一种提取RNA的试剂盒及其应用的制作方法

技术特征：
1.一种提取rna的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：蛋白酶k、裂解结合液、磁珠、dna酶反应液、洗涤液、洗脱液；其中dna酶反应液包括dnase i、dnase i buffer,dnase i buffer包含水相、油相和乳化剂，油相占两相总体积的70％-90％，优选73-77％，最优选75％、乳化剂占两相总体积的0.5％-5％，优选0.5-2％，最优选1％。2.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，所述油相包括如下组分中的一种或多种：硅油及其衍生物、氟油及其衍生物；所述乳化剂包括如下组分中的一种或多种：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂。3.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，水相中包含peg。4.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，水相中含有2.5％-10％peg，优选4-6％，最优5％。5.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，水相还包含ph缓冲液、1-5mm mgcl2,优选2-3mm，最优2.5mm、0.25-0.75mm cacl2,优选0.4-0.6mm，最优0.5mm；所述ph缓冲液包括如下组分中的一种或多种：ph 7.5的10mm-50mm的naac-hac缓冲液、ph 7.5的10mm-50mm的tris-hcl缓冲液。6.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，dna酶反应液中dnase i为40u/-120u/ml，优选60-100u/ml，最优选75u/ml。7.根据权利要求1所述的提取rna的试剂盒，其特征在于，裂解结合液包括如下组分：离液盐、核酸助沉剂、核酸酶抑制剂、还原剂、表面活性剂、异丙醇、ph缓冲液；离液盐包括如下组分中的一种或多种：盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸钠，浓度为3-6m，进一步优选4-6m，最优5m；核酸助沉剂包括如下组分中的一种或多种：5％-20％peg，进一步优选6％-12％，最优10％、2-4m licl,进一步优选2.5-4m，最优3.2m、0.1-0.5mg/ml glycogen,进一步优选0.25-0.5mg/ml，最优0.4mg/ml、2-10μg/μl carrier rna,进一步优选3-8μg/μl，最优6μg/μl；核酸酶抑制剂包括如下组分中的一种或多种：5mm-50mm edta,进一步优选10mm-40mm，最优20mm、5mm-50mm egta,进一步优选10mm-40mm，最优20mm、0.5-10mm ata,进一步优选2mm-8mm，最优5mm、50mm-200mm甘油醛,进一步优选75mm-150mm，最优125mm、1mg/ml-5mg/ml naf,进一步优选2mg/ml-4mg/ml，最优3mg/ml；还原剂包括如下组分中的一种或多种：20mm-200mm三(2-羧乙基)膦盐酸盐,进一步优选50mm-150mm，最优125mm、2％-10％β-巯基乙醇,进一步优选3％-8％，最优5％、50-400mm dtt,进一步优选100mm-250mm，最优200mm；表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：tween 20、triton x-100、nonidet p40、brij35，含量1％-10％,进一步优选1％-5％，最优2％、异丙醇含量30-60％,进一步优选35％-55％，最优40％；ph缓冲液包括如下组分中的一种或多种：50mm-250mm ph6.6naac-hac缓冲液、50mm-250mm ph 6.6tris-hcl缓冲液,进一步优选100mm-200mm，最优200mm；溶剂为无rna酶水；其中磁珠包括羟基磁珠、羧基磁珠中至少一种；洗涤液分为洗涤液1和洗涤液2；洗涤液1包括如下组分：离液盐、乙醇、ph缓冲液、表面活性剂；离液盐包括如下组分中的一种或多种：盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸钠，浓度为1-4m,进一步优选2-3m，最优2.5m；乙醇含量30-60％,进一步优选40-55％，最优50％；ph缓冲液包括如下组分中的一种
或多种50mm-250mm ph6.6naac-hac缓冲液、50mm-250mm ph 6.6tris-hcl缓冲液,进一步优选50mm-100mm，最优50mm；表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：tween 20、triton x-100、nonidet p40、brij35，含量1％-10％，进一步优选1％-5％，最优1％；洗涤液2包括如下组分：70％-80％乙醇，最优80％、ph缓冲液、400-800mm的nacl，最优500mm；ph缓冲液包括如下组分中的一种或多种：10mm-50mm ph 7.5naac-hac缓冲液、10mm-50mm ph 7.5tris-hcl缓冲液，最优20mm；洗脱液包括如下组分：0.1％depc-treated water。8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在提取rna中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)将采集的样本至于离心管中，样本缓冲液体积150-250μl，然后加入18-22μl蛋白酶k，涡旋混匀；2)500-2000转/分钟低速离心至少5s后，加入250-350μl裂解结合液和18-22μl磁珠，振荡混匀，56℃裂解结合8-12min，期间颠倒混匀；3)500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸弃液体；4)加入550-650μl洗涤液1，振荡混匀至少1min；5)500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸弃液体；6)将dnase i和dnase i buffer按比例轻柔预混，加入预混液250-700μl，轻柔混匀后常温反应10-20min；500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管静置，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；加入550-650μl洗涤液1，振荡混匀至少1min；500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸弃液体；7)加入550-650μl洗涤液1，振荡混匀至少1min，500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸弃液体；8)加入550-650μl洗涤液2，振荡混匀；500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸弃液体；9)500-2000转/分钟低速离心至少5s后，将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心吸去全部液体；10)将离心管室温晾干3-5min；11)将离心管加入50-100μl洗脱液，振荡混匀，室温孵育至少5min，期间颠倒混匀；12)将离心管置于磁力架上静置2-5min至溶液完全澄清后，小心将上清液转移至一个新离心管中保存。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，提取rna的对象包括：细胞、组织、血液、尿液、宫颈拭子、口腔拭子、鼻咽拭子样本。

技术总结
本发明提供了一种提取RNA的试剂盒及其应用。本发明采用脱氧核糖核酸酶(DNase)在磁珠法提取过程中进行DNA消化，其反应环境既能满足脱氧核糖核酸酶(DNase)的最适反应环境需求；同时提供了磁珠吸附时的疏水性环境，保证核酸的得率；还通过加入一种油的乳化液增大提取操作时的总体积，以促进仪器自动化提取操作的便利性。所提取的RNA产量高、纯度高，该方法能够轻松实现仪器自动化提取。解决了临床实际应用过程中快速便捷的提取高纯度RNA的需求，极大地降低了高纯度RNA提取难度和提取成本，所提取的RNA能很好地适应于后续RT-PCR和RNA-seq应用。seq应用。


技术研发人员：徐根明 汤链 王永利 刘雅静 冯金儒 贺田芬
受保护的技术使用者：湖南大地同年生物科技有限公司
技术研发日：2022.11.08
技术公布日：2022/12/30