一种超声辅助提取蜂王浆中脂肪酸的方法

1.本发明涉及天然产物提取的领域，更具体地说，涉及一种超声辅助提取蜂王浆中脂肪酸的方法。
技术背景
2.蜂王浆是由青年工蜂的咽下腺和上颚腺分泌的乳白色、淡黄色或浅橙色浆状物质，味道酸、涩，略带辛辣，用于饲喂蜂王及3日龄以下幼虫。蜂王浆富含蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素和矿物质等多种营养成分，其中脂类是蜂王浆的主要成分之一，约占新鲜蜂王浆总量的3-8％，占蜂王浆冻干粉总量的8％-19％。脂肪酸是蜂王浆中脂类成分的重要组成部分，占脂类成分总量的80％-90％，其中大部分为游离脂肪酸。目前已从蜂王浆中检测出94种脂肪酸，其中主要由反式-10-羟基-2-癸烯酸(10-hda)、10-羟基癸酸、3,10-二羟基-癸酸、8-羟基辛酸、癸二酸组成。蜂王浆脂肪酸有着十分广泛的生物学活性，如抗炎、神经保护、抗氧化、抗菌等，目前已成为保健食品研究领域的热点。
3.目前溶剂提取法、索氏提取法是蜂王浆脂肪酸提取方法中最为广泛使用的方法，这些方法存在提取率低、耗时长、溶剂消耗量大的缺点。近年来，随着绿色化学的兴起，一些新型提取方法超声辅助提取、微波辅助提取、超临界流体萃取和脉冲电场辅助萃取等受到关注，其中，超声波辅助提取技术是一种物理加工技术，是指利用超声波所产生的的空化、振动、混合等特殊作用，将目标物快速高效地提取出来的一项新的提取技术，其特点在于能够提高产率、缩短提取时间、减少有毒溶剂的使用等。其优良特性使其已被成功用于提取多种生物活性化合物，包括酚类、多糖和天然色素等。
4.若能将高效、绿色的超声辅助提取法利用到蜂王浆脂肪酸的分离工作中，将会促进蜂王浆脂肪酸活性成分的加工和利用，对蜂王浆的进一步开发、应用有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种超声辅助提取蜂王浆中脂肪酸的方法，包括以下步骤实现：(1)称取蜂王浆冻干粉，按照5-50ml/g的液料比加入乙醇，充分混合，得到混合液；(2)将步骤(1)所得混合液进行超声，超声提取的功率为90-540w，超声时间为10-60min，超声温度维持在25℃；(3)将经步骤(2)超声处理后的混合物取出，低温离心分离得上清液，冷冻干燥得蜂王浆脂肪酸提取物。
6.优选的，步骤(1)中所述液料比为10ml/g。
7.优选的，步骤(2)中所述超声功率为450w，超声时间为20min。
8.优选的，步骤(3)中所述离心力为10000rpm，离心时间为10min以上。
9.优选的，步骤(3)中所述冷冻干燥步骤为：将所得上清液置于真空浓缩机将溶剂挥发至5ml以下，再置于冷冻干燥机中干燥，冷冻干燥时间为48h。
10.本发明的另一个目的是上述方法在分离提取蜂王浆脂肪酸中应用。
11.本发明首次采用超声辅助提取技术来分离蜂王浆中的脂肪酸。相比传统的方法，本发明提取方法的提取率和蜂王浆中主要脂肪酸反式-10-羟基-2-癸烯酸含量能够分别达到16.48％和4.12％。本发明提取方法设计合理，简单可行，具有提取时间短、效率高、提取温度低、溶剂消耗量小、环境友好等优点，实现了蜂王浆脂肪酸的高效提取，为蜂王浆的进一步开发与利用提供了一定的理论基础于科学依据，具有很大的应用推广价值。
附图说明
12.图1为液料比对蜂王浆脂肪酸提取率及10-hda含量的影响。
13.图2为超声功率对蜂王浆脂肪酸提取率及10-hda含量的影响。
14.图3为超声时间对蜂王浆脂肪酸提取率及10-hda含量的影响。
15.图4为超声辅助提取法(a)和溶剂提取法(b)提取物中脂肪酸谱图。
16.图5为超声辅助提取法(a)和溶剂提取法(b)提取物的傅里叶变换红外光谱。
17.图6为超声辅助提取法提取物(a)和溶剂提取法(b)提取物及超声辅助提取法残渣(c)和溶剂提取法残渣(d)的扫描电镜图像。具体实施
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图对本发明做进一步的阐述，下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
19.实施例1一种蜂王浆的快速提取方法
20.包括如下步骤，(1)称取3g蜂王浆冻干粉，按照10ml/g的液料比加入乙醇，得到混合液；(2)将步骤(1)所得混合液进行超声处理，超声提取的功率为450w，超声时间为20min，超声温度维持在25℃；(3)将经步骤(2)超声处理后的混合物取出，低温离心分离得上清液，将所得上清液置于真空浓缩机将溶剂挥发至5ml以下，再置于冷冻干燥机中干燥，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥得蜂王浆脂肪酸提取物；所述离心力为10000rpm，离心时间为10min以上。
21.实施例2不同因素对蜂王浆脂肪酸提取效果的影响比较
22.1.采用单因素试验优化超声辅助提取条件
23.(1)乙醇与蜂王浆冻干粉的液料比优化精确称取3.0g蜂王浆冻干粉，分别按1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:20的料液比加入乙醇，在4℃下提取24h，再以10000rpm离心10min分离蛋白，上清液用低温真空浓缩机挥发溶剂，待溶剂挥发至5ml以下，置于冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到蜂王浆脂肪酸提取物。称重并计算提取率及10-hda含量。结果如图1所示，蜂王浆脂肪酸的提取率及10-hda含量随液料比的增大而增大。当液料比为10ml/mg时，10-hda含量最高，达到3.91％。液料比进一步增加可能会导致杂质的溶解，并且大量乙醇会造成不必要的浪费。所以，本研究将液料比为10ml/mg作为最佳提取比例。
24.(2)超声功率的优化精确称取3.0g蜂王浆冻干粉，加入30ml乙醇，进行超声辅助提取：将超声探头浸入到混合物中，深度为2cm。通过低温恒温浴将超声温度维持在25℃，超声时间设置为30min，
超声功率分别设置为90、180、270、360、450、540w，再以10000rpm离心10min分离蛋白，上清液用低温真空浓缩机挥发溶剂，待溶剂挥发至5ml以下，置于冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到蜂王浆脂肪酸提取物。称重并计算提取率及10-hda含量。结果如图2所示，当超声功率从0增加到450w时，蜂王浆脂肪酸的提取率及10-hda含量随之增大，达到20.95％和4.22％。因为超声的空化、振动、搅拌等效应促进蜂王浆和乙醇之间的传质。但当超声功率超过450w后，提取率和10-hda含量没有明显变化。这是由于当超声功率增加到一定水平时，过多的空化泡的形成导致能量耗散或抵消，从而降低了能量传递效率。所以，本研究中将450w作为最佳超声功率。
25.(3)超声时间的优化精确称取3.0g蜂王浆冻干粉，加入30ml乙醇，进行超声辅助提取：将超声探头浸入到混合物中，深度为2cm。通过低温恒温浴将超声温度维持在25℃，超声功率设置为450w，超声时间分别设置为10、20、30、40、50、60min，再以10000rpm离心10min分离蛋白，上清液用低温真空浓缩机挥发溶剂，待溶剂挥发至5ml以下，置于冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到使用超声辅助提取法的蜂王浆脂肪酸提取物。称重并计算提取率及10-hda含量。
26.同时，设置未超声处理组(传统溶剂提取法)：精确称取3.0g蜂王浆冻干粉，加入30ml乙醇，在4℃下提取24h，再以10000rpm离心10min分离蛋白，上清液用低温真空浓缩机挥发溶剂，待溶剂挥发至5ml以下，置于冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到使用传统溶剂提取法的蜂王浆脂肪酸提取物。称重并计算提取率及10-hda含量。
27.结果如图3所示，与传统溶剂提取法相比，采用超声辅助提取技术能够显著提高蜂王浆脂肪酸的提取率与10-hda含量。在传统溶剂提取法中，在0min-60min时间范围内，提取率和10-hda含量无显著变化。在超声辅助提取法中，随着提取时间从0min增加到20min，提取率和10-hda含量迅速增加，分别达到16.48％和4.12％。随着超声时间从20min进一步增加到40min，提取率继续增加，而10-hda含量变化不明显。当超声时间继续增加至60min，提取率不再增加，10-hda含量有所下降。提取效率的降低可能是由于达到平衡后脂肪酸不再溶出，并且时间过长也会导致杂质的溶解。此外，长时间超声处理会增加能耗，延长提取周期，增加提取成本，所以，本研究中将20min作为最佳超声时间。
28.2.提取率的计算，按照以下公式计算提取率：
29.3.10-hda含量测定分析前处理：称取0.01g提取物，加入200μl 0.01mol/l hcl溶解，加入对羟基苯甲酸甲酯作为标准品，用乙醇定容至10ml，摇匀，置于超声浴中15min，通过0.22μm膜过滤以进行高效液相色谱分析。
30.色谱条件：色谱柱：sepax hp-c18 column(5μm,150
×
4.60mm)；流动相(ch3oh 0.03mol/l hcl h2o)＝55 10 35；测定波长为210nm；柱温度为35℃，进样量为4μl，流速为1ml/min，10-hda按以下公式计算：
31.脂肪酸图谱
采用气相色谱-质谱联用法对上述优化条件的提取物中脂肪酸成分进行鉴定分析，并与溶剂提取法的提取物进行对比。
32.分析前处理：称取0.01g提取物，加入200μl 0.01mol/l hcl溶解，加入对羟基苯甲酸甲酯作为标准品，用乙醇定容至10ml，摇匀，置于超声浴中15min，通过0.22μm膜过滤。取1ml过滤后的样品，挥发干溶剂后，再加入1.5ml乙醚复溶，取1ml通过0.22μm膜过滤，挥发干溶剂，再加入400μl吡啶和100μl n,o-bis-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(bstfa)进行衍生化，在60℃下水浴30min后进行气相色谱-质谱联用分析。其气相色谱图(图4)及脂肪酸组成分析表(表1)结果显示，两种方法均提取出8种脂肪酸，且含量无显著差异。
33.色谱条件：色谱柱：hp-5(30m,0.25mm,0.25μm)；分流比为1:20；进样量为1μl；进样器温度为250℃，检测器温度为330℃；柱箱温度梯度：50℃保持5min，5℃/min上升至300℃，以氦气为载气，载气流速为1ml/min。
34.表1超声辅助提取法及溶剂提取法提取物脂肪酸组成(占总脂肪酸的百分比)编号脂肪酸超声辅助提取法(％)溶剂提取法(％)28-羟基辛酸2.36
±
0.042.36
±
0.0533-羟基癸酸1.19
±
0.081.04
±
0.1849-羟基-2-癸烯酸1.82
±
0.061.80
±
0.03510-羟基癸酸16.89
±
0.1016.91
±
0.086反式-10-羟基-2-癸烯酸69.63
±
0.3269.69
±
0.367癸二酸2.34
±
0.052.32
±
0.0282-癸烯-1,10-二酸3.03
±
0.282.93
±
0.0693,10-二羟基-癸酸2.74
±
0.082.95
±
0.34 不饱和脂肪酸74.49
±
0.0774.41
±
0.40 饱和脂肪酸25.51
±
0.0725.59
±
0.40
35.5.通过扫描电镜和傅里叶红外光谱对上述优化条件的提取物进行结构表征。傅里叶红外光谱图(图5)显示两种方法吸收峰位置及类型非常相似，说明超声波辅助提取方法对蜂王浆脂肪酸的化学结构无显著影响。扫描电镜(图6)结果显示超声辅助提取法的提取物表面粗糙、疏松、褶皱，表面有较大的孔洞，而溶剂提取法的提取物表面光滑致密；超声辅助提取法的残渣呈现不规则的团块、条状或排列无序的碎片而溶剂提取法的残渣颗粒完整，表面无明显损伤，呈现块状致密结构。这说明超声可以通过空化作用破坏蜂王浆微观结构，促进蜂王浆脂肪酸和乙醇间的传质，从而提高蜂王浆中脂肪酸的提取效率。
36.虽然上述实施例已对本发明作出了详尽的描述，但本发明的保护范围并不局限于此，还可对本发明的方案作出其不偏离中心的修改，它们都属于本发明的保护范围。