一种针对人表皮细胞生长因子受体2（HER2）的肿瘤亲和肽

一种针对人表皮细胞生长因子受体2(her2)的肿瘤亲和肽
技术领域
1.本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种针对人表皮细胞生长因子受体2的肿瘤亲和肽。


背景技术：

2.肿瘤已成为危害人类健康的头号杀手，其死亡率还在持续上升。在癌症转移到其他器官之前，早期发现恶性病变可以尽早进行明确的局部治疗，从而获得极高的生存率，因此，恶性肿瘤的早期诊断和治疗至关重要。对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为b超、ct和mri，这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。近年来，随着对肿瘤及其相关学科的认识和研究，研究的重点开始转移到针对肿瘤细胞内异常表达靶点的特异性肿瘤诊断药物，用于进行肿瘤的早期诊断。针对靶点的特异性肿瘤诊断药物主要特异性结合于肿瘤细胞上，对正常细胞无结合，因而可以达到高选择、低毒性的诊断效果。目前认为，靶向多肽是比较理想的肿瘤靶向治疗手段，具有以下优势：1)血浆清除速度快，亲和力高，特异性强；2)良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞所摄取；3)易于化学合成，且免疫原性低，可避免单克隆抗体治疗的不足。
3.表皮细胞生长因子受体(epithelial growth factor receptor,egfr)是一个巨大的跨膜糖蛋白,分子量约为180kda,具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性，它是erbb这个保守的受体家族的一个成员,这个家族的其他成员包括her2/neu/erbb2,her3/erbb3和her4/erbb4。erbb受体的共同特征是：包含一个胞外(ec)配体结合区,是由两个重复的富含半胱氨酸的区域组成的单一跨膜区，以及含有酪氨酸蛋白激酶和自身磷酸化位点的胞内序列。当与配体结合后,受体二聚化,这对于改变配体和受体间的高亲和力状态以及受体在分子间传递磷酸化信号都至关重要。
4.her2也称为c-erb2(表皮细胞生长因子受体2)，由922个腺嘌呤、1382个胞嘧啶、1346个鸟嘌呤和880个胸腺嘧啶组成。人类该基因定位于染色体17q21，属于原癌基因。其编码产物her2蛋白为185kd的跨膜精蛋白，简称p185，由1255个氨基酸组成，720-987位属于酪氨酸激酶区。her2蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于egfr家族成员之一。蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，由于尚未发现能与其直接结合的配体，her2蛋白主要通过与家族中其他成员包括egfr(herl/erbbi)、her3/erbb3、her4/erbb4形成异二聚体而与各自的配体结合。her2蛋白常为异二聚体首选伴侣，且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化，激活酪氨酸激酶的活性。her2蛋白介导的信号转导途径主要有ras/raf/分裂素活化蛋白激酶(mapk)途径，磷脂酰肌醇3羟基激酶(pi3k)/akt途径，信号转导及转录激活(stat)途径和plc通路等。her-2在正常人体各组织器官中的表达有限，但在阳性肿瘤中表达水平较高。因此her-2受体可以成为肿瘤特异性成像的靶点。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于提供一种针对人表皮细胞生长因子受体2的肿瘤亲和肽，使其能够对her2受体高表达的肿瘤进行在体诊断，可用于制备新型的靶向药物载体。
6.本发明的第二个目的是提供前文所述的肿瘤亲和肽的应用。
7.本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
8.第一方面，本发明保护一种针对人表皮细胞生长因子受体2(her2)的肿瘤亲和肽，选自以下任一条多肽：
9.yqgl-1：leu-arg-leu-ser-gly-gly-hyp-gln；hyp代表羟脯氨酸；
10.yqgl-2：d-leu-arg-d-leu-ser-gly-gly-pro-gln；其中d-leu代表d型leu；
11.yqgl-3：leu-d-arg-leu-ser-gly-gly-pro-gln；其中d-arg代表d型arg；
12.yqgl-4：leu-homo-arg-leu-ser-gly-gly-pro-glu；homo-arg代表高精氨酸；
13.yqgl-5：d-leu-d-arg-leu-ser-gly-gly-hyp-glu；hyp代表羟脯氨酸,d-leu代表d型leu；
14.yqgl-6：ac-lys-gly-gly-gly-leu-arg-leu-ser-gly-gly-hyp-glu；hyp代表羟脯氨酸。
15.第二方面，本发明还保护前文所述肿瘤亲和肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用，优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用，进一步优选在制备用于肿瘤边界的精准定位和术中影像导航的肿瘤诊断显像剂以及放射性核素显像中的应用。
16.本发明所述的多肽化合物可特异性靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的摄取和滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂以及放射性核素显像剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。
17.第三方面，本发明还保护一种修饰的多肽，具备以下通式：m-l-g，
18.其中，m表示光标记或金属螯合剂，所述的金属螯合剂能够与放射性核素络合；
19.l为连接基团；
20.g为本发明所述的任意一个针对人表皮细胞生长因子受体2(her2)的肿瘤亲和肽yqgl-x，(x＝1～6中的任意整数)。
21.作为本发明的一种优选，所述的光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。
22.当m为光标记时，此时的m-l-g为一种具有优良显像性能的荧光分子影像探针，其结构中含有用于靶向肿瘤的本发明多肽yqgl和用于光学成像的光标记以及起到增加靶向多肽与光标记之间的距离并调节体内药代动力学特性的连接剂l。
23.所述的光标记选自含有机发色团的化合物、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。
24.作为本发明的进一步优选，所述的有机荧光团为近红外荧光染料，优选自近红外荧光染料icg-der-02(又称mpa)、irdye800、cy7.5、cy5.5；进一步优选mpa。
25.作为本技术的进一步优选，所述的放射性核素选自99m tc、68ga，64cu，67ga，90y，111in或177lu、125i。
26.作为本发明的进一步优选，所述的l选自叠氮戊酸、丙炔酸、聚乙二醇、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,
4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、mag2、n3s、n2s2类配体、二乙基三胺五乙酸、1,4-丁二酸、5-氨基戊酸、聚乙烯亚胺、6-肼基吡啶-3-甲酸、溴甲酸苯甲基、n-(2-氨基乙酸)马来酰亚胺或它们的组合。
[0027]
作为本发明的进一步优选，所述l选自6-氨基己酸、peg 4、peg 6、hynic-peg4或hynic中的任意一种或多种。
[0028]
第四方面，本发明还保护前文所述的修饰的多肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。
[0029]
第五方面，本发明还保护前文所述的多肽在制备肿瘤靶向药物载体中的应用。
[0030]
本发明所述的多肽能高度模拟her-2(表皮细胞生长因子受体2)的肿瘤靶向，高效结合表皮细胞生长因子受体2(her2)至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的聚集和滞留，具有较高的靶和非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。
[0031]
本发明的肿瘤，如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、脑胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌等。
[0032]
有益效果
[0033]
本发明的有益效果为：
[0034]
1、本发明开发了一系列新的模拟her2(表皮细胞生长因子受体2)的高亲和力的多肽，可用于靶向表皮细胞生长因子受体2(her2)。利用her2受体在肿瘤中高表达，基于yqgl-x(x＝1～6)多肽与her2受体特异性结合的原理，可用于her2高表达肿瘤的早期诊断。
[0035]
2、这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉，并且此系列短肽引入了非天然氨基酸进行修饰，从而极大提高了多肽在活体内的稳定性。通过延长多肽的半衰期来提高其在体内的循环时间，促进影像探针在肿瘤部位的浓聚和滞留，进而获得更好的肿瘤显像效果，使其更利于临床推广应用。
[0036]
3、这些肽均为首次报道，制备方法简单，获取渠道方便。
[0037]
4、yqgl-x(x＝1～6)系列多肽可以和肿瘤细胞特异性结合，经活体光学成像和结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括肝癌、乳腺癌、宫颈癌及结直肠癌等。
[0038]
5、本发明利用近红外荧光染料mpa穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。
[0039]
6、yqgl-x(x＝1～6)多肽放射性药物可用于肿瘤的筛查和早期诊断，还可以实时无损在位监测早期恶性肿瘤以及治疗。
附图说明
[0040]
图1-3为靶向化合物yqgl-1的结构(图1)，hplc分析图(图2)以及ms(图3)。
[0041]
图4为流式细胞术检测不同荧光靶向化合物在skbr3细胞的亲和力。
[0042]
图5为荧光靶向化合物mpa-yqgl-1在乳腺癌4t1荷瘤鼠体内的光学成像图。
[0043]
图6为荧光靶向化合物mpa-yqgl-2在乳腺癌mda-mb-231荷瘤鼠体内的光学成像图。
[0044]
图7为荧光靶向化合物mpa-yqgl-3在乳腺癌mcf7荷瘤鼠体内的光学成像图。
[0045]
图8为荧光靶向化合物mpa-yqgl-4在结直肠腺癌ht29荷瘤鼠体内的光学成像图。
[0046]
图9为荧光靶向化合物mpa-yqgl-5在肝癌a549荷瘤鼠体内的光学成像图。
[0047]
图10为荧光靶向化合物mpa-yqgl-6在宫颈癌hela荷瘤鼠体内的光学成像图。
具体实施方式
[0048]
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
[0049]
实施例1：
[0050]
本实施例1提供多肽yqgl-1的制备方法，多肽通过固相合成方法合成，其具体合成方法如下：
[0051]
1)树脂溶胀
[0052]
称取n当量rink amide mbha树脂放入多肽合成管，加入二氯甲烷(dcm)溶胀30min。抽掉dcm溶液，用dmf洗涤，抽干。
[0053]
2)脱除fmoc
[0054]
合成管中加入20％哌啶的dmf溶液，脱保护时间为5min，重复两次。反应结束后用dmf洗涤。
[0055]
3)偶联
[0056]
向合成管中加入2n当量的氨基酸、2n当量的dipea、2n当量的hctu和dmf，震荡反应1h，抽掉反应液并用dmf洗涤，然后加入按步骤2)的方式脱fmoc，洗净，茚三酮检测。
[0057]
4)依步骤3的方式依次加入序列中不同的氨基酸进行各种修饰。其中涉及的氨基酸残基可以是l-型，也可以是d-型，脯氨酸(pro)也可以替换成羟脯氨酸(hyp)，精氨酸(arg)可以替换成高精氨酸(homo-arg)，丙氨酸可以替换成β-丙氨酸。
[0058]
5)裂解
[0059]
将树脂用氮气吹干，向多肽合成管中加入切割液(87.5％tfa 5％苯甲硫醚 2.5％乙二硫醇 2.5％苯酚 2.5％水)，切割液体积和树脂的比例大约为10ml/g，反应2-3h后，抽滤得到滤液，加入大量乙醚，然后离心，固体用乙醚洗涤三遍，得到多肽粗品。
[0060]
6)分离纯化
[0061]
采用反相高效液相色谱法纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％tfa/水溶液0.1％tfa/乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收进行定量，结果显示成功合成该多肽，且纯度为95％以上。将收集好的洗脱液放入冻干机进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0062]
实施例2制备多肽yqgf-x(x＝2-6)
[0063]
按照实施例1的方法制备肿瘤靶向肽yqgl-2，该序列为d-leu-arg-d-leu-ser-gly-gly-pro-gln；其中d-leu代表d型leu；所示多肽，质谱确证[m-h]-＝824.94。
[0064]
肿瘤靶向肽yqgl-3，该序列为leu-d-arg-leu-ser-gly-gly-pro-gln；其中d-arg代表d型arg；所示多肽，质谱确证[m-h]-＝825.14。
[0065]
肿瘤靶向肽yqgl-4，该序列为leu-homo-arg-leu-ser-gly-gly-pro-glu；homo-arg代表高精氨酸所示多肽，质谱确证[m-h]-＝835.28。
[0066]
肿瘤靶向肽yqgl-5，该序列为d-leu-d-arg-leu-ser-gly-gly-hyp-glu；hyp代表
3、yqgl-4、yqgl-5、yqgl-6相较于空白对照组也有明显的亲和力。
[0080]
实施例5制备的化合物mpa-yqgl-1在乳腺癌4t1荷瘤鼠体内的光学成像图
[0081]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-1配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只乳腺癌4t1荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-1溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-2在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图5所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0082]
实施例6制备的化合物mpa-yqgl-2在乳腺癌mda-mb-231荷瘤鼠体内的光学成像图
[0083]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-2配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只乳腺癌mda-mb-231荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-2溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-2在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图6所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0084]
实施例7制备的化合物mpa-yqgl-3在乳腺癌mcf7荷瘤鼠体内的光学成像图
[0085]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-3配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只结乳腺癌mcf7荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-3溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-3在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图7所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0086]
实施例8制备的化合物mpa-yqgl-4在结直肠腺癌ht29荷瘤鼠体内的光学成像图
[0087]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-4配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只结直肠腺癌ht29荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-4溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-4在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图8所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0088]
实施例9制备的化合物mpa-yqgl-5在肝癌a549荷瘤鼠体内的光学成像图
[0089]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-5配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只肝癌a549荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-5溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-5在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞
留。显像结果如图9所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0090]
实施例10制备的化合物mpa-yqgl-6在宫颈癌hela荷瘤鼠体内的光学成像图
[0091]
将实施例3制备的化合物mpa-yqgl-6配制成生理盐水溶液(1mg/ml)，通过尾静脉分别给3只宫颈癌hela荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgl-6溶液15μl，并于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgl-6在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图10所示。其中，2h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0092]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。