一种含银抗菌剂及其制备方法和应用与流程

12)：(1-8)：(0.5-2.5)。
12.进一步地，在步骤(1)中，所述混合反应的时间为15-55min；所述反应的时间为1.5-3h。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述有机配体溶液包括羧基苯硼酸钠溶液；所述羧基苯硼酸钠溶液的浓度为0.1-0.3mg/ml；所述搅拌反应时间为1-3h；所述含银抗菌剂的浓度为0.2-2.6mg/ml。
14.本发明还提供一种根据上述的制备方法获得的含银抗菌剂。
15.本发明还提供一种根据上述的含银抗菌剂在制备修复感染性创面敷料中的应用。
16.进一步地，所述含银抗菌剂通过杀灭创面处的感染性细菌、抑制促炎因子表达以及促进胶原纤维形成，达到修复感染性创面的功效。
17.进一步地，所述感染性细菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；所述促炎因子包括il-6和tnf-α。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.1.本发明利用功能有机配体与含银水滑石混合，制备过程中将银离子掺杂于水滑石中，既增加抑菌的广谱性，又增加生物相容性。利用含银水滑石与有机配体的结合，可以高效提高含银抗菌剂的效果，为新型抗菌敷料提供新的设计策略。
20.2.本发明方法是一种新型的能直接制备含银抗菌剂的方法，该法简便，固定投入少，生产周期短，易于大规模生产。
21.3.本发明制备的含银抗菌剂能够高效杀死革兰氏细菌，而且可以杀死感染性创面处细菌，有效促进伤口愈合。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明中含银水滑石的xrd图谱；
24.图2为本发明中含银抗菌剂的细胞毒性及抗菌效果图；
25.图3为本发明中含银抗菌剂用于大鼠细菌感染性伤口大小修复图及苏木精-伊红(h&e)染色图；
26.图4为本发明大鼠模型的伤口组织区的细菌涂板图及细菌存活率统计结果；
27.图5为本发明中含银抗菌剂用于大鼠细菌感染性伤口的马松三色(masson’s trichrome)染色修复图；
28.图6为本发明中含银抗菌剂用于大鼠细菌感染性伤口修复组织的il-6和tnf-α的免疫荧光图像；
29.图7为本发明中含银抗菌剂用于大鼠感染性伤口修复后，各组的鼠肝脏和肾脏的h&e图。
具体实施方式
30.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
31.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
32.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
33.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
34.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
35.实施例1一种含银抗菌剂的制备方法
36.包括以下步骤：
37.(1)将镁源：氯化镁(0.6m)和铝源：氯化铝(1.0m)加到0.5l的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液a，将碱(氢氧化钠)0.8m加入至1l的蒸馏水通过机械搅拌得到均匀溶液b，将溶液a和溶液b混合，反应15分钟后，向其中加入硝酸银(0.05m)的0.2l水溶液，反应2小时，之后离心和干燥得到含银水滑石粉体(ag-ldh)。
38.(2)配置羧基苯硼酸钠水溶液(0.1mg/ml)(scpb)，得到溶液c，将含银水滑石分散到其中，搅拌反应2小时，得到含银抗菌剂scpb@ag-ldh(0.4mg/ml)。
39.实施例2一种含银抗菌剂的制备方法
40.包括以下步骤：
41.(1)将镁源：硫酸镁(0.6m)和铝源：硝酸铝(0.2m)加到0.5l的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液a，将碱(氢氧化钠)0.1m加入至1l的蒸馏水通过机械搅拌得到均匀溶液b，将溶液a和溶液b混合，反应30分钟后，向其中加入0.2l硝酸银(0.03m)溶液，反应1小时，之后离心和干燥得到含银水滑石粉体(ag-ldh)。
42.(2)配置羧基苯硼酸钠水溶液(0.1mg/ml)(scpb)，得到溶液c，将含银水滑石分散到其中，搅拌反应3小时，得到含银抗菌剂scpb@ag-ldh(0.2mg/ml)。
43.实施例3
44.包括以下步骤：
45.(1)将镁源：硝酸镁(0.3m)和铝源：硫酸铝(6.0m)加到0.5l的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液a，将碱(氢氧化钠)0.3m加入至1l的蒸馏水通过机械搅拌得到均匀溶液b，将溶液a和溶液b混合，反应55分钟后，向其中加入0.2l硝酸银(0.01m)溶液，反应3小时，
之后离心和干燥得到含银水滑石粉体(ag-ldh)。
46.(2)配置羧基苯硼酸钠水溶液(0.3mg/ml)(scpb)，得到溶液c，将含银水滑石分散到其中，搅拌反应1小时，得到含银抗菌剂scpb@ag-ldh(2.6mg/ml)。
47.对比例1
48.将镁源：氯化镁(0.6m)和铝源：氯化铝(1.0m)加到0.5l的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液a，将碱(氢氧化钠)0.8m加入至1l的蒸馏水通过机械搅拌得到均匀溶液b，将溶液a和溶液b混合，反应15分钟后，离心和干燥得到水滑石粉体(ldh)。
49.对比例2
50.与实施例1的区别仅在于，省略步骤(2)，按照步骤(1)获得含银水滑石粉体(ag-ldh)。
51.效果验证
52.1.含银抗菌剂的xrd图谱
53.使用x射线粉末衍射仪对实施例1制备的含银水滑石粉体(ag-ldh)进行xdr测试，结果如图1，结果显示为水滑石的特征峰和氧化银的特征峰一致，证实本发明成功构筑含银水滑石。
54.2.含银抗菌剂的安全性
55.采用cck-8法检测细胞活力(cell viability)，小鼠成纤维细胞(l929)在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem中培养，在5％二氧化碳和37℃的条件下，将小鼠成纤维细胞以每孔1
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104个细胞的密度接种在24孔板上。细胞孵育24h后，在24孔(transwell)中加入实施例1制备的含银抗菌剂scpb@ag-ldh和等量的pbs作为对照组。用含银抗菌剂和pbs孵育1天后，用含有10％(v/v)的cck-8溶液的500μl新鲜dmem替换细胞培养基，黑暗孵育。培养2h后，将200μl上清液放入96孔板中，用分光光度计测定450nm培养板溶液的光密度(od)。
56.细胞存活率(cell viability)＝od(实验-空白)/od(对照-空白)*100％。
57.实验结果如图2所示，含银抗菌剂整体表现为低毒和基本上没有毒性，但是随着用量的增加，有一少部分细胞活性丧失。因此后续实验工作中选择0.2mg/ml浓度的scpb@ag-ldh。
58.3.scpb@ag-ldh的体外抗菌效果
59.在tsb中制备金黄色葡萄球菌(s.aureus)，在lb中制备大肠杆菌(e.coli)。首先，将50μl的原液菌与9.95ml的生长培养基混合，孵育12h(37℃，250rpm)。然后离心稀释，取浓度为106cfu/ml的细菌悬液通过稀释法产生菌落。
60.为验证含银抗菌剂的体外抗菌效果，选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为模型细菌。将实施例1制备的scpb@ag-ldh放置在24孔板中。每组三个平行实验孔，然后，将500μl制备的细菌肉汤加入到这些离心管中，并与凝胶接触1小时后，取出50μl菌液，滴入琼脂平板上，均匀分散，37℃孵育15h-24h。结果如图2，scpb@ag-ldh对两种微生物(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)具有明显抗菌作用，基本上将细菌都杀灭，证实本发明制备的含银抗菌剂scpb@ag-ldh具有良好的抗菌性能。
61.4.scpb@ag-ldh对感染性创面的修复功效
62.实验方法：
63.he染色步骤：将组织片进行如下步骤处理，a、脱蜡，脱蜡二甲苯ⅰ、ⅱ各10分钟，事先准备好盖玻片；b、覆水，100％(ⅰ、ⅱ)、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟
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3；c、苏木精染色5分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗；d、5％乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。e、返蓝：返蓝液，实验室没有，也可不用。f、伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。g、脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。h、滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。
64.组织处细菌数量评估,选取各组感染组织处，取样涂板至营养琼脂板上，然后计数，每组平行实验3组。
65.masson三色染色法步骤:a切片常规脱蜡至水；b用配制好的weigert铁苏木素染色液染色5min-10min；c充分水洗，如过染可盐酸酒精分化；d masson蓝化液返蓝3-5min，水洗；e蒸馏水洗1min；f丽春红品红染色液染色5-10min；g在上述操作过程中按蒸馏水：弱酸溶液＝2:1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min；h 1％磷钼酸溶液洗1-2min；i用配置好的弱酸工作液洗1min；j不经水洗直接放入苯胺蓝染色液中染色1-2min；k用配置好的弱酸工作液洗1min；l 95％乙醇快速脱水；m无水乙醇脱水3次，每次5-10s；n二甲苯透明3次，每次1-2min；o中性树胶封固。
66.免疫组化实验：a对应抗体如白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)标记组织切片；b染色反应；c显微观察。
67.利用金黄色葡萄球菌感染大鼠皮肤伤口，构建大鼠皮肤创面模型，在模型的创面上分别加入实施例1的含银抗菌剂scpb@ag-ldh、对比例1的水滑石粉体(ldh)和对比例2的含银水滑石粉体(ag-ldh)，并以pbs为对照。从图3可以看出，处理组scpb@ag-ldh、ldh和ag-ldh在整个试验过程中的皮肤伤口面积均小于pbs组。但是scpb@ag-ldh组的伤口修复速度最快，可能源于抗菌剂优异的缓释银离子的杀菌特性。
68.为了探讨其愈合过程的生物学机制，进一步按照上述方法进行了h&e、修复组织处细菌数量评估，masson三色染色和免疫组化实验。由图3的h&e染色结果可知(标尺：500μm)，第10天，scpb@ag-ldh组的真皮组织完全再生，浸润性炎症细胞较少。并且从修复组织处细菌涂板数据看(图4)，scpb@ag-ldh组处理的组织处细菌数量明显少于其他组。图5中使用masson三色染色来验证胶原纤维(蓝色)的形成(标尺：500μm)，结果显示，scpb@ag-ldh组的胶原纤维数量远高于pbs组的胶原纤维数量，也明显高于ldh和ag-ldh。如图6所示(标尺：500μm)，进一步对创面进行白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)免疫荧光染色，以更好地了解创面愈合进展。scpb@ag-ldh的il-6和tnf-α表达量最低，证实了本发明制备的含银抗菌剂的炎症调节效果最好，有效抑制感染性创面发生炎症。
69.此外，进一步对各组大鼠的肝脏和肾脏进行分析，由图7可知(标尺：1mm)，经过含银抗菌剂处理后的大鼠的器官和正常组一样，表明本发明制备的含银抗菌剂基本上没有深层次的副作用。
70.综合上述，这些实验结果证实了本发明制备的含银抗菌剂可以作为治疗细菌感染皮肤伤口的有前途的抗菌敷料。
71.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行
限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。