理(例如，使用光反应性氨基酸类似物)、3d打印及其组合(参见，例如，pct公开wo2019213155)。
[0272]
该方法可以进一步包括在该方法的任何步骤添加一种或多种其他乳蛋白(例如，本文公开的任何其他乳蛋白)和/或一种或多种其他成分(例如，本文公开的任何其他成分)的步骤。
[0273]
该方法可以进一步包括使用蛋白酶(例如，可以在天然蛋白酶识别或切割序列或非天然蛋白酶识别或切割序列[例如，本文公开的任何非天然蛋白酶识别或切割序列]处切割重组乳的任何本文公开的蛋白酶)预消化(即，使用前消化)重组乳的步骤。这种预消化的功效可以通过重组乳的预先热处理和/或通过将重组乳暴露于酸性ph以使重组乳变性和从而使天然或非天然蛋白酶识别或切割序列更容易被蛋白酶访问来增加。预消化后可以用转谷氨酰胺酶处理，以使重组乳片段聚合。(例如，参见damodaran&li 2017food chemistry 237:724
–
732)
实施例
[0274]
包括以下实施例以说明本发明的具体实施方案。实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术；然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应该理解，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得类似或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。因此，实施例中阐述或显示的所有事项都应被解释为说明性的而不是限制性的。
[0275]
实施例1：具有减弱或基本上消除的变应原性的重组β-乳球蛋白的生产
[0276]
对于里氏木霉中的重组蛋白表达，图1中所示的重组载体是使用本领域已知的基因工程方法构建的。重组载体包含表达构建体，该表达构建体包含编码牛(uniprot序列p02754的氨基酸17至178；seq id no：1或2)、欧洲盘羊(uniprot序列p67975；seq id no：4)、绵羊(uniprot序列p67976；seq id no：5)、马(uniprot序列p02758的氨基酸19-180；seq id no：6)、驴(uniprot序列p13613；seq id no：7)、马(uniprot序列p07380的氨基酸19至181；seq id no：8)、驴(uniprot序列p19647；seq id no：9)，或山羊(uniprot序列p02756；seq id no：10)的β-乳球蛋白的蛋白质编码序列；针对在里氏木霉中的表达进行了密码子优化；可操作地连接到n端分泌信号(例如cbh1、xyn1)；并且在合适的启动子(例如，cbh1、
xyn1、tef1)和合适的终止子(例如，pdc1)的控制下。重组载体进一步包含可指导表达构建体在里氏木霉宿主细胞基因组中egl1基因座处整合的多核苷酸、用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记、以及细菌复制起点。在将重组载体转化到宿主细胞之前，通过限制性酶消化从重组载体中去除细菌选择标记和复制起点。
[0277]
对于毕赤酵母(法夫驹形酵母)中的重组蛋白表达，使用本领域已知的基因工程方法构建图2所示的重组载体。重组载体包含表达构建体，该表达构建体包含编码牛(uniprot#p02754的氨基酸17至178；seq id no：1或2)、欧洲盘羊(uniprot序列p67975；seq id no：4)、绵羊(uniprot序列p67976；seq id no：5)、马(uniprot序列p02758的氨基酸19-180；seq id no：6)、驴(uniprot序列p13613；seq id no：7)、马(uniprot序列p07380的氨基酸19至181；seq id no：8)、驴(uniprot序列p19647；seq id no：9)，或山羊(uniprot序列p02756；seq id no：10)的β-乳球蛋白的蛋白质编码序列；针对在毕赤酵母(法夫驹形酵母)中的表达进行了密码子优化；可操作地连接到n-末端分泌信号(例如，酿酒酵母的α交配因子的前或初前信号肽)，并在启动子(例如，pgap、paox1)和终止子(例如，taox1 pa信号)的控制下。重组载体进一步包含用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记，以及细菌复制起点。
[0278]
使用定点诱变试剂盒(agilent,santa clara,california,usa)和quikchange multi定点诱变试剂盒(agilent,santa clara,california,usa)，根据制造商的指导对上述重组载体进行定点诱变以将表1中列出的氨基酸取代，以及两个或更多个此类氨基酸取代的任意组合引入编码的β-乳球蛋白。
[0279]
表1-重组载体的蛋白质编码序列编码的氨基酸取代引入的β-乳球蛋白。
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287][0288][0289]
将重组载体转化到里氏木霉或毕赤酵母(法夫驹形酵母；例如菌株bg12[(biogrammatics,carlsbad,ca])宿主细胞中，并通过在用于阳性选择的基本培养基或抗生素上生长来选择转化子。转化子在24孔板中的表达培养基中生长，收集上清液用于进一
步分析。通过发酵液样品的sds-page凝胶分析鉴定包含表达构建体的整合拷贝并分泌重组β-乳球蛋白的重组宿主细胞。
[0290]
重组里氏木霉宿主细胞在包含无机盐作为磷酸盐、铵、镁、钾、钠、硫酸盐、氯化物、钙、铁、锰、锌、钼、铜、钴和硼酸盐的来源的基本培养基中、以碳水化合物为基础的碳源作为起始原料、在控制在25℃和34℃之间的温度、在0.2vvm和1vvm之间的通气量和进行最小搅拌以确保适当混合和生物质和营养物质的分散的搅拌发酵容器中(包括氧气，以压缩空气的形式输送)生长。发酵液的ph值控制在从3.0到5.5的各种设定点，并根据需要添加氢氧化铵。一旦批次碳水化合物耗尽，则以每小时每克干细胞质量(dcm)0.01至0.1g干底物的特定进料速率添加含有葡萄糖或乳糖的溶液。通过控制搅拌速率以维持5％和50％之间的目标溶解氧设定点来满足培养物的需氧量。当搅拌不再能够维持目标溶解氧设定点时，通气量增加至2.0vvm。一旦培养以最大的搅拌和通气运行，溶解氧就可以允许下降到设定点以下。各种消泡剂，包括但不限于acp 1500,antifoam 204(sigma,sigma-aldrich chemical,st.louis,mo),erol df6000k,hodag k-60k,industrol df204(basf,florham park,nj),p-2000e(dow,midland,mi),sag 471,sag 5693,sag 710,sag 730,silicone antifoam(sigma),struktol j647,struktol j673a和葵花油根据需要添加以控制泡沫。至少120小时后收获发酵物，生物质浓度为每升20克至50克干细胞重量(dcw)。通过以5,000xg离心从肉汤中去除生物质，并如下所述对上清液进行纯化.
[0291]
重组毕赤酵母(法夫驹形酵母)宿主细胞在包含磷酸盐和氮盐的最低限度基础培养基中、以80％的甘油作为起始原料、在控制在30℃的温度、1vvm的通气量和100rpm的最小搅拌速度的搅拌发酵容器中生长。通过按需添加氢氧化铵将发酵的ph值控制在5。一旦批次甘油耗尽，通过程序进料配方以6g/l/h的速率添加甘油。通过控制搅拌速度来满足菌株的需氧量。当搅拌不再能够维持溶解氧设定点时，将100％的氧气喷射到容器中以控制溶解氧。一旦批次甘油耗尽，发酵的ph值就会从5变为3。根据需要添加消泡剂c以控制泡沫。至少100小时后在od600为600-800的细胞密度下收获发酵物。通过在5,000xg下离心从肉汤中去除生物质，并如下所述对上清液进行纯化。
[0292]
上清液在100kda截留分子量(mwco)膜上浓缩。浓缩截留物在5kda mwco膜上渗滤到50mm咪唑，ph6.8中。将浓缩的截留物通过q sepharose ff柱。流动相为50mm咪唑，ph6.8，并将重组β-乳球蛋白在2m nacl梯度上洗脱。梯度从0-30％运行超过30个柱体积。收集峰级分并在rp-hplc上进行分析。合并含有纯度大于85％的重组β-乳球蛋白的峰用于最终渗滤到水中。
[0293]
实施例2：重组β-乳球蛋白的蛋白酶消化的分析
[0294]
实施例1的纯化的重组β-乳球蛋白在37℃下用来自猪胃粘膜的胃蛋白酶、来自人胰腺的胰蛋白酶或来自人类胰腺的糜蛋白酶(均获自sigma(sigma-aldrich chemicals,st.louis,mo))进行蛋白酶消化0.5小时、1小时、4小时、6小时或过夜。胃蛋白酶消化在ph 1.5或3下进行，胰蛋白酶和糜蛋白酶消化在ph 6、7或8下进行。蛋白酶消化程序根据pena-ramos&xiong 2001j.dairy sci.84:2577
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2583；quintieri等人2017j food sci technol 54:1910
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1916；selo等人1999clinical and experimental allergy 29:1055
–
1063；morisawa等人,2009clinical&experimental allergy 39:918
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925；或kondo等人2007allergy asthma clin immunol,3(1):1-9中描述的实验细节进行。
technol 54:1910
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1916,cocco等人2007clinical and experimental allergy 37:831
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838；or wr
ó
blewska等人2016food research international 83:95
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101)。
[0303]
变应原性也可以使用皮肤点刺测试、血液测试、口服食物挑战和人群研究来测量。
[0304]
将结果与相应的天然β-乳球蛋白或其蛋白酶水解肽的结果进行比较。
再多了解一些
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