一种快速检测蜂蜜中Amadori化合物的方法

一种快速检测蜂蜜中amadori化合物的方法
技术领域
1.本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种快速检测蜂蜜中amadori化合物的方法。


背景技术：

2.蜂蜜是一种由蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物后，在体内经自身的酶和特殊物质加工酿造而成的天然甜味物质。《本草纲目》：蜂蜜当药之功有五，清热解毒也，补中也，祛毒也，润燥也，止疼也。《本经》：主心腹邪气，诸惊痫痓，安五脏诸不足，益气补中，止痛解毒，和百药。《别录》：养脾气，除心烦，食饮不下，止肠澼，肌中疼痛，口疮，明耳目。蜂蜜不仅是一种营养丰富的天然滋养食品，更作为常用中药广泛应用于中医临床和中药炮制及中药制剂等，具有调补脾胃、缓急止痛、润肺止咳、润肠通便、润肤生肌、解毒等众多功效。
3.由花蜜到蜂蜜的转化必须完全由蜜蜂完成，成熟过程中不得进行人为干预。热加工会促进美拉德反应产物(mrps)的积累、酶活性降低以及热敏性成分的损失，严重影响蜂蜜的质量和安全。蜂蜜是进行美拉德反应的良好基质，它含有丰富的单糖(葡萄糖和果糖约占75％)，并含有多种游离氨基酸。amadori化合物作为关键的美拉德反应产物，已被提出是人工浓缩蜜的潜在标记物，并且在多种加工食品的质量监测中具有重要作用。由于美拉德反应系统的高度复杂性，对食品基质中低水平amadori化合物的检测一直是个难题。目前用于检测浓缩蜜的方法主要是基于色谱-质谱联用，这类方法存在样品预处理复杂、分析耗时较长等问题，因此在检测高糖基质中的低含量物质方面存在一定的局限性。本发明采用纳升电喷雾离子源质谱进行蜂蜜中低水平amadori化合物的快速检测，克服了样品分析时产生的背景干扰，实现了其在高糖复杂基质中的应用。


技术实现要素：

4.针对背景技术中所提到的问题，本发明提供了一种基于纳升电喷雾离子源质谱(nanoesi-ms)快速检测蜂蜜中amadori化合物及浓缩蜜鉴别方法，具体采用如下技术方案：
5.本发明提供了一种快速检测蜂蜜中amadori化合物及浓缩蜜鉴别方法，包括以下步骤：
6.步骤1)：将待测蜂蜜制成蜂蜜样品溶液备用；
7.步骤2)：采用nanoesi-ms对蜂蜜样品溶液进行表征，检测单糖、氨基酸及amadori化合物，根据标准品二级和三级碎片信息对物质进行定性，根据响应较高的二级碎片离子的响应强度进行相对定量；
8.步骤3)：采用m/z 50-500的质谱数据进行多变量分析，以偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘法判别分析构建多变量模型，基于该模型实现浓缩蜜的鉴别。
9.作为上述方案的进一步优选，步骤1)蜂蜜样品溶液的制备方法为：将待测蜂蜜室温下搅匀并加水定容，离心取上清液得到蜂蜜样品溶液。
10.作为上述方案的进一步优选，步骤2)nanoesi-ms的检测条件为：采用ltq-xl线性离子阱，ltq喷雾电压为2.25kv(实际输出为示数的90％)，毛细管温度为300℃，溶剂为纯
水；谱图在正离子模式下获取，二级质谱图通过碰撞诱导解离(cid)获取。
11.作为上述方案的进一步优选，步骤2)nanoesi-ms中，nanoesi尖端硼硅酸盐玻璃毛细管：o.d.＝1.5mm,i.d.＝0.86mm。
12.作为上述方案的进一步优选，所述amadori化合物包括fru-pro和fru-phe。
13.作为上述方案的进一步优选，将碰撞诱导解离得到各物质的ms2和ms3质谱与参考文献、标准品和数据库进行比较，用于鉴定或预测代谢物。
14.作为上述方案的进一步优选，所得ms2质谱中，以m/z 260和m/z 310分别作为fru-pro和fru-phe的相对定量离子。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.1、本发明方法对高糖蜂蜜不需要经过预处理，溶解稀释后可以直接采用nanoesi-ms采集质谱数据。
17.2、本发明检测方法能够实现快速分析，整个质谱数据采集过程可在5min之内完成。
18.3、本发明检测方法灵敏度高，可实现复杂蜂蜜基质中低含量amadori化合物的检测，结合多变量分析快速区分天然成熟蜜和人工浓缩蜜，操作简单，具有良好的应用前景。
附图说明
19.图1为nanoesi-ms的实验参数优化图。
20.图2为nanoesi-ms的装置示意图。
21.图3为正离子模式下nanoesi-ms采集的蜂蜜样品一级质谱图。
22.图4为蜂蜜样品中amadori化合物的二级、三级质谱图。
23.图5为蜂蜜样品中amadori化合物含量随温度的变化趋势。
24.图6为不同植物来源的蜂蜜在55℃热加工条件下amadori化合物含量变化。
25.图7为偏最小二乘法判别分析(pls-da)和正交偏最小二乘法判别分析(opls-da)区分天然成熟蜜和浓缩蜜的3d得分图。
26.图8为pls-da和opls-da的置换检验图。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非用于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
29.实施例
30.1、样品收集与处理
31.未成熟水蜜(编号ih 1-ih 4)是在早上放入新巢脾，并于当天傍晚收集得到；天然成熟蜜(编号nh 1-nh 18)于2021年从中国不同省份的合作蜂农处获得，包括洋槐蜜、山乌
桕蜜、柑橘蜜；人工浓缩蜜(ah)使用旋转蒸发仪在实验室中制备(取未成熟水蜜ih 4于85℃加热浓缩2h制得；旋转蒸发仪，参数设置：转速90rpm，气压100mbar)；所有样品保存于-20℃。分析前1小时，将蜂蜜样品置于室温下(25℃)，手动搅拌以确保均匀；0.1g蜂蜜样品定容至5.0ml，8000rpm离心10min，取上清液于-80℃保存。
32.2、纳米移液管(nanopipette)的制作
33.纳米移液管为锥口内径范围属于纳米级别的移液管，用于装载样品，作为离子源形成样品电喷雾的发射喷口。利用p-97拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管熔断拉制成纳米移液管。
34.3、nanoesi-ms样品检测
35.质谱(ms)实验主要在线性离子阱(ltq xl,thermo scientific,san jose,ca)上进行。ltq喷雾电压为2.25kv(实际输出为示数的90％)，毛细管温度为300℃，溶剂为纯水；谱图在正离子模式下获取，二级质谱图通过碰撞诱导解离(cid)获取(实验参数优化如图1所示)。质谱扫描范围m/z 50～500，质谱数据在软件thermo xcalibur qual browser 4.0上分析。nanoesi尖端硼硅酸盐玻璃毛细管：o.d.＝1.5mm,i.d.＝0.86mm；将2.25kv的直流高压电(dc)接到毛细管的后部，装置如图2所示。
36.4、物质定性定量
37.碰撞诱导解离(cid)得到的各物质ms2和ms3质谱与参考文献、标准品(fructose-proline(fru-pro)、fructose-phenylalanine(fru-phe)，购买自toronto research chemicals公司(toronto,canada))和数据库(human metabolome database,hmdb)进行比较，用于鉴定或预测代谢物。在ms2质谱中，离子[m h-h2o]

峰度最高，因此m/z 260和m/z 310分别作为fru-pro和fru-phe的相对定量离子，以此来检测其含量变化。
[0038]
5、蜂蜜样品一级指纹图谱
[0039]
本实验使用nanoesi-ms对未成熟水蜜、人工浓缩蜜和天然成熟蜜进行质谱检测，图3为正离子模式下nanoesi-ms采集的蜂蜜样品(即步骤1所得上清液)一级质谱图，主要离子峰：m/z 116([脯氨酸 h]

)、m/z 166([苯丙氨酸 h]

)、m/z 198([单糖 nh4]

)、m/z 203([单糖 na]

)、m/z 219([单糖 k]

)、m/z 278([fru-pro h]

)、m/z 328([fru-phe h]

)、m/z 365([二糖 na]

)、m/z 381([二糖 k]

)。单糖和双糖是蜂蜜的主要成分，它们在正离子模式下以多种形式的离子加合物存在，如[m nh4]

、[m na]

和[m k]

。m/z 116和m/z 166分别为脯氨酸和苯丙氨酸的[m h]

峰；检测到两种amadori化合物分别为m/z 278(fructose-proline,fru-pro)和m/z 328(fructose-phenylalanine,fru-phe)，它们通常以[m h]

经过一系列脱水而形成相应的碎片离子，图4所示为蜂蜜样品中amadori化合物的二级、三级质谱图(上为fru-pro、下为fru-phe)，蜂蜜中amadori化合物碎片离子与标准品一致。
[0040]
为了研究加热温度对amadori化合物水平的影响，我们将样品ih 4在25℃、40℃、55℃、70℃、85℃下加热浓缩(采用旋转蒸发仪，参数设置：转速90rpm，气压100mbar；加热浓缩2h)。如图5所示，随着温度的升高，蜂蜜样品中fru-pro和fru-phe呈明显的上升趋势，值得注意的是，55℃时信号强度已有明显增强，而55℃是工业常用的热加工蜂蜜温度，这意味着fru-pro和fru-phe可以作为蜂蜜是否经过加热浓缩的潜在标记物。为了进一步验证上述结果，我们分析了其他三组不同植物和地理来源的未成熟水蜜及其人工浓缩蜜，得到了相似的结果，即55℃热加工后两种amadori化合物水平均显著上调，如图6所示(图中1、2、3、4
组分别对应未成熟水蜜ih 1-ih 4与其55℃加热条件(同上55℃加热的步骤参数)下的人工浓缩蜜ah 1-ah 4，其中左为fru-pro，右为fru-phe；*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，n.s.表示无显著性差异)。
[0041]
6、基于多变量模型区分nh和ah
[0042]
由图7(上为pls-da，下为opls-da)可知，3d pls-da得分图和3dopls-da得分图中nh和ah获得了良好区分，图8为pls-da和opls-da的置换检验图，如图8所示，模型经200次置换检验未出现过拟合现象，说明本发明构建的模型具有良好的稳定性及可靠性。以上结果表明，采用nanoesi-ms可实现复杂蜂蜜基质中低含量amadori化合物的快速检测，并结合多变量分析快速区分天然成熟蜜和人工浓缩蜜。
[0043]
以上所描述的实施例仅表达了本发明的几种优选实施例，其描述较为具体和详细，但并不用于限制本发明。应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种变化和更改，凡在本发明的构思和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。