人参皂苷Rd在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用

2、il-18、nlrp3的蛋白水平升高也有显著的改善，表明人参皂苷rd对apit诱导的胆汁淤积型肝炎具有良好的抗炎作用，为临床治疗胆汁淤积性肝病提供更有利的药效学依据。
9.本发明还提供了一种预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物，包含有效含量的人参皂苷rd和药学上可接受的载体。本发明预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物可经本领域常规方法制备成适宜的剂型。优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、散剂、糖浆剂、丸剂、合剂或颗粒剂。
10.所述药学上可接受的载体包括但不限于填充剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、助悬剂、防腐剂、粘合剂等等，其用量为本领域常规用量。
11.本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：本发明提供了人参皂苷rd在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的新用途，通过建立异硫氰酸苯酯(apit)诱导大鼠急性胆汁淤积型肝炎模型，探讨人参皂苷rd对胆汁淤积性肝病的治疗效果及作用机制，结果显示，人参皂苷rd能够缓解胆汁淤积性肝病症状，主要表现为降低血清alt、alp、tbil、γ-gt水平，恢复胆汁排泄量，抑制肝脏炎症因子表达水平，为临床治疗胆汁淤积性肝病提供了一种疗效确切且副作用小的新的药物。
附图说明
12.图1为人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠病理学变化的影响。
具体实施方式
13.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
14.本发明实施例所采用的试药或试剂如下：人参皂苷rd（批号：s27663，购自上海源叶生物科技有限公司）；熊去氧胆酸（批号：s25093，购自上海源叶生物科技有限公司）；人参皂苷rd的剂量为6.25 mg/kg、12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg，给药剂量为20ml/kg。
15.人参皂苷rd为固体粉末状，人参皂苷rd的施用方法为：溶于总体积1%的dmso，震摇充分溶解后加水配置成0.3125 mg/ml、0.625 mg/ml、1.25 mg/ml、2.5 mg/ml的溶液。
16.急性胆汁淤积性肝病由异硫氰酸苯酯(apit)诱导（液态，每1ml含1.13g）由橄榄油稀释至110 mg/kg。
17.熊去氧胆酸作为阳药组，剂量为 50 mg/kg, 溶于总体积1%的dmso，震摇充分溶解后加蒸馏水配置成2.5 mg/ml的溶液。
18.下述各实验例证明本发明所述的技术效果。
19.实施例1：人参皂苷rd对胆汁淤积性肝病中的保护作用1、实验材料清洁级雄性sd大鼠，体重200
±
20g，由吴氏实验动物提供，在塑料笼具内分笼饲养，自由摄食与饮水7天，使其适应环境。
20.2、实验方法本实验例应用异硫氰酸苯酯(apit)建立大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型，研究
人参皂苷rd对该模型大鼠的治疗作用。
21.2.1实验分组大鼠36只，随机分为正常对照（con）组、模型（taa）组、熊去氧胆酸阳药（udca）组、人参皂苷rd6.25mg/kg给药组、人参皂苷rd12.5mg/kg给药组和人参皂苷rd25mg/kg给药组。
22.2.2给药方法各给药组按20ml/kg的剂量灌胃给药，正常对照组、模型组给予同等体积生理盐水，每天一次，给药6天，灌药第6天后除正常对照组外，其余各组大鼠均灌胃给予apit110mg/kg，所有大鼠在给予apit后8小时，进行胆排泄试验测定2h胆汁流量；然后，腹主动脉取血制备血清，取左叶肝脏置于10％甲醛溶液中固定备用。
23.3、实验数据检测与处理3.1检测指标3.1.1血清指标测定大鼠腹主动脉取血后，血液样本室温静止30min以上，3000rpm离心10min，然后取上清液得到血清样本。然后按照试剂盒说明书进行操作，检测各组血清中谷丙转氨酶（alt）、碱性磷酸酶（alp）水平、血清总胆红素(tbil)、谷酰转移酶(γ-gt)活性。
24.3.1.2肝病理组织学观察大鼠肝脏用10％中性甲醛固定，石蜡包埋，4-5μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，常规he染色，乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封固，使用显微镜观察。
25.3.1.3胆排泄实验大鼠腹腔注射乌拉坦1g/kg麻醉，胆总管插管，用预先称重并加入1mol/l的kh2po4100μl的离心管，冰块上收集胆汁。
26.3.2统计学分析采用spss26.0软件进行数据处理，统计方法选择单因素方差分析。
27.4.实验结果人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠血清生化指标的影响如表1所示，对胆汁排泄量的影响如表2所示，对胆汁淤积大鼠肝组织病理学变化的影响如图1所示。
28.表1人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠血清生化指标的影响人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠血清生化指标的影响###表示和正常对照组相比p《0.001，##表示和正常对照组相比p《0.01，***表示和模型对照组相比p《0.001，**表示和模型对照组相比p《0.01，*表示和模型对照组相比p《0 .05。
29.表2 人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠胆汁排泄量的影响人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠胆汁排泄量的影响###表示和正常对照组相比p《0 .001，**表示和模型对照组相比p《0.01，*表示和模型对照组相比p《0.05。
30.alt是反应肝功能的血清学标志，tbil、alp和γ-gt是肝内胆汁淤积的血清学标志。由表1和表2可知，模型组tbil、alp、γ-gt和alt活性明显升高，胆汁排泄量显著减少；由图1可知，模型组出现炎性浸润和肝细胞坏死现象；表明大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型造模成功。
31.并且由表1和表2可知，熊去氧胆酸和人参皂苷rd对apit诱导的胆汁淤积所导致的tbil、alt、alp和γ-gt活性升高有显著的抑制作用，对apit诱导的肝细胞损伤、炎症细胞浸润以及胆汁排泄量的抑制也有显著的改善。
32.5、实验结论人参皂苷rd对apit诱导的胆汁淤积型肝炎具有较好的治疗作用。
33.实施例2：人参皂苷rd对胆汁淤积性肝病中炎症指标的影响1、实验材料清洁级雄性sd大鼠，体重200
±
20g，由吴氏实验动物提供，在塑料笼具内分笼饲养，自由摄食与饮水7天，使其适应环境。
34.2、实验方法本实验例应用异硫氰酸苯酯(apit)建立大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型，研究人参皂苷rd对该模型大鼠的治疗作用。
35.2.1实验分组大鼠36只，随机分为正常对照（con）组、模型（taa）组、熊去氧胆酸（udca）组、人参皂苷rd12.5 mg/kg给药组、人参皂苷rd25 mg/kg给药组和人参皂苷rd 50mg/kg给药组。
36.2.2给药方法各给药组按20ml/kg的剂量灌胃给药，正常对照组、模型组给予同体积生理盐水，每天一次，给药6天，灌药第6天后除正常对照组外，其余各组大鼠均灌胃给予apit 110mg/kg，所有大鼠在给予apit8小时后处死，取肝脏用生理盐水冲洗净表面残留血液并用滤纸擦拭干净后，储存于-80℃备用。
37.3、实验数据检测与处理3.1检测指标3.1.1 rt-qpcr检测炎症因子mrna的表达程度取50-100 mg的大鼠肝组织，加入1mltrizol，用1 ml注射器反复抽提至均匀混悬，再依次加入氯仿、异丙醇、75%酒精并分别于12000 rpm，4℃离心后获得rna样本，使用紫外
分光光度仪器测量rna浓度，按照说明书要求配置逆转录体系，于逆转录仪器上制得cdna样本。按照说明书配置pcr反应体系（depc水2
µ
l、mix5
µ
l、上下游引物各1
µ
l、cdna1
µ
l）。
38.pcr扩增反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，退火60℃30s，40个循环。本研究使用相对定量方法，应用2－δδct分析数据。
39.3.1.23.2统计学分析采用spss26.0软件进行数据处理，统计方法选择单因素方差分析。
40.4.实验结果人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠肝脏中il-1β、il-6和tnf-αmrna水平的影响如表3所示，对胆汁淤积大鼠肝脏中炎性蛋白水平的影响如表4所示。
41.表3人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠肝脏中il-1β、il-6和tnf-αmrna水平的影响αmrna水平的影响###表示和正常对照组相比p《0.001，#表示和正常对照组相比p《0.05,***表示和模型对照组相比p《0.001，**表示和模型对照组相比p《0.01，*表示和模型对照组相比p《0.05。
42.表4人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠肝脏中炎性蛋白水平的影响人参皂苷rd对胆汁淤积大鼠肝脏中炎性蛋白水平的影响##表示和正常对照组相比p《0.01，#表示和正常对照组相比p《0.05,***表示和模型对照组相比p《0.001，*表示和模型对照组相比p《0.05。
43.nlrp3是参与炎症反应的关键调节因子，cox-2和inos是两种重要的炎性蛋白，il-18、il-1β、tnf-α和il-6是促炎因子，都可以参与炎症反应的发生和放大过程。由表3和表4可知，模型组il-1β、tnf-α和il-6mrna水平明显升高，inos、cox-2、il-18、nlrp3的蛋白水平明显升高，表明大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型中炎症水平升高。
44.并且由表3和表4可知，熊去氧胆酸和人参皂苷rd对apit诱导的胆汁淤积所导致的il-1β、tnf-α和il-6mrna水平升高有显著的抑制作用，对nos、cox-2、il-18、nlrp3的蛋白水平升高也有显著的改善。
45.5、实验结论人参皂苷rd对apit诱导的胆汁淤积型肝炎具有良好的抗炎作用。