作为膜性肾病的预后和预测因子的免疫显性PLA2R1表位的分布

作为膜性肾病的预后和预测因子的免疫显性pla2r1表位的分布
技术领域
1.本发明涉及基于分析pla2r1表位免疫显性分布预测患有膜性肾病的患者的预后和测定对免疫抑制治疗的应答可能性的方法。


背景技术：

2.膜性肾病(mn)是一种罕见但严重的自身免疫性肾病。它是成人肾病综合征的常见原因，影响自体和移植肾(ronco,p,debiec,h:pathophysiological advances in membranous nephropathy:time for ashift in patient's care.lancet,385:1983-1992,2015)。临床演变复杂，从自发缓解到持续性蛋白尿和终末期肾病(eskd)。
3.2009年，beck及其同事将m型磷脂酶a2受体(pla2r1)鉴定为mn中的主要自身抗原，其中约70％的患者具有循环抗pla2r1自身抗体，与肾小球中的原位免疫复合物沉积、足细胞损伤和高蛋白尿相关(beck,lh,jr.,bonegio,rg,lambeau,g,beck,dm,powell,dw,cummins,td,klein,jb,salant,dj:m-type phospholipase a2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy.n engl j med,361:11-21,2009)。
4.pla2r1是180kda i型跨膜糖蛋白，其由包含通过短接头序列连接的10个单独结构域的大胞外区组成：n-末端富含半胱氨酸的结构域(cysr)、纤连蛋白ii型结构域(fnii)和八个不同的c型凝集素样结构域(ctld)。
5.标准化试验，诸如iift(间接免疫荧光测定)、elisa(酶联免疫吸附测定)和chlia(化学发光免疫测定)，可用于检测抗pla2r1自身抗体，并且现在用于pla2r1相关mn诊断、预后和治疗的临床实践(iift:e.hoxha,s.harendza,g.zahner,u.panzer,o.steinmetz,k.fechner,u.helmchen,r.a.stahl,“an immunofluorescence test for phospholipase-a2-receptor antibodies and its clinical usefulness in patients with membranous glomerulonephritis”,nephrol dial transplant,26(2011)2526-2532；elisa:dahnrich,c,komorowski,l,probst,c,seitz-polski,b,esnault,v,wetzels,jf,hofstra,jm,hoxha,e,stahl,ra,lambeau,g,stocker,w,schlumberger,w:“development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy”.clin chim acta,421c:213-218,2013；chlia:c.s.saschenbrecker,i.gunnarsson,w.schlumberger,p.ronco,h.debiec,“development of a standardized chemiluminescence immunoassay for the detection of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy”,kidney international reports,5(2020)182-188；and)。抗pla2r1滴度有助于预测临床结果，其中低滴度与自发缓解有关，并且高滴度与发展至严重疾病和eskd有关。
6.此外，一些研究已经证明抗pla2r1自身抗体识别pla2r1中的多个构象表位。seitz-polski&dolla及其同事将cysr、ctld1和ctld7鉴定为三个不同的含表位结构域，其
可能提示表位扩散机制(seitz-polski,b,dolla,g,payre,c,girard,ca,polidori,j,zorzi,k,birgy-barelli,e,jullien,p,courivaud,c,krummel,t,benzaken,s,bernard,g,burtey,s,mariat,c,esnault,vl,lambeau,g:epitope spreading of autoantibody response to pla2r associates with poor prognosis in membranous nephropathy.j am soc nephrol,27:1517-1533,2016)。发现所有患者均为cysr阳性，而仅有一个亚组对ctld1和/或ctld7呈阳性。
7.因此，根据表位阳性或不针对不同的含表位结构域的分布，wo2017/009245描述了将患者分层为两个主要亚组：对pla2r1的cysr结构域具有单一阳性的那些，以及对cysr和ctld1和/或ctld7结构域具有多重阳性的那些。该分层允许将患者分为两类：预后良好/对治疗的应答良好和预后差/对治疗的应答差。事实上，表现出仅抗pla2r1的cysr结构域的自身抗体的患者将预后良好。相反，表现出抗cysr以及pla2r1的ctld1和/或ctld7的循环自身抗体的患者预后差(seitz-polski,b,debiec,h,rousseau,a,dahan,k,zaghrini,c,payre,c,esnault,vlm,lambeau,g,ronco,p:phospholipase a2 receptor 1epitope spreading at baseline predicts reduced likelihood of remission of membranous nephropathy.j am soc nephrol,29:401-408,2018)。
8.总之，上述数据表明抗pla2r1滴度和基于表位阳性的分布有助于预测对免疫抑制治疗(包括用利妥昔单抗治疗)的应答。这与reinhard等人最近的表明抗pla2r1滴度而非表位阳性可预测临床结果的结论形成对比。不一致的结论可能是由于几个因素，特别是免疫抑制治疗的类型，这主要基于给予reinhard队列中大多数患者的烷基化药物和/或神经钙蛋白抑制剂(reinhard,l,zahner,g,menzel,s,koch-nolte,f,stahl,rak,hoxha,e:clinical relevance of domain-specific phospholipase a2 receptor 1antibody levels in patients with membranous nephropathy.j am soc nephrol,2019)。事实上，最近已经表明，与利妥昔单抗相比，用烷基化药物(诸如环磷酰胺)进行的免疫抑制治疗诱导抗pla2r1抗体更快和更强的消失(van de logt,ae,dahan,k,rousseau,a,van der molen,r,debiec,h,ronco,p,wetzels,j:immunological remission in pla2r-antibody-associated membranous nephropathy:cyclophosphamide versus rituximab.kidney int,93:1016-1017,2018)，这可以克服患者之间体液应答的细微差别，并因此克服不同抗pla2r1特征的预测值(滴度vs表位分布)。
9.尽管上述研究基于抗pla2r1滴度或表位阳性在患者中更好地诊断和预测结果，但基于这些抗pla2r1特征，用保守治疗或各种免疫抑制剂的治疗选择没有被很好地定义。更具体地，需要建立抗pla2r1滴度的截止值或鉴定具有超过滴度或表位阳性的增加值的新的生物标志物，这将有助于指导使用免疫抑制剂的治疗选择并预测应答的可能性。
10.在分子水平上，尽管pla2r1表位的鉴定有上述进展，但我们缺乏对在患者中观察到的抗pla2r1体液自身免疫应答的完整描述，包括表位总数的鉴定和最高发和免疫显性的鉴定。与上述由抗pla2r1滴度和表位阳性组成的抗pla2r1特征相比，该详细描述可导致发现新的分子生物标志物，从而以更灵敏和更精确的方式鉴定处于差的临床结果风险中的患者并监测治疗功效。
11.发明概述
12.本发明人现在表明，在诊断时在患者中观察到的抗pla2r1体液应答在大多数情况
下是多克隆的，然而是可变的，其中存在多种发生率和免疫显性不同的新的自身抗体，允许基于这些特征对患者进行新的表征。
13.本发明人进一步证明免疫显性分布在临床上可用于对患者进行分层，并比现有技术中描述的方法更精确地指导治疗选择。
14.本发明人首先清楚地表明pla2r1的cysr和/或ctld1结构域含有驱动大多数患者的体液应答的关键的独立免疫显性表位，而其它含有pla2r1表位的结构域在自身免疫应答的强度中起次要作用。
15.本发明人进一步表明，根据主要驱动体液应答的自身抗体的性质，基于免疫显性特征(例如通过直接或竞争性elisa测定所测量)对患者的表征导致将患者分层为两组：
[0016]-当针对pla2r1的体液应答主要由抗ctld1自身抗体驱动时，对ctld1(ic1)免疫显性的患者，和
[0017]-当针对pla2r1的体液应答不是主要由抗ctld1自身抗体驱动时，对ctld1非免疫显性的患者。
[0018]
本发明人还证明免疫显性本身可用作临床生物标志物，也可用作另外的临床生物标志物，其可任选地与抗pla2r1滴度组合以改进临床结果和对治疗应答的可能性。
[0019]
此外，本发明人证明免疫显性可通过两种方法准确评估：
[0020]
1.通过竞争测定(例如竞争elisa测定、化学发光免疫测定chlia或免疫荧光测定)，在这种情况下，对ctld1非免疫显性的患者可以任选地分层为两个亚组：
[0021]-免疫显性cysr(icr)患者，其对pla2r1的体液应答主要由抗cysr自身抗体驱动；
[0022]-非免疫显性(非idom)患者，其对pla2r1的体液应答不由抗cysr、抗ctld1或任何其它抗pla2r1自身抗体驱动。
[0023]
2.通过测量抗ctld1自身抗体滴度与抗cysr自身抗体滴度的比率(或相反)。在这种情况下，可以将比率的值与参考值(例如针对来自队列的mn患者测量的比率的中值)进行比较。在该实施方案中，患者可分为ic1(ctld1免疫显性)或icr(cysr免疫显性)。
[0024]
根据免疫显性对患者进行分层可用于指导和治疗施用不同免疫抑制剂，特别是利妥昔单抗的患者，以获得更好的对治疗应答的可能性。
[0025]
实际上，根据本发明的免疫显性分布允许从预后差的患者(ic1患者)中鉴定预后良好的患者(icr，和任选的非idom患者，如果通过竞争测定评估免疫显性)。从病理生理学的观点来看，ic1患者与icr(和任选地非idom患者，如果通过竞争测定评估免疫显性)患者的区别在于在cysr和ctld1结构域上表现出两类靶向pla2r1的免疫显性自身抗体，这可发挥协同作用并且可在诱导足细胞损伤和大量蛋白尿方面更具致病性。
[0026]
免疫显性分布允许以更灵敏的方式鉴定并将患者分层。实际上，根据本发明的免疫显性分布允许通过先前在现有技术中描述的方法(诸如抗pla2r1滴度)和基于表位阳性的分布，鉴定具有良好预后和对治疗应答的可能性的患者，所述患者之前将不被认为是良好应答者。根据本发明的方法还允许在预后方面以及在对治疗的应答方面区分新的icr和ic1组并避免假阳性/阴性。
[0027]
因此，在第一方面，本发明涉及用于测定获自患有膜性肾病(mn)，优选特发性膜性肾病(imn)，更优选pla2r1相关的膜性肾病(pla2r1-mn)的患者的样品中的pla2r1免疫显性的方法，其包括测定主要驱动所述样品中的体液应答的免疫显性抗体的性质的步骤。在一
个实施方案中，这通过pla2r1与饱和量的cysr-fnii-ctld1片段，优选与饱和量的选自cysr片段、ctld1片段和cysr-fnii-ctld1或ctld2-8片段，优选cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段、ctld5片段和ctld7片段或其混合物的多肽竞争剂之间的各种类型的竞争测定(例如elisa、chlia、免疫荧光等)来进行。在第二个实施方案中，pla2r1免疫显性可以通过测量抗ctld1和抗cysr滴度并计算那些滴度的比率来确定(详见下文)。优选地，滴度的比率用于实现根据本发明的任何方法的目的。
[0028]
本发明人表明，在pla2r1阳性膜性肾病患者中，循环抗pla2r1自身抗体可识别多达5个含表位的结构域，包括cysr、ctld1、ctld5、ctld7和ctld8。
[0029]
他们有利地证明了两个n-末端cysr和ctld1结构域具有主要的免疫显性表位，其贡献了通过标准化的商业上可获得的elisa测定测量的大部分抗pla2r1滴度(参见dahnrich,c,komorowski,l,probst,c,seitz-polski,b,esnault,v,wetzels,jf,hofstra,jm,hoxha,e,stahl,ra,lambeau,g,stocker,w,schlumberger,w:“development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy”.clin chim acta,421c:213-218,2013)。相反，c-末端结构域ctld5、ctld7和ctld8含有非免疫显性表位，这些表位共同贡献很少的抗pla2r1滴度。
[0030]
总之，总体液自身免疫应答似乎主要由n-末端cysr和/或ctld1结构域驱动，所述结构域起到两个关键的免疫显性含表位结构域的作用，而c-末端结构域的远端阳性对抗pla2r1滴度贡献很小。
[0031]
本发明人证明，在三组(icr/非idom vs.ic1，当通过竞争测定评估免疫显性时)或两组(icr vs.ic1，当考虑患者的抗ctld1与抗cysr滴度的比率时)患者中考虑免疫显性可准确预测临床结果。实际上，与之前典型地基于抗pla2r1滴度或表位阳性的已知方法相比，本发明的方法对患者进行不同的分层(值得注意地参见图6-9)并且允许更好地鉴定处于风险中的患者。
[0032]
在第二方面，本发明涉及预测患有膜性肾病的患者的预后的方法，其包括根据用于测定pla2r1免疫显性的方法测定从所述患者获得的样品中的pla2r1免疫显性，其中：
[0033]-对ctld1免疫显性的患者表现出差的预后；
[0034]-对ctld1非免疫显性的患者，典型地是对cysr免疫显性的患者(和/或如果通过竞争测定评估免疫显性，则是非免疫显性的患者)表现出良好的预后。
[0035]
在第三方面，本发明人还表明免疫显性分布有助于指导用免疫抑制剂的治疗并预测应答的可能性，本发明涉及预测患有膜性肾病的患者对免疫抑制治疗的应答的方法，其包括根据用于测定pla2r1免疫显性的方法测定从所述患者获得的样品中的pla2r1免疫显性，其中：
[0036]-对ctld1免疫显性的患者对用免疫抑制剂治疗有耐药性；
[0037]-对ctld1非免疫显性的患者，典型地是cysr免疫显性的患者(和/或如果通过竞争测定测量免疫显性，则是非免疫显性患者)是免疫抑制剂的良好应答者。
[0038]
在第四方面，本发明涉及用于在有需要的受试者中治疗膜性肾病的方法，其包括：
[0039]-根据用于测定pla2r1免疫显性的方法，通过测定所述样品中主要驱动体液应答的抗体的性质，测定获自膜性肾病患者的样品中的pla2r1免疫显性，和：
[0040]-当所述患者对cysr是免疫显性的或是非免疫显性，并因此被认为是对所述治疗的良好应答者时，向所述患者施用有效量的对症治疗或有效量的免疫抑制剂；
[0041]-当所述患者对ctld1是免疫显性的，并因此对所述免疫抑制剂具有耐药性时，重复有效量的免疫抑制剂或施用有效量的替代或组合的更强免疫抑制疗法，或启动血液透析。
[0042]
本发明还涵盖试剂盒，其包含：
[0043]
用于检测与cysr、ctld1或pla2r1的细胞外结构域结合的自身抗体，优选与人igg类自身抗体结合的第二抗体，更优选携带可检测标记的第二抗体的装置，和
[0044]
或
[0045]-固定多肽，其包含cysr或其变体，所述cysr或其变体结合针对cysr的自身抗体，
[0046]-固定多肽，其包含ctld1或其变体，所述ctld1或其变体结合针对ctld1的自身抗体；
[0047]-一种或多种多肽，优选全部为固定形式，其来自包括ctld5、ctld7和ctld8或其变体的组，所述ctld5、ctld7和ctld8或其变体分别结合针对ctld5、ctld7或ctld8的自身抗体，
[0048]-固定多肽，其包含pla2r1的细胞外结构域或其变体，所述pla2r1的细胞外结构域或其变体结合针对pla2r1的细胞外结构域的自身抗体；和
[0049]-任选地，阴性对照或截止指示物，其指示自身抗体(如果存在)的非特异性结合；并且
[0050]
其中固定多肽被固定在一种或多种诊断上有用的载体上，所述载体在空间上是分开的，使得结合所述多肽之一的抗体可以区别于结合任何其它多肽的自身抗体。
[0051]
或
[0052]-固定多肽，其包含pla2r1的细胞外结构域或其变体，所述pla2r1的细胞外结构域或其变体结合针对pla2r1的细胞外结构域的自身抗体；和
[0053]-非固定多肽，其包含cysr或其变体，所述cysr或其变体结合针对cysr的自身抗体，和
[0054]-非固定多肽，其包含ctld1或其变体，所述ctld1或其变体结合针对ctld1的自身抗体，和
[0055]-一种或多种多肽，优选全部为固定形式，其来自包括ctld5、ctld7和ctld8或其变体的组，所述ctld5、ctld7和ctld8或其变体分别结合针对ctld5、ctld7或ctld8的自身抗体，
[0056]-任选地，阴性对照或截止指示物，其指示自身抗体(如果存在)的非特异性结合，
[0057]
其中所述试剂盒优选另外包含含有针对cysr的抗体的第一对照和含有针对ctld1的抗体的第二对照，更优选另外包含含有针对ctld5的抗体的对照，含有针对ctld7的抗体的对照和含有针对ctld8的抗体的对照。
附图说明
[0058]
图1显示了142名pla2r1阳性mn患者队列中的发生率和表位分布。(图1a)通过elisa(igg4检测)用pla2r1的10个单独结构域筛选142名pla2r1阳性患者显示出针对5个结
构域的反应性，其发病率降低：cysr(cr)、ctld5(c5)、ctld1(c1)、ctld7(c7)和ctld8(c8)。其余5个结构域均未被识别。(图1b)可以组合患者对单个结构域的反应性以提供不同的表位分布，其中crc5、crc1c5c7、crc1、cr、crc5c7和crc1c5是最高发的。
[0059]
图2表示表位阳性和抗pla2r1滴度之间的关系。(图2a)通过增加抗pla2r1滴度(标准化elisa，总igg检测)将患者(n＝142)分级，并叠加不同结构域的阳性以显示不同的模式。所有患者对cysr均呈阳性。在第一三分位数中，29.8％的患者是ctld1，53.2％的ctld5，8.5％的ctld7和0％的ctld8。在第二三分位数中，35.4％的患者为ctld1，75.0％的ctld5，35.4％的ctld7和4.2％的ctld8。第三三分位数中，74.5％的患者为ctld1，68.1％的ctld5，66.0％的ctld7和6.4％的ctld8。(图2b)将患者(n＝142)根据其从cysr结构域到pla2r1的c-末端的表位阳性和ctld1的阳性与否的复杂性进行分级。表位阳性的复杂性增加似乎与抗pla2r1滴度有关。
[0060]
图3证明免疫显性分布与抗pla2r1滴度之间的关系。(图3a)通过增加抗pla2r1滴度(标准化elisa，总igg检测)对患者(n＝136)进行分级，并显示其免疫显性。在第一三分位数中，66.7％的患者是icr，24.4％的ic1和8.9％的非idom。在第二三分位数中，60.9％的患者是icr，21.7％的ic1和17.4％的非idom。在第三三分位数中，37.8％的患者为icr，62.2％为ic1，0％为非idom。滴度上的星号指示对于ctld7和/或ctld8为阳性。(图3b)将患者(n＝136)根据其免疫显性分布(icr、非idom或ic1)结合其从cysr结构域到pla2r1的c-末端区域的表位阳性的复杂性进行分级。当它们变成免疫显性时，以粗体显示cr和c1。表位分布增加的复杂性似乎与icr和ic1组的抗pla2r1滴度有关。注意，来自非idom组的患者具有相对低的滴度，与仅当对cysr或ctld1的免疫显性有效时才观察到高滴度的观点一致。
[0061]
图4突出显示cysr和ctld1是两个免疫显性pla2r1结构域，并且定义了pla2r1阳性mn患者的不同组。(图4a)通过内部elisa(igg4检测)对三名患者进行的代表性竞争测定允许在三个不同组中进行分类：icr、ic1和非idom。注意，选择的代表性患者具有相同的表位阳性分布(crc1c5c7)，但具有不同的免疫显性分布。(图4b)患者(n＝136)根据它们的免疫显性分布的分层显示它们中的大多数(n＝75，55.1％)具有cysr作为免疫显性pla2r1结构域(icr)，而显著数目(n＝49，36.0％)具有ctld1作为免疫显性pla2r1结构域(ic1)。将一小组患者(n＝12，8.8％)归类为非idom。由于缺乏血清，不能为来自最初142名患者的队列的6名患者指定免疫显性分布。
[0062]
图5描述了针对pla2r1阳性mn患者总体(n＝141)或根据免疫显性(n＝135)的标准化的抗pla2r1滴度(总igg检测)与内部抗pla2r1滴度(igg4检测)、抗cysr或抗ctld1滴度(igg4检测)之间的相关性。(图5，上图)通过标准化elisa(总igg)和内部elisa(igg4)测量的抗pla2r1滴度之间的相关性。(图5，中图和下图)通过标准化elisa测量的抗pla2r1滴度(总igg)与抗cysr滴度(图5，中图)或抗ctld1滴度(图5，下图)之间的相关性。注意与ic1患者相比，整个群体和icr患者的抗pla2r1和抗ctld1滴度之间的相关性较弱。
[0063]
图6表示根据免疫显性分布(图6a)、限制或不限制cysr的组合表位阳性(图6b)、含表位结构域的单一阳性(图6c)和抗pla2r1滴度(图6d)的患者临床结果。图6e进一步显示了当仅考虑抗pla2r1滴度低于200ru/ml的患者时，根据其免疫显性分布的患者临床结果。
[0064]
图7证明了使用竞争elisa和抗ctld1/抗cysr比率分析的方法之间通过免疫显性对患者进行分层的高度一致性。通过增加抗ctld1/抗cysr比率将患者(n＝135)分级，并显
示通过竞争elisa测定的它们的免疫显性分布。数据显示两种方法之间的高度一致性。例如，当考虑中值时，71％的icr患者低于中值，而90％的ic1患者高于中值。类似地，66％的非idom患者低于中值，与icr患者的相似临床特征一致。
[0065]
图8表示根据低于和高于抗ctld1/抗cysr比率的中值(0.0324)的分层的患者的抗pla2r1滴度(图8a，标准化elisa，总igg的检测)，和抗cysr(图8b)和抗ctld1(图8c)滴度(内部elisa，igg4检测)。低于和高于中值没有观察到抗pla2r1滴度的显著差异，这表明低于中值的患者(主要是icr)可以具有与高于中值的患者(主要是ic1)相似的滴度。如所预期，低于中值的患者具有较高的抗cysr滴度，而高于中值的患者具有较高的抗ctld1滴度。
[0066]
图9显示如抗ctld1/抗cysr滴度比值(低于和高于研究队列的中值0.0324)所定义的免疫显性对患者的分层与临床结果和对利妥昔单抗治疗的应答有关。根据它们的免疫显性显示作为完全群体的患者(图9a)或具有低于200ru/ml的抗pla2r1滴度的患者(图9b)的临床结果，所述免疫显性通过高于或低于中值(0.0324)的抗ctld1/抗cysr滴度的比率定义。
[0067]
发明详述
[0068]
用于测定pla2r1免疫显性的方法
[0069]
本发明人证明抗pla2r1的自身免疫应答是多克隆的，并导致存在靶向多达5个不同pla2r1结构域的多个循环抗pla2r1自身抗体，所述pla2r1结构域从n-末端到c-末端遍布于整个胞外区：cysr、ctld1、ctld5、ctld7和ctld8。
[0070]
本发明人进一步确定了相对于标准化的抗pla2r1滴度，含有5个表位的结构域的发生率和免疫显性性质，特别是确定了哪些pla2r1结构域含有主要的免疫显性表位，所述主要的免疫显性表位对完整pla2r1抗原(其序列定义如下的完整胞外结构域)上的抗体结合强度贡献最大。
[0071]
为了这些目的，他们通过elisa筛选了一组142名针对10个单一pla2r1结构域的pla2r1阳性膜性肾病(mn)患者。5个含有表位的结构域cysr、ctld1、ctld5、ctld7和ctld8被识别为具有不同的发生率。其它单结构域，即fnii、ctld2、ctld3、ctld4和ctld6均未被识别。基于其最高发生率(100％)和其对通过竞争elisa测量的抗pla2r1信号的最高贡献(高达100％)，cysr结构域起到中心作用并且无疑是主要的免疫显性含表位结构域。ctld5是第二最高发的结构域，具有65.5％的反应性，其次是ctld1(46.5％)、ctld7(36.6％)和ctld8(3.5％)。
[0072]
除发生率之外，本发明人确定了哪个pla2r1结构域含有主要的免疫显性表位，其将对通过elisa在完整pla2r1抗原上测量的信号贡献最大。
[0073]
因此，在第一方面，本发明涉及用于测定从患有膜性肾病的患者获得的样品中pla2r1免疫显性的方法。
[0074]
在一个实施方案中，该方法包括通过用饱和量的选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段或其混合物的多肽竞争剂进行竞争测定来测定所述样品中主要驱动体液应答的抗体的性质的步骤。
[0075]
在另一个实施方案中，通过建立抗ctld1抗体和抗cysr抗体的滴度之比来实现测定主要驱动来自患者的样品中的体液应答的抗体的性质的步骤。
[0076]
术语“膜性肾病”(mn)具有其在本领域中的一般含义并且是指作为成人肾病综合
征的常见原因的肾自身免疫性疾病。它涵盖原发性膜性肾病(也称为“特发性膜性肾病”)和由其它疾病诸如各种癌症和自身免疫性疾病或感染(包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、乙肝或hiv感染)引起的多发性继发性膜性肾病。特发性膜性肾病(imn)或原发性mn(pmn)被认为是靶向肾小球的自身免疫疾病，其中pla2r1作为主要的自身抗原靶标。优选地，imn或pmn的主要形式是pla2r1相关的膜性肾病。
[0077]
术语“pla2r1”或“pla2r”或“分泌型磷脂酶a2受体1”是指m型磷脂酶a2受体，一种由特别已知为特发性膜性肾病中的主要自身抗原的pla2r1基因编码的人受体。示例性的人天然pla2r1氨基酸序列提供于np_001007268(genpept数据库)，其中各种推荐的和备选的名称和亚型提供于q13018(典型地是膜结合亚型1，但也可以是其它亚型，例如可溶性pla2r1亚型2)(uniprotkb数据库)和其它数据库，并且在本文中称为seq id no:19。
[0078]
然而，应当理解，具有不同序列的多态性或变体存在于各种受试基因组中。因此，根据本发明的术语pla2r(或pla2r1)涵盖pla2r的所有哺乳动物变体，以及编码与seq id no:19至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，或典型地85％，90％，或95％，99％或99.5％相同的该蛋白质的基因。
[0079]
现有技术包括可用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如arthur lesk(2008),introduction to bioinformatics,oxford university press,2008,第3版。在优选实施方案中，使用clustalw软件(larkin,m.a.,blackshields,g.,brown,n.p.,chenna,r.,mcgettigan,p.a.,mcwilliam,h.,valentin,f.,wallace,i.m.,wilm,a.,lopez,r.,thompson,j.d.,gibson,t.j.,higgins,d.g.(2007):clustal w and clustal x version 2.0.bioinformatics,23,2947-2948)，应用默认设置。如本文所用，两个序列之间的表述“同一性百分比”是指用所述序列的最佳比对获得的待比较的两个序列之间的相同碱基或氨基酸的百分比，该百分比是纯统计的，并且这两个序列之间的差异随机分布在两个序列上。本文所用的“最优比对”或“最佳比对”是指测定的同一性百分比(见下文)最高的比对。两个核酸序列之间的序列比较通常通过比较根据最佳比对预先比对的这些序列来实现；该比较在比较片段上实现，以便鉴定和比较局部相似性区域。除人工外，通过使用由smith和waterman(j.mol.biol,vol.48,p:443,1970)开发的全局同源性算法、通过使用由pearson和lipman(proc.natl.acd.sci.usa,vol.85,p:2444,1988)开发的相似性方法、通过使用计算机软件，使用这样的算法(wisconsin genetics软件包中的gap,bestfit,blast p,blast n,fasta,tfasta,genetics computer group,575 science dr.,madison,wi usa)、通过使用muscle多重比对算法(edgar,robert c,nucleic acids research,vol.32,p:1792,2004)可以实现进行比较的最佳序列比对。为了获得最佳的局部比对，可以优选使用blast软件。两个序列之间的同一性百分比通过比较这两个最佳比对的序列来测定，为了获得这两个序列之间的最佳比对，所述序列能够包含相对于参考序列的添加或缺失。通过测定这两个序列之间相同位置的数目，并将该数目除以比较位置的总数，并将所得结果乘以100以得到这两个序列之间的同一性百分比，来计算同一性百分比。
[0080]
可以通过将插入、突变、缺失纳入野生型序列中以及将其它序列(例如人工接头和/或标签序列)融合至野生型序列或其变体的n-和/或c-末端来产生变体。在优选实施方案中，变体包含来自或衍生自野生型序列的至少30个连续的氨基酸残基。特别优选的变体
包括来自动物，优选哺乳动物的同源序列。
[0081]
所述多肽的变体具有生物学活性。在一个优选实施方案中，这种生物活性是与来自患者样品的待检测抗体结合的能力或待测定抗体的水平。
[0082]
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指具有膜性肾病症状和/或疑似患有膜性肾病的个体。在本发明的上下文中，受试者或患者优选是患有或疑似患有特发性膜性肾病，优选pla2r1相关的mn的受试者。
[0083]“样品”是从所述受试者获得的生物样品。这样的样品包括但不限于可能含有或可能不含有细胞的体液，例如血液(例如全血、血清或血浆)或尿液。这样的样品还包括活检(例如肾活检)。优选地，所述样品是所述受试者的体液。样品的非限制性实例包括但不限于全血样品、血浆或血清、或尿。优选地，所述生物样品是血清。术语生物样品还涵盖通过处理生物样品得到的任何材料。衍生的材料包括但不限于从样品中分离的细胞(或其后代)，或从样品中提取的蛋白质，如在治疗慢性肾衰竭的各种类型的透析技术(血液透析、腹膜透析等)后获得的血浆交换。生物样品的处理可以包括以下中的一种或多种：过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰成分的灭活、试剂的添加等。
[0084]
在优选实施方案中，样品选自可能含有或可能不含有细胞或活检的体液。
[0085]
在另一个优选实施方案中，样品选自全血、血清、血浆、尿或肾活检。
[0086]
竞争测定
[0087]
在一些实施方案中，从患有膜性肾病的患者获得的样品中pla2r1免疫显性的测定包括在生物样品中饱和量的至少一种多肽竞争剂和完整pla2r1抗原之间进行竞争测定(典型地为elisa竞争测定)的步骤。
[0088]“完整pla2r1抗原”具有至少完整的pla2r1胞外区或其任何变体，可用于或足以进行这种竞争测定。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其它实施方案所使用的“pla2r1的胞外区”由seq id no1表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no1的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seqid no1的多肽或其变体。对于本发明的某些实施方案，包含cysr-fnii-ctld1结构域，优选seq id no8的多肽是胞外区pla2r1的变体。
[0089]
本发明的教导不仅可以使用具有本技术中明确提及的野生型序列(如seq id no:1，例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含提及的多肽来进行，而且可以使用其变体来进行。在优选实施方案中，本文使用的术语“变体”是指与本文提及的全长序列或其至少生物活性片段具有至少50，55，60，65，70，75，80，85，90，92，94，96，97，98，99，99.5或99.9％序列同一性的多肽。可以通过将插入、突变、缺失纳入野生型序列中以及将其它序列(例如人工接头和/或标签序列)融合至野生型序列或其变体的n-和/或c-末端来产生变体。在优选实施方案中，变体包含来自或衍生自野生型序列的至少30个连续的氨基酸残基。特别优选的变体包括来自动物，优选哺乳动物的同源序列。
[0090]
所述多肽的变体具有生物学活性。在一个优选实施方案中，这种生物活性是与来自患者样品的待检测抗体结合的能力或待测定抗体的水平。例如，包含seq id no1变体的多肽具有结合来自患者样品的包含seq id no1的多肽的自身抗体的能力。在更优选的实施方案中，所述针对包含seq id no1的多肽的自身抗体可以包含针对cysr的自身抗体和针对
ctld1的自身抗体。对此有用的变体是cysr-fnii-ctld1。在另一个更优选的实施方案中，所述针对包含seq id no1的多肽的自身抗体可以包含针对cysr的自身抗体、针对ctld1的自身抗体、针对ctld5的自身抗体、针对ctld7的自身抗体和针对ctld8的自身抗体。根据本发明的方法，例如实施例中基于elisa的技术可用于确定变体是否具有所述生物活性。
[0091]
在公开pla2r1序列的哪些部分对于自身抗体的结合活性是重要的现有技术文献中，例如在以下中，可获得本领域技术人员设计变体的指导：1)fresquet m,jowitt ta,gummadova j,et al.identification of a major epitope recognized by pla2r autoantibodies in primary membranous nephropathy.j am soc nephrol.2015；26(2):302-313；2)b.seitz-polski,g.dolla,c.payre,n.m.tomas,m.lochouarn,l.jeammet,c.mariat,t.krummel,s.burtey,c.courivaud,w.schlumberger,k.zorzi,s.benzaken,g.bernard,v.l.esnault,g.lambeau,cross-reactivity of anti-pla2r1 autoantibodies to rabbit and mouse pla2r1 antigens and development of two novel elisas with different diagnostic performances in idiopathic membranous nephropathy,biochimie,118(2015)104-115；3)seitz-polski,b,dolla,g,payre,c,girard,ca,polidori,j,zorzi,k,birgy-barelli,e,jullien,p,courivaud,c,krummel,t,benzaken,s,bernard,g,burtey,s,mariat,c,esnault,vl,lambeau,g:epitope spreading of autoantibody response to pla2r associates with poor prognosis in membranous nephropathy.j am soc nephrol,27:1517-1533,2016；4)l.reinhard,g.zahner,s.menzel,f.koch-nolte,r.a.k.stahl,e.hoxha,clinical relevance of domain-specific phospholipase a2 receptor 1 antibody levels in patients with membranous nephropathy,j am soc nephrol,31(2020)197-207。
[0092]
当设计变体时，本领域技术人员将记住测定的目的。在优选实施方案中，用于测定ctld1自身抗体水平的包含ctld1的多肽将被设计为使其不结合cysr自身抗体。在另一个优选实施方案中，用于测定针对cysr的自身抗体水平的包含cysr的多肽将被设计为使其不结合针对ctld1的自身抗体。
[0093]
在一个优选实施方案中，待检测的抗体或待测定的抗体水平优选特异性结合目标序列，如pla2r1的细胞外结构域，或cysr、ctld1、ctld5、ctld7或ctld8结构域。特异性结合优选意指结合反应强于特征在于解离常数为1x10-6
m，更优选1x10-7
m，更优选1x10-8
m，更优选1x10-9
m，更优选1x10-10
m，更优选1x10-11
m，更优选1x10-12
m的结合反应，如例如通过表面等离振子共振使用biacore设备或类似系统在25℃下在ph7.0的pbs缓冲液中测定。
[0094]
多肽竞争剂选自cysr-fnii-ctld1片段、cysr片段、ctld1片段、ctld5片段、ctld7片段、cysr和ctld2-8片段的混合物(cysr ctld2-8)和ctld1和ctld2-8片段的混合物(ctld1 ctld2-8)或其混合物或其任何肽。
[0095]
在一个实施方案中，多肽竞争剂选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段或其混合物。
[0096]
在另一个实施方案中，多肽竞争剂选自cysr片段、ctld1片段、和cysr-fnii-ctld1片段、ctld2-8片段或其混合物。
[0097]
在另一个实施方案中，多肽竞争剂选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段、ctld7片段和ctld5片段或其混合物。
[0098]
在另一个实施方案中，多肽竞争剂是cysr-fnii-ctld1片段。
[0099]
在另一个实施方案中，所述多肽竞争剂是cysr片段和ctld1片段；
[0100]
在另一个优选的实施方案中，多肽竞争剂是cysr片段、ctld1片段和cysr-fnii-ctld1片段。
[0101]
在另一个优选的实施方案中，多肽竞争物是cysr片段、ctld1片段，cysr-fnii-ctld1片段和ctld2-ctld8片段。
[0102]
在另一个优选的实施方案中，多肽竞争剂是cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段、ctld7片段和ctld5片段。
[0103]
完整的pla2r1抗原和多肽竞争物被自身抗体识别。
[0104]
术语“自身抗体”具有其在本领域中的一般含义并且是指由受试者的免疫系统产生并且抗受试者自身蛋白(例如pla2r1结构域中的特异性表位)的抗体。自身抗体可攻击身体自身的细胞、组织和/或器官，引起炎症、细胞损伤和最终组织损伤，如膜性肾病中的足细胞损伤和肾损伤。在本技术中，术语自身抗体或抗体以相同的含义使用。
[0105]
如本文所用，表述“抗cysr-fnii-ctld1、cysr、ctld1、ctld5、ctld7、ctld8、cysr ctld2-8、ctld1 ctld2-8的自身抗体”，“抗多肽竞争物的自身抗体”和“本发明的自身抗体”是指分别识别pla2r1的cysr-fnii-ctld1结构域；pla2r1的富含半胱氨酸的结构域(cysr或cr)；pla2r1的c型凝集素样结构域1(ctld1或c1)；pla2r1的c型凝集素样结构域5(ctld5或c5)，pla2r1的c型凝集素样结构域7(ctld7或c7)；pla2r1的c型凝集素样结构域8(ctld8或c8)；pla2r1的cysr和ctld2-8结构域的混合物，以及pla2r1的ctld1和ctld2-8结构域的混合物的自身抗体。
[0106]
根据本发明的方法包括通过进行竞争测定来确定样品中主要驱动体液应答的抗体的性质的步骤，所述竞争测定包括以下步骤：
[0107]-首先将来自患有膜性肾病的患者的样品与饱和量的cysr-fnii-ctld1片段一起孵育，
[0108]-使所述样品与所述全pla2r1抗原接触；
[0109]-测量剩余活性。
[0110]
在一个优选实施方案中，竞争测定包括以下步骤：
[0111]-首先将来自患有膜性肾病的患者的样品与饱和量的选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段或其混合物的多肽竞争剂一起孵育；
[0112]-使所述样品与所述全pla2r1抗原接触；
[0113]-测量剩余活性。
[0114]
在又一个优选实施方案中，竞争测定包括以下步骤：
[0115]-首先将来自患有膜性肾病的患者的样品与饱和量的选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段、ctld2-8片段或其混合物的多肽竞争剂一起孵育；
[0116]-使所述样品与所述全pla2r1抗原接触；
[0117]-测量剩余活性。
[0118]
在又一个优选实施方案中，竞争测定包括以下步骤：
[0119]-首先将来自患有膜性肾病的患者的样品与饱和量的选自cysr片段、ctld1片段、cysr-fnii-ctld1片段、ctld5片段和ctld7片段或其混合物的多肽竞争剂一起孵育；
[0120]-使所述样品与所述全pla2r1抗原接触；
[0121]-测量剩余活性。
[0122]
如本文所用，术语“剩余活性”是指考虑到个体患者的非特异性信号，在存在至少一种多肽竞争剂的情况下测量的剩余信号的百分比。将该百分比与不存在任何多肽竞争剂时测定的最大比活性(100％)进行比较。在各种pla2r1结构域或片段存在下测量的相应剩余活性允许确定免疫显性的类型。
[0123]
在优选实施方案中，竞争测定通过elisa进行。本文所用的术语“elisa”是指酶联免疫吸附测定。竞争性elisa是包含抗体和用于定量样品中分析物的量的可检测标记的竞争性结合测定。
[0124]
这种竞争测定的elisa形式是优选形式，但是可以进行任何类型的免疫竞争测定，包括但不限于基于细胞的测定、多阵列板、免疫沉淀、免疫耗竭、斑点印迹或蛋白质印迹。
[0125]
因此，本发明的方法允许测量剩余活性，其中将从患者获得的样品首先与过量的多肽竞争物预孵育，然后针对全pla2r1抗原进行测试。
[0126]
典型地，在elisa竞争测定的上下文中，用纯化的pla2r1的完整胞外结构域包被微孔板。将生物样品与饱和量的不同重组蛋白(pla2r1或其变体的一个或几个结构域)预孵育，然后添加到包被有全pla2r1抗原的孔中并孵育。可洗涤板以除去未结合的部分，并添加可检测标记的第二结合抗体或任何其它第二结合分子。使第二结合分子与任何捕获的人自身抗体反应，洗涤板，并使用本领域熟知的方法检测第二结合抗体或分子的存在。
[0127]
在其它优选实施方案中，可以根据本发明的任何实施方案使用其它测定，例如竞争测定，特别选自包括免疫扩散测定、免疫电泳测定、光散射测定、凝集测定、标记的免疫测定，例如选自放射性标志物测定、酶测定例如比色测定，化学发光测定和免疫荧光测定的组的那些。
[0128]
在优选实施方案中，为了进行根据本发明的任何实施方案的测定，可以将选自包括cysr、ctld1、pla2r1、pla2r1的细胞外结构域、ctld5，ctld7和ctld8的组的多肽固定在诊断上有用的载体上，所述载体优选选自包括载玻片，优选用于显微镜检查、生物芯片、微阵列、微量滴定板、侧流装置、测试条、膜如硝化纤维膜，优选线印迹、色谱柱和珠，优选微量滴定板的组。这种载体可以在试剂盒中。载体和试剂盒都可以用于根据本发明的任何方法的目的。
[0129]
值得注意的是，人抗pla2r1自身抗体选自以下同种型：igg1、igg2、igg3和igg4。优选地，人抗pla2r1自身抗体是igg4。因此，用标记的第二结合抗体检测包括检测这些igg亚类中的任一种，包括使用抗-总igg或任何其它检测系统(如蛋白a或g)，用本领域熟知的任何标记检测。
[0130]
基本上，在本发明上下文中用于进行elisa的多肽竞争剂在hek293细胞或任何其它蛋白质表达系统中产生，例如但不限于其它哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、植物或大肠杆菌，或体外翻译系统。
[0131]
pla2r1的完整胞外结构域典型地表达为来自hek293细胞的重组分泌蛋白，但可通过其它方式产生，例如其它蛋白表达系统，包括使用其它哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。
[0132]
考虑到个体患者的非特异性信号，竞争测定的结果表示为在不存在竞争剂的情况下测量的最大信号的百分比。
[0133]
剩余活性测量、免疫显性分布和基于免疫显性分布的患者分层
[0134]
对于大多数患者，n-末端cysr-fnii-ctld1三重结构域可抑制50-100％的pla2r1信号，优选60-100％的pla2r1信号，更优选65-100％的pla2r1信号，表明自身免疫应答主要由靶向含cysr和/或含ctld1表位的结构域的自身抗体驱动。
[0135]
用cysr或ctld1作为单结构域以及用cysr或ctld1与ctld2-8混合的进一步竞争测定证明cysr和ctld1都是抗pla2r1反应性的主要贡献者。相反，用含有c-末端ctld5和ctld7表位的结构域进行的进一步竞争测定显示，这些后面的结构域是大多数患者抗pla2r1反应性的次要贡献者。
[0136]
因此，根据本发明的方法允许确定主要驱动体液应答的抗体的性质。
[0137]
基于这些结果，患者可分层为三组：免疫显性cysr(icr)、免疫显性ctld1(ic1)和非免疫显性(非idom)。
[0138]
当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于50％而与ctld1片段的竞争低于30％时，优选当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于60％而与ctld1片段的竞争低于25％时，更优选当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于65％而与ctld1片段的竞争低于20％时，则体液应答主要由抗cysr自身抗体驱动。这定义了对cysr(icr)免疫显性的患者。因此，icr患者被定义为主要由靶向cysr的自身抗体驱动的体液应答和识别包含其他表位的结构域(包括ctld1)的自身抗体的低贡献。患者对“cysr免疫显性”。
[0139]
当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于50％而与ctld1片段的竞争高于10％时，并且优选当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于60％而与ctld1片段的竞争高于15％时，并且优选当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争高于65％而与ctld1片段的竞争高于20％时，则体液应答由抗ctld1自身抗体驱动，但是具有抗cysr自身抗体的各自贡献。这定义了对ctld1(ic1)免疫显性的患者。因此，ic1患者被定义为不仅由抗cysr而且由抗ctld1自身抗体驱动的体液应答，后者贡献高达80％的pla2r1信号反应性(即，以抗cysr反应性为代价，平衡和逐渐增加抗ctld1反应性)，以及极少来自其它含远端表位的结构域的贡献。患者对“ctld1免疫显性”。
[0140]
当与cysr-fnii-ctld1片段的竞争低于50％，优选低于60％，更优选低于65％，而与任何单个结构域的竞争太低以至于不能确定任何特定的免疫显性类型时，意味着没有特定结构域驱动体液自身免疫应答的信号，pla2r1信号均匀遍布于不同的含有表位的结构域上，而没有特定表位结构域的免疫显性的迹象。这定义了非免疫显性(非idom)的患者。因此，非idom患者被定义为其中pla2r1信号似乎均匀遍布于不同的含表位结构域上，而没有特定特异性含表位结构域的免疫显性的任何迹象的体液应答。患者是“非免疫显性的”。
[0141]
本发明人清楚地表明，含有独立表位的5个pla2r1结构域就免疫反应性而言不是等同的。其中，基于其在患者中的最高发生率(100％)和其对抗pla2r1信号的最高贡献(高达100％)，n-末端cysr结构域起核心作用，并且无疑是主要的含有免疫显性表位的结构域。然而，虽然所有患者对cysr阳性，但不是所有患者都是icr，并且他们可以是ic1或非idom。icr患者分布在抗pla2r1滴度的三个三分位数中，更多出现在第一和第二三分位数中。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其它实施方案所用的“cysr”由seq id no2表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no2的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产
物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seq id no2的多肽或其变体。
[0142]
ctld1结构域被清楚地鉴定为具有特定特征的含第二免疫显性表位的结构域。本发明人确实证明了cysr和ctld1结构域含有独立的表位，而fnii结构域不含有任何表位。与cysr相反，ctld1阳性的发生率仅为46.5％，其中在抗pla2r1滴度的第二和第三三分位数中更常观察到阳性。同样与cysr相反，ic1患者更常出现在高三分位数，而icr趋势相反。总之，这表明随着抗pla2r1滴度增加，患者从icr转换为ic1。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其它实施方案所使用的“ctld1”由seq idno3表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no3的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seq id no3的多肽或其变体。
[0143]
ctld5被鉴定为新的独立且高发的，但不含免疫显性表位的结构域，其特征明显不同于ctld1和cysr。首先，ctld5是第二高发的含表位结构域，具有65.5％的阳性，与对ctld1或其它结构域的阳性无关。因此，具有ctld5分布的患者是最高发的。其次，与cysr一样但与ctld1不同，ctld5阳性遍布于三个抗pla2r1三分位数，表明患者在自身免疫应答成熟过程中的早期阶段可能变成对ctld5阳性。第三，与cysr和ctld1相反，ctld5对抗pla2r1滴度的贡献非常小，如通过竞争elisa所测量。最后，ctld5因其对患者自身抗体的特定反应性而不同于其它含表位结构域，尤其是通过蛋白质印迹对elisa，以及其它免疫学技术。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其他实施方案所使用的“ctld5”胞外区由seq id no4表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no4的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seq id no4的多肽或其变体。
[0144]
先前鉴定为含表位结构域的ctld7被确认为第四个独立的含表位结构域。其阳性发生率和模式与ctld1相当，其中阳性与高滴度相关。然而，与ctld1相反，ctld7对抗pla2r1滴度的贡献是适度的，并且对ctld7的阳性与对ctld1的阳性或对icr或ic1途径的免疫显性无关。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其它实施方案所使用的“ctld7”由seq id no5表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no5的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seq id no5的多肽或其变体。
[0145]
最后，ctld8被鉴定为最c端和含次要表位的结构域。与ctld1和ctld7一样，对ctld8的阳性与高滴度相关，其中ctld8对抗pla2r1滴度的贡献很小。在优选实施方案中，如本文关于根据本发明的任何方法和其它实施方案所使用的“ctld8”由seq id no6表示，并且这是待检测的自身抗体或根据本发明待测定结合水平的序列。在另一个优选实施方案中，seq id no6的变体可用于实施本发明，例如用于设计根据本发明的方法和产物。特别地，提供或使用固定在诊断上有用的载体上的包含seq id no6的多肽或其变体。
[0146]
不希望受理论束缚，本发明人推断，具有最高抗pla2r1滴度的最成熟的体液自身免疫应答可能让人联想到与特定表位的免疫优势相关的表位扩散机制。该机制可以在疾病的明显阶段之前开始，即在mn的阴燃(smoldering)阶段期间，从对疾病的临床体征的自身
免疫应答的早期发作进展数月或甚至数年；并且在明显的疾病过程中可能仍然进展，在缓解和复发阶段自身免疫应答波动。在这种表位扩散机制中，推测自身免疫应答将在cysr结构域上引发，然后将通过分子内表位扩散直到c-末端ctld8结构域而成熟，可能伴随1)cysr和/或ctld1结构域内的域内表位扩散成为两个免疫显性结构域，和2)域间表位向仅携带非免疫显性表位的ctld5、ctld7和ctld8结构域扩散。值得注意的是，对这些结构域的所有反应性似乎是由于构象表位，其中igg4是所有表位的主要igg亚类。
[0147]
抗pla2r1滴度随着阳性表位数的增加而增加，并且只有当cysr或ctld1或两者起免疫显性作用并最大程度地驱动体液自身免疫应答时才能观察到最高滴度。非idom组患者将对应于其中cysr和ctld1都不是免疫显性的(但可能最终在患者的随访期间变得免疫显性)的罕见病例，解释了在那些患者中测量的相对低的抗pla2r1滴度。
[0148]
这些数据提示一旦ctld1变为阳性，免疫显性从免疫显性转变为ctld1，这与表位扩散和滴度的最大自身免疫反应以及疾病活性的恶化相关。此外，针对icr或ic1途径的相应免疫显性可能是由于遗传因素，因为cysr和ctld1结构域上的pla2r1基因多态性与发展pla2r1相关mn的倾向相关。
[0149]
重要的是，所有患者都具有抗cysr自身抗体，但仅有约一半(46.5％)具有抗ctld1自身抗体。此外，所有患者中55％为icr，36％为ic1。这意味着两组之间的“不平衡”，这在病理生理学水平上可能是重要的。对于主要的icr患者组，自身免疫应答主要由抗cysr自身抗体驱动，所述抗cysr自身抗体充当“单一类别”的自身抗体并且将pla2r1靶向为cysr的单一结合结构域。相反，对于ic1患者，自身免疫应答由不同比例的抗cysr和抗ctld1自身抗体驱动，所述抗cysr和抗ctld1自身抗体充当“双重类别”的自身抗体并且将pla2r1靶向两个不同的结合结构域，这可能导致更大的免疫沉积、更多的足细胞损伤和总体增加的致病性。
[0150]
作为测定免疫显性的竞争elisa的替代物的抗ctld1/抗cysr之比的分析
[0151]
作者还显示从患有膜性肾病的患者获得的样品中抗ctld1和抗cysr抗体滴度之比的测量可用作测定患者的免疫显性分布的替代方法(参见图7-9和以下结果)。
[0152]
可以如上所述测量抗ctld1和抗cysr滴度，并计算抗ctld1/抗cysr滴度(或者抗cysr/抗ctld1抗体滴度)之比。
[0153]
关于“通过建立抗ctld1抗体和抗cysr抗体的滴度之比”，在本文中没有进一步精确的情况下，意指该比率可被建立为抗ctld1抗体滴度/抗cysr抗体滴度或抗cysr抗体滴度/抗ctld1抗体滴度。
[0154]
如图7中所示，比率低于中值的大多数患者是icr，而高于中值的大多数患者是ic1，表明如本文所述的评估免疫显性的方法(即竞争elisa和比率分析)之间的良好一致性。
[0155]
该比值可以与参考值进行比较。典型地，当抗ctld1抗体滴度的比率高于抗cysr抗体滴度时，当所述比率高于给定参考值时，可以认为患者对ctld1是免疫显性的(ic1)。如果比率低于给定的参考值，则认为患者对ctld1无免疫显性和对cysr无免疫显性。或者，当抗cysr抗体滴度的比率高于抗ctld1抗体滴度时，当所述比率低于给定参考值时，可以认为患者对ctld1是免疫显性的(ic1)。如果比值高于给定的参考值，则认为患者对ctld1无免疫显性和对cysr无免疫显性。
[0156]
典型地，可以从患有膜性肾病的受试者的参考群体建立参考值，典型地如图7所示
(也参见相应的结果部分)。典型地，可以选择群体的中值比值作为参考值。例如在所选群体中，中值比值为0.0324(参见图7)。如图所示，比率低于中值的患者可被认为对ctld1是免疫显性的(icr)，而比率高于中值的患者可被认为对ctld1是免疫显性的(ic1)。此外，正如从针对含有cysr或ctld1表位的结构域的免疫显性的两种免疫显性途径所预期，抗ctld1/抗cysr滴度比低于或高于中值的患者具有相似的抗pla2r1滴度，表明免疫显性不依赖于全滴度，如通过标准化elisa所测定(图8)。在一些实施方案中，参考值也可以是固定参考值。
[0157]
预测患有膜性肾病的患者的预后的方法
[0158]
现有技术中的多项研究已经证明了测量抗pla2r1滴度以更好地预测临床结果的临床价值，其中低滴度与自发或免疫抑制治疗后达到缓解的更高机会相关，而高滴度与发展至严重疾病和终末期肾病(eskd)的风险增加以及对治疗的耐药性相关(ruggenenti,p,fervenza,fc,remuzzi,g:treatment of membranous nephropathy:time for a paradigm shift.nat rev nephrol,13:563-579,2017)。
[0159]
本发明人先前证明了基于针对含有单个(cysr)或多个(cysr和ctld1和/或ctld7)表位的结构域的表位阳性的患者分布也可有助于更好地预测临床结果并指导有效治疗(wo2017/009245)。实际上，已经证明抗pla2r1的cysr和ctld1和/或ctld7结构域的自身抗体的存在与建立疾病的差的预后有关。相反，呈现仅抗pla2r1的cysr结构域的自身抗体的患者具有良好的预后。
[0160]
在本发明中，已经建立了pla2r1相关mn患者的回顾性但充分表征的队列，其中约一半患者用保守疗法(niat，43％)治疗，另一半用免疫抑制剂利妥昔单抗(43％)治疗。
[0161]
本发明人并行测试了抗pla2r1滴度和免疫显性是否可用作临床结果的预测因子。
[0162]
本发明人证明，对定义三组(icr、非idom和ic1)或两组(icr/非idom对ic1)患者的免疫显性的考虑表明免疫显性可以预测临床结果。
[0163]
与现有技术相比，本发明及其相关方法(竞争测定和滴度比分析)更准确和精确，并且可以有利地避免假阳性和/或阴性。
[0164]
发明人证明免疫显性可通过竞争测定或通过分析测量的抗ctld1与抗cysr滴度的比率来评估。本文包括的结果提供了以下证据，即免疫显性的评估(通过竞争测定或通过分析ctld1与cysr(或相反)抗体滴度比)更准确地预测临床结果。
[0165]
因此，在第二方面，本发明涉及预测患有膜性肾病的患者的预后的方法，其包括根据上述方法测定从所述患者获得的样品中的pla2r1免疫显性，其中：
[0166]-对ctld1免疫显性的患者表现出差的预后；
[0167]-对ctld1非免疫显性(典型地对cysr免疫显性和/或如果通过竞争测定评估免疫显性，则非免疫显性)的患者表现出良好的预后。
[0168]
本发明人确实鉴定，相比ic1，达到缓解的患者更通常是icr(和/或非idom)，证明免疫显性是临床结果的新预测因素。已经证明ic1患者达到缓解的机会比icr(和/或非idom患者)低约3倍。
[0169]
与现有技术中描述的方法(典型地是完全抗pla2r1滴度并通过表位阳性进行表征)相比，根据本发明的基于免疫显性测定(通过竞争测定或通过测量抗ctld1抗体滴度与抗cysr抗体滴度(或相反)的比率)的方法允许更准确地对患者进行分级(参见图6-9)。滴度、表位分布和针对icr和ic1途径的免疫显性之间的关系如图2和3所示。根据本发明的免
疫显性分布的测定允许有差别地和更准确地区分这些患者。
[0170]
在我们的研究队列中，表现出差的预后的ic1患者中的抗pla2r1滴度在7.5-1183ru/ml变化，如通过标准化elisa所测量(图5)。应当注意的是，抗pla2r1滴度典型地可以使用标准化和商业上可获得的euroimmun来测量(medizinische labordiagnostika ag,l
ü
beck,germany)standard tests,as also detailed in dahnrich c,komorowski l,probst c,seitz-polski b,esnault v,wetzels jf,hofstra jm,hoxha e,stahl ra,lambeau g,et al.“development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy.clin chim acta.2013；421c(213-8)”。此外，抗ctld1滴度在约10-1500ru/ml变化(内部elisa，图5)，这意味着单独的抗pla2r1滴度和抗ctld1滴度都不足以准确地对患者进行分类。实际上，具有低抗pla2r1滴度的患者可表现出差的预后、良好预后或中等预后。此外，非idom和icr患者具有相似的中值抗pla2r1滴度(分别为59.7和56.5ru/ml)。抗pla2r1滴度不允许准确区分具有良好、差、较好或较差临床结果的那些患者，特别是低、中或高滴度范围窄但具有可变临床结果或对治疗的应答的患者(参见下文和图6)。
[0171]
此外，在现有技术中，已经证明具有抗ctld1和/或ctld7结构域的自身抗体的患者(也称为表位分布或表位扩散)具有差的预后。相反，具有仅抗cysr结构域的自身抗体的患者具有良好的预后。
[0172]
因此，当考虑表位分布或表位扩散时，呈现仅抗pla2r1的cysr结构域的自身抗体的患者(也称为“非扩散”患者)具有良好的预后，而呈现抗pla2r1的ctld1和/或ctld7结构域的自身抗体的患者(也称为“扩散”患者)具有差的预后。
[0173]
然而，这种基于表位分布或扩散的分层可能导致预测临床结果和对治疗的应答的假阳性和假阴性情况。
[0174]
利用基于免疫显性分布的本方法，本发明人证明具有抗ctld1自身抗体但未分类为对ctld1的免疫显性(即ic1)的患者(其先前已被表征为预后差的扩散者)现在可被分类为预后良好的icr(和/或非idom，当通过竞争测定评估免疫显性时)患者。
[0175]
类似地，具有抗cysr以外的抗pla2r1抗体(包括例如抗ctld7)的患者之前将被分类为预后差的扩散者，但现在可以被分类为icr(和/或任选地非idom，如果通过竞争测定评估免疫显性)，其具有比扩散者或ic1患者更好的预后。
[0176]
因此，根据本发明的分层的新方法不对应于仅测定pla2r1免疫显性分布，但有利地允许更准确地分类患有膜性肾病的患者并避免假阳性(具有抗ctld1自身抗体或抗cysr以外的自身抗体的患者)和假阴性(仅显示抗cysr自身抗体的患者)。
[0177]
本文所用的表述“预后”是指预测受试者中膜性肾病，优选pla2r1相关的肾病的病程或结果。这不是指以100％的准确度预测病症的病程或结果的能力，或者甚至是基于生物标志物的模式可预测地或多或少可能发生给定的病程或结果的能力。相反，本领域技术人员将理解表述“预后”是指特定病程或结果将发生的增加的可能性。
[0178]
在本发明的上下文中，“良好预后”是指更好的预后，并且是指自发或通过用免疫抑制剂治疗诱导的更高的缓解机会，和/或优选地更低的需要血液透析的风险和/或更低的发生肾衰竭的风险。
[0179]
因此，如果适当治疗，根据本发明的方法被认为具有良好预后的患者将不需要血液透析。此外，所述受试者不需要进行更积极的免疫抑制治疗。典型地，“自发缓解”定义为由无免疫抑制治疗的对症治疗(例如使用ras阻断剂和利尿剂，也称为niat治疗)诱导的缓解。
[0180]
在本发明的上下文中，“差的预后”是指随后肾并发症发作的更高机会，例如可能导致终末期肾衰竭(eskd)的持续活动性mn疾病。
[0181]
差的预后典型地与以下有关：
[0182]-增加的蛋白尿，典型地蛋白尿》3.5g/g；和/或
[0183]-血清肌酐升高超过30％；和/或
[0184]-估算的肾小球滤过率(egfr)《45ml/min/1.73m2。
[0185]
egfr用于筛选和检测早期肾损伤并监测肾状态。通过进行肌酸酐测试并计算估算的肾小球滤过率来进行。
[0186]
典型地，根据本发明的方法被认为具有差的预后的受试者可能需要用有效剂量的一线免疫抑制剂(如利妥昔单抗)的重复治疗，或将需要用更强和更有效的免疫抑制剂(如环磷酰胺)的替代疗法或组合疗法，或将需要血液透析。
[0187]
预测患有膜性肾病和对免疫抑制治疗的耐药性的患者的预后的方法
[0188]
当组合免疫显性和治疗时，与niat治疗的患者相比，用免疫抑制剂(如利妥昔单抗)治疗的icr(和/或在通过竞争测定评估免疫显性的情况下任选的非idom患者)达到缓解的机会多约3倍。此外，用免疫抑制剂(如利妥昔单抗)治疗的icr(和/或非idom)患者进入缓解的机会比也用免疫抑制剂(如利妥昔单抗)治疗的ic1患者多4.5倍。
[0189]
因此，在第三方面，本发明涉及预测患有膜性肾病的患者对免疫抑制剂(如利妥昔单抗)的应答的方法，其包括根据前述方法测定从所述患者获得的样品中的pla2r1免疫显性，其中：
[0190]-对ctld1免疫显性的患者(ic1患者)对免疫抑制剂耐药；
[0191]-对ctld1非免疫显性的患者(即对cysr免疫显性或任选地当通过竞争测定评估免疫显性时的非免疫显性)是对免疫抑制剂的良好应答者；
[0192]
目前对膜性肾病的治疗包括基于ras阻断剂和利尿剂的对症保守治疗和/或使用各种类型的免疫抑制剂的免疫抑制治疗，其中基于功效对比次要副作用，利妥昔单抗表现为优选的一线治疗。
[0193]
典型地，约三分之二的患者会发展成严重的膜性肾病，并需要免疫抑制治疗。所述免疫抑制治疗典型地基于施用至少一种选自但不限于以下的化合物：环孢菌素、他克莫司、硫唑嘌呤、英夫利昔单抗、奥马珠单抗、达克珠单抗、阿达木单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、雷帕霉素、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、利妥昔单抗、达拉珠单抗、艾沙妥昔单抗和硼替佐米。
[0194]
优选地，特发性膜性肾病的治疗基于使用利妥昔单抗、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、他克莫司。
[0195]
对症治疗典型地基于用ras阻断剂(肾素-血管紧张素系统的抑制剂)和利尿剂的阻断。
[0196]
本发明还提供了一种方法，医生可以通过该方法预测接受治疗的患者的应答，特
别是对免疫抑制剂(如利妥昔单抗)的应答。
[0197]
在本发明的上下文中，当患者对免疫抑制剂(如利妥昔单抗)的治疗更耐药时，患者被认为是“对治疗耐药”，这表现为在随访期间和施用免疫抑制剂后临床参数没有改进或恶化。
[0198]
在本发明的上下文中，当患者对免疫抑制剂(如利妥昔单抗)的治疗有应答或是更好的应答者时，患者被认为是“对治疗的良好应答者”，这通过在随访期间和施用免疫抑制剂后临床参数的改进来显示。这可能是指发生肾衰竭的风险较低和/或需要血液透析的风险较低。其也可指将临床参数完全或部分恢复至正常范围的患者，包括蛋白尿和/或血清肌酸酐和/或估算的肾小球滤过率(egfr)。
[0199]
典型地，当患者被认为对免疫抑制剂耐药时，必须修饰免疫抑制剂。典型地，可以施用更高剂量的免疫抑制剂或重复治疗，或替代或组合治疗或更具攻击性的免疫抑制剂，或必须开始血液透析。
[0200]
典型地，当患者被认为是免疫抑制剂的良好应答者时，必须维持免疫抑制剂直到缓解(完全或部分缓解)或可以施用对症治疗。
[0201]
在一个优选实施方案中，免疫抑制剂是利妥昔单抗。
[0202]
在另一个优选实施方案中，预测患有膜性肾病的患者对免疫抑制剂的应答的方法包括测定抗pla2r1滴度的进一步的步骤。
[0203]
因此，在另一个实施方案中，预测患有膜性肾病的患者对免疫抑制剂的应答的方法包括测量生物样品中抗pla2r1的自身抗体水平的进一步的步骤。
[0204]
测量生物样品中自身抗体水平的方法可以通过使用标准免疫诊断技术来测量，包括免疫测定，诸如竞争、直接反应或夹心型测定。此类测定包括但不限于凝集试验；酶标志物和酶介导的免疫测定，如elisa；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀。反应通常包括显示标记，如荧光、化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或其它检测抗原和抗体或与其反应的抗体之间复合物形成的方法。
[0205]
在优选的实施方案中，通过elisa进行测量抗pla2r1的自身抗体水平的步骤。
[0206]
在优选实施方案中，抗pla2r1滴度通过标准化elisa(euroimmun medizinische labordiagnostika ag,l
ü
beck,germany,as also detailed in dahnrich c,komorowski l,probst c,seitz-polski b,esnault v,wetzels jf,hofstra jm,hoxha e,stahl ra,lambeau g,et al.“development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy.clin chim acta.2013；421c(213-8)”)来测量，并且低于300ru/ml，优选低于250ru/ml，优选低于225ru/ml，低于200ru/ml，低于150ru/ml或低于100ru/ml。
[0207]
在另一个优选实施方案中，抗pla2r1滴度低于200ru/ml。
[0208]
实际上，发明人强调对利妥昔单抗最佳应答的患者是抗pla2r1滴度低于200ru/ml的患者。
[0209]
抗pla2r1滴度(即通过选择滴度低于200ru/ml的患者)和免疫显性的组合评价有助于改进对治疗的应答的可能性，其中免疫显性鉴定对利妥昔单抗最佳应答的患者(icr/非idom，对治疗的良好应答者)与那些弱应答的患者(ic1患者，对治疗耐药)。
[0210]
具体而言，当考虑总体临床结果或利妥昔单抗治疗后的结果时，低于200ru/ml，
icr(和/或任选非idom患者)的临床缓解百分比高于ic1患者(图6e)。当通过抗体滴度比评估免疫显性时，本发明人还证明当考虑整体临床结果或利妥昔单抗治疗后的结果时，抗ctld1/抗cysr之比低于中值的患者比高于中值的患者更经常处于临床缓解中(图9b)。
[0211]
这表明低于抗pla2r1滴度的某一截止值，免疫显性对于指导治疗和鉴定患者为利妥昔单抗的应答者与非应答者非常有用。
[0212]
类似地，当考虑到总体临床结果或利妥昔单抗治疗后的结果时，抗ctld1/抗cysr之比低于中值的患者比高于中值的患者更经常处于临床缓解中，典型地，当患者被认为耐利妥昔单抗时(ic1患者)，并且抗pla2r1滴度低于300ru/ml，显著低于250ru/ml，低于200ru/ml，或甚至低于150ru/ml时，患者将需要较高剂量的利妥昔单抗，或重复治疗，或与作为实例列出但不限于血液透析的上述免疫抑制剂之一的替代或组合治疗。
[0213]
典型地，当患者被认为是对利妥昔单抗的良好应答者时(icr和任选的非idom患者，当通过竞争测定评估免疫显性时)，将施用标准化剂量的利妥昔单抗并发现是有效的。
[0214]
典型地，当患者具有高于300ru/ml，特别是高于250ru/ml或高于200ru/ml的抗pla2r1滴度时，利妥昔单抗治疗可能不太有效并且不依赖于免疫显性的类型，需要更高的利妥昔单抗剂量或重复治疗，或优选如上所述的替代或组合免疫抑制治疗。典型地，可以施用环磷酰胺。
[0215]
用于治疗膜性肾病的方法
[0216]
在第四方面，本发明涉及用于在有需要的受试者中治疗膜性肾病的方法，其包括：
[0217]-测定从患有膜性肾病的患者获得的样品中pla2r1免疫显性，其包括根据上述任何方法(即竞争测定或滴度比)或根据本发明用于测定免疫显性的其它方法测定所述样品中主要驱动体液应答的抗体的性质的步骤，
[0218]
和
[0219]-当所述患者对cysr是免疫显性的或是非免疫显性的并且因此被认为是对症治疗或免疫抑制剂的良好应答者时，向所述患者施用有效量的免疫抑制剂或有效量的对症治疗；
[0220]-重复有效量的免疫抑制剂或向所述患者施用有效量的替代或组合的更强的免疫抑制疗法，或当所述患者对ctld1是免疫显性的并因此对免疫抑制剂耐药时，开始血液透析；
[0221]
在一些实施方案中，所述方法包括选择抗pla2r1滴度低于300ru/ml，显著低于250ru/ml，低于200ru/ml或甚至低于150ru/ml的患者的步骤。
[0222]
免疫抑制剂的“有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗膜性肾病的量。然而，应当理解，免疫抑制剂的总每日用量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于有需要的任何特定受试者的具体治疗有效剂量取决于多种因素，包括膜性肾病的临床和组织病理学阶段、采用的免疫抑制剂的活性、pla2r1免疫显性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、治疗持续时间；与医学领域和临床实践中熟知的等因素组合或同时使用的药物，包括共病和相关疾病，如癌症和感染或其它自身免疫疾病。例如，本领域技术人员公知的是，以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。
[0223]
术语“治疗”或“治疗方法”或其等同物并非旨在作为绝对术语，并且当应用于例如
膜性肾病时，是指旨在减少或消除或减轻膜性肾病的一种或多种症状的程序或行动方案。
[0224]
通常，膜性肾病的“治疗”或“治疗方法”将以低的成功可能性进行，但仍然被认为诱导总体有益效果。膜性肾病的治疗是指例如延迟发作、降低一种或多种症状的频率或降低与病症相关的一种或多种症状的严重性。在一些情况下，一种或多种症状的频率和严重程度降低至非病理水平。更特别地，术语膜性肾病的“治疗”或“治疗方法”是指改进受试者的临床行为或生物学标准，包括膜性肾病的部分或完全缓解的任何临床体征(蛋白尿、血清肌酸酐水平、egfr等)。
[0225]
典型地，治疗或治疗方法可指需要血液透析的较低风险和/或发生肾衰竭的较低风险。它还可以指受试者不需要更强但更具攻击性的免疫抑制剂的事实。它还可以指蛋白尿和/或血清肌酸酐的标准化或降低的水平或估算的肾小球滤过率(egfr)的标准化或增加的水平。
[0226]
因此，本发明人证明免疫显性本身可用作生物标志物，也可用作另外的临床生物标志物，其可与抗pla2r1滴度组合以帮助改进临床结果和对治疗应答的可能性。
[0227]
特别地，根据免疫显性对患者进行分层可用于指导和优化使用不同的利妥昔单抗方案的治疗，以获得对治疗应答的更好的可能性。
[0228]
从病理生理学的观点来看，ic1患者与icr/非idom患者的区别在于在cysr和ctld1结构域上都表现出两类主要的靶向pla2r1的免疫显性自身抗体。
[0229]
ic1患者的免疫显性分布可能由不同的遗传背景和/或更晚期的自身免疫应答引起，可能与更严重的足细胞损伤和更大的免疫沉积物以及对免疫抑制治疗更加耐药相关。
[0230]
通过以下实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
具体实施方式
[0231]
在以下实施例中，两个主要目的是i)提供抗pla2r1体液应答的全面分析，重点在于解剖来自142名pla2r1相关mn患者的大型回顾性队列的由循环自身抗体识别的含有构象pla2r1表位的结构域(实施例1和2)；和ii)评估如何将在患者中观察到的个体抗pla2r1应答的具体特征转化至临床以预测临床结果和对治疗的应答(实施例3)。
[0232]
方法
[0233]
患者－通过纳入几个法国肾病科的患者，使用活检证实的原发性mn建立了142名患者的队列。所有纳入患者在基线血清取样前12个月内未用免疫抑制剂治疗。从肾活检收集基线血清样品，其中中位时间为5个月(iqr 0-10个月)。根据慢性肾病流行病学协作(ckd-epi)公式计算egfr。最后一次随访的中位时间为采样后26个月(iqr 23-58个月)。根据2012kdigo建议，在一线治疗(niat(保守治疗)或免疫抑制剂(给予大多数患者利妥昔单抗，整个队列的43％))后分析临床结局，其中中位随访时间为基线采样后12个月(iqr：6-22个月)。部分缓解定义为蛋白尿低于3.5g/天且低于基线值的50％，伴随增加或恢复正常白蛋白血症和稳定的肌酸酐血症。完全缓解定义为蛋白尿低于0.5g/天，血白蛋白和肌酐血症正常。如果在随访期间没有施用免疫抑制药物，则认为缓解是自发的。临床活动性疾病定义为与不存在任何其它原因的基线相比，蛋白尿高于3.5g/天和/或血清肌酸酐增加超过30％。本研究由机构审查委员会批准，并根据赫尔辛基宣言的原则进行。从所有参与者获得
书面知情同意书。
[0234]
pla2r1突变体和pla2r1-mrc2膜结合嵌合体的产生和表达
[0235]
下文提及的所有pla2r1结构域和片段均参照完整的人pla2r1蛋白序列(参照uniprot q13018，如seq id no19所示)来定义。通过pcr产生所有可溶性和膜结合的pla2r1突变体以及嵌合体，并将其克隆到pcdna3.1/zeo(
–
)表达载体中(life technologies,carlsbad,usa)。使用phusion定点诱变试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,usa)产生可溶性和膜结合的pla2r1构建体。基本上如所述(mathieu,j,alvarez,e,alvarez,pj:recombination-assisted megaprimer(ram)cloning.methodsx,1:23-29,2014)，使用重组辅助大引物克隆产生mrc2(uniprot q9ubg0)和pla2r1之间的膜结合和可溶性嵌合体。
[0236]
基于kao等的先前工作(kao l,lam v,waldman m,glassock rj,and zhu q.identification of the immunodominant epitope region in phospholipase a2 receptor-mediating autoantibody binding in idiopathic membranous nephropathy.j am soc nephrol.2015；26(2):291-301)，设计了一系列含有pla2r1的cysr-fnii-ctld1三重结构域的构建体(q36至n359－构建体a至g，d除外)，其具有和不具有各种蛋白酶切割位点。seq id no17显示为这些构建体的代表性实例。构建体包含pla2r1信号肽(m1至a20)，其后是其n-末端接头序列(e21至w35)，n-末端6xhis和3xflag标签，具有或不具有蛋白酶切割位点的三联pla2r1结构域和c-末端ha-标签(除了仅ha-标记的构建体f)。如下在不同的氨基酸位置引入蛋白酶切割位点：构建体a，无蛋白酶切割位点；构建体b，在cysr和fnii之间插入凝血酶切割位点(lvprgs)(将氨基酸l166替换为g171)；构建体c，ctld1的第一个二硫键内的凝血酶切割位点(将氨基酸t231替换为d236)；构建体d，与构建体c相同，但在fnii和ctld1之间的接头区域内具有额外的因子xa切割位点(iegr)(将氨基酸t223替换为e226)；构建体e，在fnii和ctld1之间的接头区域内仅因子xa切割位点(iegr)(将氨基酸t223替换为e226)；构建体f，在fnii和ctld1之间(在d221和p222之间)的接头区域中插入延伸的tev蛋白酶切割位点(glenlyfqg)，从而延伸两个结构域之间的区域；构建体g，在fnii和ctld1之间插入接头区域中的凝血酶切割位点(t223至s224)，从而延伸两个结构域之间的区域。对于构建体d，设计了人密码子优化的合成基因(genecust，dudelange，luxembourg)。合成基因包含人iia组分泌型磷脂酶a2的信号肽(m1至n20，uniprot p14555)，其已表明驱动多种蛋白质(valentin,e,ghomashchi,f,gelb,mh,lazdunski,m,lambeau,g:on the diversity of secreted phospholipases a2.cloning,tissue distribution,and functional expression of two novel mouse group ii enzymes.j biol chem,274:31195-31202,1999)，随后是pla2r1的n-末端接头序列(e21至w35)、n-末端6xhis和3xflag标签、具有因子xa和凝血酶切割位点的三结构域cysr-fnii-ctld1(q36至h377)和c-末端ha标签。
[0237]
所有其它可溶性和膜结合的pla2r1构建体是指完整的人pla2r1蛋白序列(参考uniprot q13018，如seq id no19所示)，并且包含pla2r1信号肽(m1至a20)，随后是其n-末端接头序列(e21至w35)和编码不同pla2r1重组蛋白的人pla2r1序列：可溶性pla2r1(q36至s1397，全细胞外结构域)，ctld2-8(c2-c8:y-357to s1397),ctld2-6(c2-c6:y357 to p1114),ctld3-5(c3-c5:v507至s979),ctld6-8(c6-c8:k947至s1397),ctld6-7(c6-c7:k947至l1246)1,ctld7-8(c7-c8:e1097至s1397),cysr(cr:q36至k164),fnii(h163至
g228),ctld1(c1:p222至a375),ctld2(c2:h360至e512),ctld3(c3:v507至f661),ctld4(c4:n649至w809),ctld5(c5:k797至t957),ctld6(c6:k947至p1114),ctld7(c7:e1097至l1246),ctld8(c8:p1235至s1397),δ7(p1235至q1463,膜结合ctld8)。所有重组蛋白都是c-末端ha标签的(ypydvpdya)。可溶性pla2r1、cr、fnii、c1、c2、c3、c4、c5、c8和δ7构建体也是n-末端3x-flag标签的(dykddddk)；可溶性pla2r1、cr、fnii、c1、c2、c3、c4和c5也是n-末端6x-his标签的。seq id no10至no16和no18显示为具有标签的pla2r1的可溶性和膜结合片段的上述构建体的代表性实例。
[0238]
pla2r1/mrc2嵌合体在膜结合的成熟mrc2蛋白的可读框中产生(g31至e1479)。mrc2的cysr或ctld1结构域被pla2r1的相应结构域取代(cysr的e21至h167和ctld1的d221至h377)。通过用来自pla2r1的相应结构域(分别为w943至d1111和t1102至p1244)替换ctld6或ctld7来构建来自mrc2(t956至h1258)的ctld6-ctld7区域的可溶性嵌合体。所有构建体均在具有pla2r1信号肽的pcdna3.1/zeo(
–
)表达载体中制备，并且是c-末端ha标签的和n-末端6xhis-和3xflag-标签的。
[0239]
测序所有cdna构建体后，使用自制磷酸钙转染试剂盒(seitz-polski,b,dolla,g,payre,c,girard,ca,polidori,j,zorzi,k,birgy-barelli,e,jullien,p,courivaud,c,krummel,t,benzaken,s,bernard,g,burtey,s,mariat,c,esnault,vl,lambeau,g:epitope spreading of autoantibody response to pla2r associates with poor prognosis in membranous nephropathy.j am soc nephrol,27:1517-1533,2016).or exgen(biomol gmbh,hamburg,germany)将表达质粒转染入hek293细胞。将hek293细胞在含有1％青霉素/链霉素溶液和10％热灭活fbs(全部来自gibco，waltham，usa)的dmem培养基中在37℃下在5％co2的潮湿气氛中培养。用0.2mg/ml zeocin(invivogen,san diego,usa)选择转染的细胞。对于重组蛋白的大规模生产，将稳定选择的单个克隆或混合群体在完全培养基中在37℃下培养至亚汇合，然后转换至无血清培养基(optimem)并在37℃下孵育。对于在37℃下具有低表达的pla2r1构建体，使细胞在30℃下在有或无牛磺熊去氧胆酸(tudca,sigma-aldrich,st.louis,usa)或4-苯基丁酸(pba,sigma-aldrich,st.louis,usa)下生长以增强重组蛋白的表达、运输和/或折叠，如先前针对各种突变蛋白所述。表达7天后，收集细胞培养基，用pbs洗涤细胞，弃去并在20mm tris ph 7.4,2mm edta和蛋白酶抑制剂混合物(roche diagnosis,basel,swizterland)中裂解。将细胞超声处理并在4℃下在微量离心设备中以14,000rpm离心5分钟。收集对应于胞质部分(cf)的上清液，并将沉淀重悬并溶解在50mm tris ph 7.4,2mm edta,100mm nacl,1％triton x-100,0.5％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂中。将悬浮液超声处理，在4℃下在旋转下孵育1小时并在4℃下以14,000rpm离心15分钟。回收对应于溶解级分(sf)的上清液。通过bca蛋白测定(thermo fisher scientific,waltham,usa)测定各级分的总蛋白浓度。当重组蛋白以非常低的水平表达时，使用标准方案用三氯乙酸(tca)沉淀培养基或根据制造商的方案(roche,basel,switzerland)通过亲和层析在完整的his-tag珠上纯化培养基。使用装有ym-30膜的centricon离心过滤装置(amicon,millipore,bedford,usa)，将洗脱的纯化蛋白浓缩并用fxa缓冲液(50mm tris ph 8.0,1mm cacl2,10mm nacl)和5mm n-十二烷基-n-n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(sb12)进行缓冲液交换。
[0240]
三重结构域cysr-fnii-ctld1构建体的蛋白酶消化
[0241]
根据购买者的建议，在37℃下用凝血酶(thr,calbiochem,san diego,usa)、因子xa(f
xa
,amersham biosciences,uk)或烟草蚀刻病毒(tev,sigma-aldrich,st.louis,usa)蛋白酶消化从构建体b至g纯化的蛋白质或培养基过夜。通过wb免疫检测切割产物。
[0242]
pla2r1重组蛋白的免疫检测
[0243]
如laemmli(laemmli,uk:cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.nature,227:680-685,1970)最初所描述，将重组蛋白在还原或非还原条件下在sds-page凝胶上运行。在半干燥条件(25mmtris，192mm甘氨酸，ph8.5，20％乙醇)下，使用trans-blot turbo(bio-rad laboratories,hercules,usa)，在25v常量下，将蛋白质转移到甲醇浸泡的聚二氟乙烯膜(perkinelmer,waltham,usa)中30分钟。将含有目标蛋白的培养基在硝酸纤维素膜(whatman，maidstino，uk)上进行狭缝印迹。对于蛋白质印迹和狭缝印迹两者，用5％(w/v)低脂干乳在pbs-吐温0.05％中在4℃下阻断非特异性结合一小时或过夜。然后，将膜与一抗在4℃下搅拌孵育2小时或过夜。洗涤三次，每次5分钟后，将膜与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的第二抗体在搅拌下孵育1小时。将膜洗涤3次，共5分钟，并用增强化学发光底物(ecl,perkinelmer,waltham,usa)和fusion-fx数字成像仪检测免疫反应带。
[0244]
含pla2r1表位的结构域的免疫沉淀
[0245]
在4℃下将目标蛋白质从具有mn患者血清的细胞培养基中拉下过夜，随后在4℃下与抗igg4亲和珠(thermo fisher scientific,waltham,usa)孵育1小时。用tris缓冲盐水(tbs :20mm tris/hcl ph 7.2,150mm nacl,5mm cacl2)洗涤三次并在微量离心机中以14,000rpm在4℃下离心15分钟后，将结合的蛋白质用2x laemmli缓冲液洗脱并通过wb分析。
[0246]
pla2r1重组蛋白的免疫印迹－通过wb在还原或非还原条件下或通过斑点印迹分析重组蛋白。将第一抗体(小鼠单克隆抗ha抗体(1:5,000,sigma-aldrich,st.louis,usa)、小鼠单克隆抗flag抗体(1:1,000,sigma-aldrich,st.louis,usa)和mn患者血清(1:100，除非另有说明)全部稀释在pbs-吐温0.05％中的0.5％低脂牛奶中，而将第二抗体(抗小鼠抗体(1:20,000,cambridge,uk)和抗人igg4(1:7,500,southern biotech,birmingham,usa)稀释在pbs-吐温0.05％中。
[0247]
elisa测定－对于基于ha的抗原捕获elisa测定，在4℃下用稀释于20mm tris ph 8.0中的抗ha抗体(1:5,000,sigma-aldrich,st.louis,usa)包被96孔微板(thermo fisher scientific,waltham,usa)过夜。将平板用seramunblock(seramun diagnostica gmbh,heidesee,germany)封闭2小时，然后用0.05％pbs-tween洗涤。通过孵育2小时捕获ha标签的pla2r1抗原(在pbs中稀释的10-100μl细胞培养基)，然后洗涤。将稀释在含0.1％(m/v)低脂干乳的pbs中的患者血清添加到孔中并孵育2小时。然后，将平板洗涤，并与在seramunstab st(seramun diagnostica gmbh,heidesee,germany)中稀释的抗人igg4辣根过氧化物酶(hrp)缀合的第二抗体(1:7,500,southern biotech,birmingham,usa)孵育1小时。洗涤三次后，添加四甲基联苯胺过氧化物酶底物(tmb,interchim,france)并显色15分钟，然后用1.2n hcl终止反应。使用multiskan fc读板器(thermo scientific,waltham,usa)在450nm读取光密度(od)。将来自模拟转染的hek293细胞的无血清培养基用作每个患者的阴性对照，提供单独的背景。测定的截止od值为每个个体患者背景值的两倍。
[0248]
通过进行添加标准曲线的elisa测定完整pla2r1、cysr和ctld1结构域的自身抗体滴度。标准曲线由7种高度pla2r1-、cysr-或ctld1-阳性血清的稀释液组成，允许使用5-参数逻辑曲线(graphpad prism 7software,san diego,usa)将光密度转化为ru/ml。还使用来自euroimmun的商业标准化elisa(medizinischelabordiagnostika ag,l
ü
beck,germany,dahnrich,c,komorowski,l,probst,c,seitz-polski,b,esnault,v,wetzels,jf,hofstra,jm,hoxha,e,stahl,ra,lambeau,g,stocker,w,schlumberger,w:development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy.clin chim acta,421c:213-218,2013)用抗总igg测量抗pla2r1滴度。
[0249]
对于elisa竞争测定，将微板(thermo fisher scientific,waltham,usa)在4℃用纯化的pla2r1的全细胞外结构域(在20mm tris ph 8.0中稀释10ng)包被过夜，所述纯化的pla2r1的全细胞外结构域表达为如所述(dahnrich,c,komorowski,l,probst,c,seitz-polski,b,esnault,v,wetzels,jf,hofstra,jm,hoxha,e,stahl,ra,lambeau,g,stocker,w,schlumberger,w:development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy.clin chim acta,421c:213-218,2013)来自hek293细胞的重组分泌蛋白，然后用seramunblock(seramun diagnostica gmbh,heidesee,germany)封闭2小时并用0.05％pbs-tween洗涤。将患者血清与含有饱和量的不同重组蛋白(pla2r1,cysr-fnii-ctld1,cysr,ctld1,ctld5,ctld7,cysr ctld2-8,ctld1 ctld2-8，或模拟物作为阴性对照)的细胞培养基预孵育30分钟，然后添加到包被有全pla2r1抗原的孔中并孵育2小时。进行初步剂量-反应实验以测定适当的患者血清稀释度以及足以确保每种重组蛋白完全竞争的细胞培养基体积(数据未显示)。然后，将平板洗涤，与第二抗体孵育，并如上所述显示。考虑到个体患者的非特异性信号，将竞争测定的结果表示为在不存在竞争剂的情况下测量的最大信号的百分比。
[0250]
当与cysr-fnii-ctld1的竞争高于65％而与ctld1的竞争低于20％时，将患者分类为对cysr(icr)免疫显性。当与cysr-fnii-ctld1的竞争高于65％而与ctld1的竞争高于20％时，将患者分类为对ctld1(ic1)免疫显性。当与cysr-fnii-ctld1的竞争低于65％而与任何单个结构域的竞争太低以至于不能确定任何特异性免疫显性时，将患者分类为非免疫显性(非idom)，这意味着没有特异性结构域驱动体液自身免疫应答的信号。对于142名患者中的17名，血清不能用于进行竞争测定。其中，11名仅对cysr结构域呈阳性，并被指定为icr。最后6名患者对cysr和其它含表位的结构域呈阳性，并且不能确定免疫显性分布。这6名患者被排除在免疫显性分析之外。
[0251]
统计分析－将患者特征以定性变量的频率和百分比以及连续变量的中值和四分位数表示。采用wilcoxon-mann-whitney或kruskal-wallis秩检验来评价连续变量与定性变量之间的关系；定性变量的pearson卡方或fisher精确检验和连续变量的spearman秩相关。使用逻辑回归进行未调整和调整的分析。多变量分析的变量选择基于0.20的阈值。由于年龄、性别和血清肌酐相关，我们选择在多变量分析中使用egfr。还根据中值水平和治疗调整蛋白尿、抗pla2r1滴度的治疗和多变量分析。分别根据中值水平或免疫显性结合治疗和抗pla2r1滴度构建两个变量，并用于第二模型以评估与治疗的相互作用。数据在没有egfr、
末端遍布整个胞外区。有趣的是，发现所有表位都是构象的，包括ctld5和ctld8中存在的新表位。下一个问题是用标准化elisa测定的5个含表位结构域相对于抗pla2r1滴度的发生率和免疫显性特性。
[0263]
cysr和ctld5是最高发的含表位结构域。
[0264]
为了确定哪些含表位的结构域是最高发的，本发明人通过elisa针对10个单一pla2r1结构域筛选了142个pla2r1阳性mn患者的回顾性队列。如所预期，5个含表位的结构域以不同的发生率被识别(图1a)。其它单结构域，即fnii、ctld2、ctld3、ctld4和ctld6均未被识别。cysr被所有患者识别(图1a)，从而表现为最高发的含表位结构域。有趣的是，ctld5是第二高发的结构域，具有65.5％的反应性，其次是ctld1(46.5％)、ctld7(36.6％)和ctld8(3.5％)(图1a)。基于合并的发生率，可以将患者分成不同的表位分布，其中crc5是最丰富的(图1b)。
[0265]
表位正性随抗pla2r1滴定度增加
[0266]
为了分析队列中表位阳性和抗pla2r1滴度之间的关系，通过用标准化elisa(dahnrich c,komorowski l,probst c,seitz-polski b,esnault v,wetzels jf,hofstra jm,hoxha e,stahl ra,lambeau g,et al.development of a standardized elisa for the determination of autoantibodies against human m-type phospholipase a2 receptor in primary membranous nephropathy.clin chim acta.2013；421c(213-8.))测量的滴度对患者进行分级，并绘制每个包含表位的结构域的阳性率(图2a)。虽然所有患者都对cysr呈阳性，但ctld5阳性患者分布在抗pla2r1滴度的全部范围内。相反，ctld1阳性患者在高滴度下更多存在，即使一些患者存在于第一三分位数中。ctld7阳性患者在抗pla2r1滴度的第二和第三三分位数中也更丰富，而罕见的ctld8阳性患者仅在中等至高滴度时发现。总之，抗pla2r1滴度随着含阳性表位的结构域的数目的增加而增加。最后，当通过表位发生率和其表位分布的复杂性对患者进行分级，同时考虑对ctld1是否为阳性时，观察到表位分布的复杂性与抗pla2r1滴度增加之间的关系(图2b)。
[0267]
cysr和ctld1是含有免疫显性表位的结构域
[0268]
除发生率之外，本发明人的目的是确定哪些pla2r1结构域含有主要的免疫显性表位，所述表位将贡献通过elisa对完整pla2r1抗原测量的大部分信号。为此，开发了作为靶抗原的完整pla2r1(完整胞外区)和作为竞争剂的各种pla2r1重组蛋白(pla2r1、cysr-fnii-ctld1、cysr、ctld1、ctld5、ctld7、cysr和ctld2-8的混合物，以及ctld1和ctld2-8的混合物)之间的竞争elisa测定。在这些实验中，将患者的血清首先与过量的竞争剂预孵育，然后针对全pla2r1抗原测试以测量剩余的抗pla2r1反应性。如所预期，与同源全pla2r1的竞争对于所有患者的血清是完全的，验证了测定条件。对于大多数患者，n-末端cysr-fnii-ctld1三重结构域可抑制65-100％的pla2r1信号，表明自身免疫应答主要由靶向含cysr和/或ctld1表位的结构域的自身抗体驱动。与作为单一结构域的cysr或ctld1以及与cysr或ctld1混合的ctld2-8的进一步竞争证明cysr和ctld1均是抗pla2r1反应性的主要贡献者。相反，含有c-末端ctld5和ctld7表位的结构域对于大多数患者表现为次要贡献者。由于ctld8的低发率和可能的小贡献，如从用单一ctld5和ctld7结构域相对于与ctld2-8区域混合或不与ctld2-8区域混合的cysr和ctld1结构域测量的竞争数据推断，没有进行针对ctld8的竞争测定。
[0269]
上述实验表明，基于表位阳性和竞争分布，患者血清表现出不同的循环自身抗体模式，其中cysr和ctld1清楚地含有免疫显性表位并驱动大多数患者的体液自身免疫应答。考虑表位发生率和竞争测定，本发明人将患者分为三组：免疫显性cysr(icr)、免疫显性ctld1(ic1)和非免疫显性(非idom)。icr患者被定义为主要由靶向cysr的自身抗体(占pla2r1信号反应性的65-100％)和识别其它含表位结构域(包括ctld1)的自身抗体的低贡献驱动的体液应答。ic1患者被定义为不仅由抗cysr而且由抗ctld1自身抗体以及很少来自其它远端含表位结构域的贡献驱动的体液应答，其中抗ctld1自身抗体贡献高达80％的pla2r1信号反应性(即，以抗cysr反应性为代价，抗ctld1反应性平衡且逐渐增加)。非-idom患者由体液应答定义，其中pla2r1信号似乎均匀遍布于不同的含表位结构域上，而没有特定表位结构域的免疫显性的指征。在方法中进一步定义了患者的分层，并且在图4a中示出了来自每组的示例性患者病例。有趣的是，具有相同表位分布(例如crc1c5c7)的患者可以属于不同的免疫显性组(图4a)。如图4b所示，大多数患者为icr(55.2％)，显著数量为ic1(36.0％)，并且少数为非idom(8.8％)。
[0270]
抗pla2r1滴度和免疫显性
[0271]
如上所述，通过标准化elisa测定的抗pla2r1滴度对患者进行分级，并显示其免疫显性分布(图3a)。发明人观察到icr患者更多地存在于抗pla2r1滴度的第一和第二三分位数中，而ic1患者相反更多地存在于第三三分位数中，并且非idom患者存在于第一和第二三分位数中但不存在于第三三分位数中(图3a)。当结合表位阳性和免疫显性时，非idom、icr和ic1患者可以根据其表位分布的增加的复杂性进行分级，并且可以观察到对于两种类型的免疫显性，抗pla2r1滴度随着表位阳性向pla2r1的c-末端区域发展直至ctld7和ctld8而增加(图3b)。有趣的是，尽管具有高达ctld7的复杂表位分布，少数非idom患者具有相对低的抗pla2r1滴度，并且可以最佳地定位在icr和ic1组之间(图3b)。这支持了这样的观点，即只有当cysr和/或ctld1充当含有免疫显性表位的结构域并驱动大部分抗pla2r1信号时，才能观察到最高的抗pla2r1滴度(第三三分位数)。
[0272]
全pla2r1的抗pla2r1滴度与含有免疫显性表位的结构域之间的相关性
[0273]
由于cysr和ctld1被鉴定为含有免疫显性表位的结构域，本发明人测量了它们对所有患者的全pla2r1抗原的滴度(检测抗pla2r1 igg4)，并分析了与用标准化elisa测量的抗pla2r1滴度的相关性(检测抗pla2r1总igg)。当作为整体分析队列时(r＝0.89)或分层进入icr或ic1患者后(分别为r＝0.85和r＝0.86)，观察到全pla2r1与总igg vs.igg4测得的抗pla2r1滴度之间的高度正相关(图5，上图)。在整个群体以及icr和ic1患者的完全抗pla2r1滴度(总igg)和抗cysr滴度之间也观察到高度正相关(分别为r＝0.82，r＝0.81和r＝0.90，图5，中图)。然而，ic1患者的完全抗pla2r1滴度和抗ctld1滴度之间的相关性(r＝0.80)高于全队列或icr患者(r分别为0.58和0.50，图5，下图)。对检测igg4抗体的完全抗pla2r1滴度与抗cysr或抗ctld1滴度之间的相关性进行了类似的观察。有趣的是，非idom患者的全pla2r1、cysr和ctld1的抗pla2r1滴度分散在相对窄的范围内，具有低到中等范围的值。如抗pla2r1滴度所观察到，抗cysr和抗ctld1滴度随着含有阳性表位的结构域数目的增加而增加。最后，本发明人还分析了不同免疫显性组的抗pla2r1、抗cysr和抗ctld1滴度。总体而言，icr和非idom组的中值滴度相似，并且低于ic1患者的中值滴度，表明ctld1的免疫显性效应超过cysr免疫显性效应。
[0274]
总之，根据实施例1和2，本发明人具体表明在pla2r1阳性mn患者中：i)循环抗pla2r1自身抗体可识别高达5个含表位的结构域，包括cysr、ctld1、ctld5、ctld7和ctld8，表明50％的pla2r1胞外区被自身抗体靶向；ii)表位发生率从含n-末端到c-末端表位的结构域降低；iii)n-末端cysr和ctld1结构域携带主要的免疫显性表位，其贡献通过标准化elisa测量的大部分抗pla2r1滴度；和iv)c-末端结构域ctld5、ctld7和ctld8携带非免疫显性表位，它们共同对抗pla2r1滴度具有较小的贡献，如通过标准化商业elisa所测量。总之，总体液自身免疫应答似乎主要由n-末端cysr和/或ctld1结构域驱动，所述结构域起两个关键的但可替代的含免疫显性表位的结构域的作用，而远端扩散至c-末端的其它结构域对完全抗pla2r1滴度的贡献很小。
[0275]
本发明人进一步显示，抗ctld1/抗cysr滴度之比的分析(例如通过内部igg4检测elisa测定)可用作竞争elisa的有利替代方法以测定免疫显性。通过竞争elisa测定的患者的免疫显性特征与该比率明显相关(图7)。在研究队列中，比值低于抗ctld1/抗cysr滴度中值比的患者大多为icr，而高于中值的患者大多为ic1。如所预期，作者观察到与高于中值比(因此ic1)的患者相比，具有低于中值(因此icr)的滴度比率的患者具有更高的抗cysr滴度和更低的抗ctld1滴度，而在用标准化elisa测量的总抗pla2r1滴度中没有观察到差异(图8)。
[0276]
实施例3：与免疫显性(通过竞争测定或通过滴度比评估)、表位和抗pla2r1滴度的临床相关性
[0277]
掌握了142名mn患者的抗pla2r1循环自身抗体的各种特征后，本发明人分析了它们与临床表现和结果的关联。
[0278]
抗pla2r1自身抗体的临床特征及特点
[0279]
中位年龄为55岁，约三分之二的男性患者具有高蛋白尿，研究队列的基线临床特征与其他mn队列相似(seitz-polski,b,dolla,g,payre,c,girard,ca,polidori,j,zorzi,k,birgy-barelli,e,jullien,p,courivaud,c,krummel,t,benzaken,s,bernard,g,burtey,s,mariat,c,esnault,vl,lambeau,g:epitope spreading of autoantibody response to pla2r associates with poor prognosis in membranous nephropathy.j am soc nephrol,27:1517-1533,2016；seitz-polski,b,debiec,h,rousseau,a,dahan,k,zaghrini,c,payre,c,esnault,vlm,lambeau,g,ronco,p:phospholipase a2 receptor 1 epitope spreading at baseline predicts reduced likelihood of remission of membranous nephropathy.j am soc nephrol,29:401-408,2018)。43％的患者接受保守治疗(niat)，57％接受免疫抑制剂(is，其中大多数接受利妥昔单抗，75％的is治疗患者占整个队列的43％)。至于抗pla2r1自身抗体的特征，用标准化的总igg elisa和自制igg4 elisa测定抗pla2r1抗原的抗pla2r1滴度。还测量了针对靶向cysr或ctld1结构域的特异性自身抗体的igg4滴度，因为它们携带免疫显性表位并允许通过免疫显性对患者进行分层。
[0280]
通过免疫显性的分层：
[0281]
对于免疫显性，55％的患者被分类为icr，36％的ic1和9％的非idom(图4b)。
[0282]
通过表位分布的分层
[0283]
对于表位分布，除了通过5个含pla2r1表位的结构域的发生率和通过含表位的结构域的数目的阳性(与免疫显性无关)对患者进行分层之外，本发明人基于在体液自身免疫
应答成熟期间发生的从cysr到其它结构域(如ctld1和ctld7)的表位扩散的假设对患者进行分层，如专利申请wo/2017/009245中所述。
[0284]
在该假设中，在ctld5和ctld8结构域都不被称为含表位结构域时，将患者分层为仅对cysr结构域呈阳性的那些(也称为非扩散者，且现在对应于cr
±
c5
±
c8患者(n＝56))和对cysr呈阳性且对ctld1和/或ctld7呈额外阳性的那些(称为扩散者，n＝86)。在考虑将ctld5和ctld8鉴定为含表位结构域的当前假设中，具有仅cysr分布的患者组变得更小(n＝19)，而具有扩散至“任何其它表位”的患者组变得更大(n＝123)。下文分析了上述抗体特征与临床表现和临床结果之间的关联。
[0285]
根据免疫显性的临床表现和结果
[0286]
首先比较基线时的临床特征和根据患者分层为icr、ic1和非idom组的一线治疗后的临床结果。除icr患者的蛋白尿低于ic1患者(5.3vs 6.8g/天，p＝0.02)外，患者的年龄、性别或临床参数无任何差异。免疫抑制剂治疗(is)与保守治疗(niat)的icr、非idom和ic1患者无差异。
[0287]
然而，亚组之间的临床结局存在显著差异(图6a)。大部分icr和非idom患者达到缓解(分别为64.0％和75.0％)，而对于ic1患者观察到相反情况，其中大部分保持活动性疾病或进展为eskd(59.2％)。ic1患者在基线时的抗pla2r1滴度(178.0ru/ml)高于icr和非idom患者(分别为56.5ru/ml和59.7ru/ml)。与icr患者相比，ic1患者对各种含表位结构域的阳性和向ctld1和/或ctld7结构域的扩散更频繁。
[0288]
根据表位分布的临床表现和结果
[0289]
当考虑对应于我们的原始(cr
±
c5
±
c8vs.对ctld1和/或ctld7的阳性，如专利申请wo/2017/009245中所述)和当前(仅crvs.cr 任何其它表位，考虑将ctld5和ctld8鉴定为新的含表位结构域)表位扩展的工作假设的表位分布时，比较基线的临床特征和一线治疗后的临床结果(图6b和6c)。
[0290]
表现出仅针对cysr结构域的自身抗体的患者比具有针对cysr加任何其它结构域的自身抗体的患者具有更好的肾功能(89vs68ml/min/1.73m2,p＝0.0078)、更低的蛋白尿(4.6vs6.4g/天,p＝0.0452)和更低的自身抗体滴度。然而，仅具有cysr反应性的患者与具有cysr加任何其它表位反应性的患者之间的临床结果没有差异。
[0291]
该观察结果与我们的原始假设形成对比，其中仅具有cysr反应性的患者具有比具有cysr加上对ctld1和/或ctld7的额外反应性的患者更好的临床结果(如wo/2017/009245中所述)。
[0292]
基线特征与临床结果的相关性探讨
[0293]
分析进入或未进入缓解的患者之间可能不同的基线临床参数和抗pla2r1特征。达到缓解的患者者较年轻、肾功能较好且蛋白尿较低。与先前的研究一致，达到自发或is诱导的缓解的患者在基线时具有较低的抗pla2r1滴度(图6d)，表位阳性不同，并且在含有ctld1和/或ctld7表位的结构域上扩散较少。关于免疫显性，达到缓解的患者比ic1更常是icr或非idom，表明免疫显性是临床结果的新预测因子。
[0294]
抗pla2r1滴度在经调整的分析中预测临床结果
[0295]
几个先前的研究已经显示抗pla2r1滴度预测临床结果。因此，在测试作为新预测因子的免疫显性之前，本发明人证实，当考虑具有所有相关数据的135名患者的相同群体
时，这可以在其队列中观察到。在未调整的分析中，当比较具有低于和高于中值(64.8ru/ml，图6d)的抗pla2r1滴度的患者时，抗pla2r1滴度与临床结果相关。滴度高于中值的患者临床结局较差(or＝0.237[0.114-0.492],p＝0.0001)。在调整分析中，滴度高于64.8ru/ml的患者达到缓解的机会低4倍，与基线egfr和蛋白尿水平以及治疗(niat对is)无关。
[0296]
考虑到抗pla2r1滴度和治疗的组合，本发明人观察到，与抗pla2r1滴度低于64.8ru/ml的niat治疗的患者相比，接受相同保守治疗但抗pla2r1滴度高于64.8ru/ml的患者达到缓解的机会低5倍，与egfr和蛋白尿无关。类似地，抗pla2r1滴度低于64.8ru/ml的is治疗患者达到缓解的机会比抗pla2r1滴度高于64.8ru/ml的is治疗患者高3倍(or＝3.149[1.142-8.686],p＝0.03)。
[0297]
免疫显性在经调整的分析中预测临床结果
[0298]
然后，本发明人测试了免疫显性的类型是否也可以在调整的分析中预测临床结果。由于非idom患者具有比ic1患者更类似于icr的临床和免疫学特征以及相似的缓解机会，本发明人比较了作为单一组组合的icr/非idom患者vs.ic1患者的免疫显性。在未调整的分析中，免疫显性与临床结果相关。在调整的分析中，ic1患者达到缓解的机会比icr/非idom患者低约3倍，而与基线egfr和蛋白尿水平以及治疗(niat vs.is)无关。当组合免疫显性和治疗时，用免疫抑制剂治疗的icr/非idom患者达到缓解的机会比niat治疗的患者多约3倍。此外，用免疫抑制剂治疗的icr/非idom患者进入缓解的机会比也用免疫抑制剂治疗的ic1患者多4.5倍(or＝4.467[1.605-12.432],p＝0.004)。当icr和非idom患者被认为是单独的组时，进行了类似的观察，但p值较低至几乎不显著。
[0299]
考虑到抗ctld1/抗cysr滴度之比作为鉴定免疫显性分布的替代方法，本发明人还测试了该方法以预测临床结果。在未调整的分析中，抗ctld1/抗cysr滴度的中值比与临床结果相关(图9)。在调整的分析中，具有高于中值(0.0324，因此主要是ic1)的抗ctld1/抗cysr滴度比的患者(n＝134)达到缓解的机会比具有低于中值(0.0324，因此主要是icr)的滴度比的患者低约3倍，而与基线egfr和蛋白尿以及治疗(niat对is)无关。当组合滴度和治疗的中值比时，低于中值(因此主要是icr)并用免疫抑制剂治疗的患者达到缓解的机会比高于中值并用免疫抑制剂治疗的患者多4倍(or＝3.956[1.368-11.440],p＝0.0196)。
[0300]
抗pla2r1滴度和免疫显性之间的附加值预测调整分析中的临床结果
[0301]
为了评价免疫显性相对于抗pla2r1滴度的附加值，本发明人进行了结合抗pla2r1滴度和其它抗体特征的调整分析。抗pla2r1滴度本身对于预测临床结果是显著的(在调节egfr、蛋白尿和治疗后)。免疫显性的调整分析仍然是显著的，表明免疫显性具有超过抗pla2r1滴度的附加值。具体地，具有ic1免疫显性分布的患者达到缓解的机会较低，而与抗pla2r1滴度无关(or＝2.358[1.076-5.155])。
[0302]
类似地，抗ctld1/抗cysr滴度的中值比高于中值(因此，大部分是ic1)的患者达到缓解的机会低于中值以下的患者，而与抗pla2r1滴度无关(od＝2.831[1.313-6.106])。
[0303]
免疫显性有助于提高对利妥昔单抗应答的可能性
[0304]
利妥昔单抗正成为治疗严重mn的一线免疫抑制疗法。然而，在具有高于某一截止elisa值的高抗pla2r1滴度的患者中，对利妥昔单抗应答的可能性降低，所述截止elisa值尚未明确定义，但可能为约200ru/ml(ruggenenti,p,debiec,h,ruggiero,b,chianca,a,pelle,t,gaspari,f,suardi,f,gagliardini,e,orisio,s,benigni,a,ronco,p,remuzzi,
g:anti-phospholipase a2 receptor antibody titer predicts post-rituximab outcome of membranous nephropathy.j am soc nephrol,26:2545-2558,2015；de vriese,as,glassock,rj,nath,ka,sethi,s,fervenza,fc:a proposal for a serology-based approach to membranous nephropathy.j am soc nephrol,28:421-430,2017)。
[0305]
由于利妥昔单抗是研究队列中给予患者的主要免疫抑制剂，本发明人利用该队列来测试免疫显性是否具有附加值，以预测当抗pla2r1滴度低于200ru/ml时对利妥昔单抗应答的可能性。
[0306]
首先，发明人进行了排除用利妥昔单抗以外的免疫抑制剂治疗的患者(即除去20名患者)的敏感性分析以确定免疫显性是否仍然预测临床结果。结果与整个队列相似。一方面，在icr/非idom患者中，用利妥昔单抗治疗的患者达到缓解的机会比niat治疗的患者高4.5倍(or＝4.615[1.486-14.329)。另一方面，在用利妥昔单抗治疗的患者中，icr/非idom患者达到缓解的机会比ic1患者高6倍，表明ic1患者对治疗更加耐药(or＝5.998[1.771-20.311]，数据未显示)。总之，这表明icr/非idom患者对利妥昔单抗的应答机会高于ic1患者。
[0307]
第二，考虑到具有高抗pla2r1滴度的患者对利妥昔单抗的上述较低应答和最近提出的将具有204ru/ml作为可能的上限截止值的基于血清学的mn方法，本发明人选择基线抗pla2r1滴度低于200ru/ml的患者，其可需要利妥昔单抗治疗并且可具有更好的应答机会，并分析免疫显性是否可能有助于改善该群体中对利妥昔单抗的应答可能性。低于200ru/ml，51.2％的患者接受利妥昔单抗治疗，而其他患者(48.9％)接受niat治疗。icr/非idom和ic1患者在蛋白尿方面存在差异，但在其他临床特征(包括抗pla2r1滴度)方面不存在差异。有趣的是，ic1患者与icr/非idom患者相比具有总体更差的临床结果(图6e)，并且在用利妥昔单抗治疗的那些患者中，大部分对治疗没有应答，而大多数icr患者应答并达到缓解(ic1组的无缓解为61.5％，而icr/非idom组的缓解为89.7％，图6e)。当考虑抗ctld1/抗cysr滴度之比以确定患者免疫显性分布时，观察到类似的结果(图9b中的最右组)。
[0308]
总之，抗pla2r1滴度和免疫显性(通过竞争测定或通过分析抗ctld1/抗cysr抗体滴度之比来评估)分布的组合评估可有助于更好地预测对利妥昔单抗的应答可能性。