一种双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法

1.本发明涉及杂质元素检测方法技术领域，尤其涉及一种双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法。


背景技术：

2.甘蓝品种大多是杂交种，甘蓝传统的单倍体诱导技术是体外小孢子或花药培养，该方法步骤繁琐，并且严重受到材料基因型限制。获得纯系亲本，是其育种的关键步骤。
3.目前杂交育种是广泛使用的甘蓝类蔬菜育种方法,其亲本需要数代筛选才能纯化,耗时较长。转基因技术通过基因工程手段将外源性有益目标基因片段嵌入到本物种可以表达的基因序列中，从而得到具有一定优良效果的种子,由于引入了外源性因素,存在较大的潜在物种风险,并且基因工程手段技术要求很高,一般难以实施。诱变育种使用各种理化以及生物方法促使本物种基因发生突变,但诱变育种发生诱变后子代性状表现各异,难以掌控。双单倍体育种是通过使用化学试剂使植物染色体组型加倍,选育性状优秀的子代的育种方法,因此联合使用多种育种方法共同选育性状的子代种子是本发明专利的着眼之处和创新特征。相比传统自交和回交的方法，利用双单倍体(dh)育种技术只需要两代即可获得完全纯合的材料，可大大缩短育种年限。但是单纯的双单倍体(dh)育种制得的雄性不育系的制种时间长,方法繁琐,会出现低温微粉从而导致杂交种出现不育株，引起产量损失,而且制种繁琐,制种产量难以得到保证，需要一种双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的一种用于双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.本发明包括以下步骤：
7.a，选择二倍体甘蓝类蔬菜的成年植株作为原始亲本，并以两者互为杂交授粉对应植株；在上述亲本刚进入绿蕾期时，诱导其形成二倍体大花粉；
8.b将子叶期胚状体经ms固体分化培养基、12ms生根培养基培养后，移入营养土中培养；
9.c将得到的单倍体植株，用秋水仙碱加倍染色体，小孢子培养获得双单倍体分离群体,对得到的种子进行4代单株套袋自交，得到有稳定性状的双单倍体种子；
10.d将二倍体大花粉与对应植株的单倍体卵细胞杂交，得到杂交种子；
11.f将杂交种子暗培养后得到甘蓝类蔬菜幼芽；对甘蓝类蔬菜幼芽进行化学诱变处理后模拟日光培养，筛选出有目标性状的甘蓝类蔬菜植株。
12.进一步地，所述化学诱变培养皿的成分及其最佳浓度为2％二甲基亚砜(dmso)，丙烯酰胺100mg/l,氯胺苯醇95mg/l,硝基苯95mg/l,苯胺100mg/l,苯基偶氮-2-萘酚二溴甘露
醇185mg mg/l和40mg/l马来酰朋(mh)。
13.进一步地，在步骤c中用强度300mt的均匀磁场预处理小孢子30min。
14.进一步地，，在甘蓝类蔬菜小孢子培养初期添加50mg/l秋水仙碱。
15.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
16.本发明采用二倍体育种与化学诱变育种联合育种,提高了育种的质量和育种的效率,快速得到的甘蓝类蔬菜纯合体,在通过化学诱变得到有特殊性状的甘蓝类蔬菜种子,且这种有特殊性状的甘蓝类蔬菜种子也是纯合体,有利于甘蓝类蔬菜种子优良性状的保持与传递。
附图说明
17.图1为本发明双单倍体及化学诱导联合作用的甘蓝类蔬菜育种方法的流程图；
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中附图1和技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
19.下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
20.本研究拟选用15份性状优良的甘蓝新品种以及课题组以往试验过程中筛选出的出胚率较高的3个品种
21.试验选用材料供试甘蓝材料为西北农林科技大学园艺学院甘蓝育种研究室提供，为国内外引进的23份甘蓝杂种一代优良品种(表2-1)；其中国内8份编号为(q10-1～q10-5，10-21～10-23)，国外15份(编号gf1-1～gf1-15)。
22.实验试剂nln、ms、和b5培养基，tdz、秋水仙碱、6-ba、ga3、naa、烯效唑、盐酸、naoh、蔗糖、无水乙醇、升汞、琼脂等。
23.试验方法2.2.1供试材料栽培甘蓝成株供体植株于2010年7月10日播种，8月8日定植于露地，11月25日移植于窖内越冬；半成株供体植株于2010年8月20日播种，9月15日定植于田间，冬季露地小拱棚塑料覆盖越冬。2011年4月8日起各供体植株开始抽薹开花，取初花期主花枝上的适宜花蕾用于小孢子诱导培养。
24.a，选择二倍体甘蓝类蔬菜的成年植株作为原始亲本，并以两者互为杂交授粉对应植株；在上述亲本刚进入绿蕾期时，诱导其形成二倍体大花粉；
25.b将子叶期胚状体经ms固体分化培养基、12ms生根培养基培养后，移入营养土中培养；
26.c将得到的单倍体植株，用秋水仙碱加倍染色体，小孢子培养获得双单倍体分离群体,对得到的种子进行4代单株套袋自交，得到有稳定性状的双单倍体种子；
27.d将二倍体大花粉与对应植株的单倍体卵细胞杂交，得到杂交种子；
28.f将杂交种子暗培养后得到甘蓝类蔬菜幼芽；对甘蓝类蔬菜幼芽进行化学诱变处理后模拟日光培养，筛选出有目标性状的甘蓝类蔬菜植株。
29.在步骤c中用强度300mt的均匀磁场预处理小孢子30min孢子培养是指通过一定方
法直接从未开放的花蕾中游离出小孢子群体，在经过特定的培养和处理，使小孢子充分利用细胞的全能性，从配子体型发育途径转变为孢子体型发育途径，进而诱导出胚状体，继而形成单倍体或者双单倍体植株的过程。利用该技术可在1～2年内获得纯和的自交系或者是自交不亲和系，能明显加速育种进程。正常情况下，植物多表现为单倍体配子体和二倍体孢子体交替的生活史。在被子植物的配子体发育过程中，花粉母细胞会经减数分裂和有丝分裂两个过程，最终形成雄配子体，即花粉粒；在特定培养的条件下，细胞可能通过改变发育途径而进行孢子体发育，形成胚状体及再生植株。
30.在甘蓝类蔬菜小孢子培养初期添加50mg/l秋水仙碱，秋水仙碱能使小孢子染色体在游离培养过程中加倍，其原理为通过抑制有丝分裂中纺锤体的形成而对染色体起到加倍的效果。将甘蓝型甘蓝类蔬菜刚游离出的的小孢子在含10～50mg/l秋水仙碱的nln培养基中处理48h后，在置换到无秋水仙碱nln培养基进行胚状体诱导，结果表明用500mg/l秋水仙碱处理刚游离出的小孢子15h获得了83％～92％的双单倍体率，其他处理加倍效果均不及采用刚游离小孢子直接进行秋水仙碱处理，甘露醇和秋水仙素预处理的小孢子后，均能明显提高小孢子出胚率和再生率。
31.在本实施例子中，所述化学诱变培养皿的成分及其最佳浓度为2％二甲基亚砜(dmso)，丙烯酰胺100mg/l,氯胺苯醇95mg/l,硝基苯95mg/l,苯胺100mg/l,苯基偶氮-2-萘酚二溴甘露醇185mg mg/l和40mg/l马来酰朋(mh)。
32.表1所示化学诱变不同处理时间为甘蓝的效果对比图
[0033][0034]
从表中可以看出,化学诱变剂二甲基亚砜和丙烯酰胺对甘蓝类蔬菜均有较好的诱变效果,从植株株高、叶色、叶型、结球性等性状产生了广泛的变异。与物理诱变相比，化学诱变更多的是引起甘蓝类蔬菜的分子水平上的变化，对生物分子的影响通常是个别、局部的，不易引起染色体畸变或损伤。因此，产生点突变的比例高，突变谱的稳定性好，突变频率高化学诱变剂可同时作用于甘蓝类蔬菜多个位点，同时引发一个基因组中多个基因发生突变，诱变范围广、突变频率高，生物学方法要保证95％以上的甘蓝类蔬菜基因有一个插入片段，至少需要10万株植物，而化学诱变在一个基因组中能够造成几十个突变，5000～10 000
株用ems(甲基磺酸乙酯)处理的植物中，一般就包括了所有可能的基因突变。
[0035]
以皱叶甘蓝、红甘蓝、抱子甘蓝为例，皱叶甘蓝的变异株与其对照在ssr引物上具有条带上的多态性；红甘蓝植株变异株系分枝部位与对照的差异达到0.01显著水平,明显低于对照红甘蓝及抱子甘蓝群体分离出早花,双生苗变异株系.种子出苗率,成苗率,结实率和植株性状在皱叶甘蓝)与对照差异不明显,皱叶甘蓝中出现长果,多果,早花,矮杆,晚熟,大粒等有利变异株,多头茎,主茎短缩等畸形变异株,，且这种有特殊性状的甘蓝类蔬菜种子也是纯合体,有利于甘蓝类蔬菜种子优良性状的保持与传递。
[0036]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。