一种华白及非共生萌发培养基及繁殖方法

1.本发明属于植物非共生萌发繁育技术领域，具体涉及一种华白及非共生萌发培养基及繁殖方法。


背景技术：

2.华白及(bletilla sinensis(rolfe)schltr.)为兰科白及属(bletilla)地生多年生草本植物，已被世界自然保护联盟(iucn)红色名录列为濒危物种，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)列为附录ⅱ物种，并在2013年评估公布的《中国生物多样性红色名录-高等植物卷》中被评估为濒危等级，野生种群及活体数量极少。华白及花型奇特、人为采挖严重，生境严重破坏、种群退化导致野外活体数量逐年减少，濒临灭绝，对华白及的抢救保育刻不容缓。
3.因兰科植物种子细小如尘，无胚乳，无法提供种子萌发成苗所必需的养分，在野外萌发率极低，种群自然更新缓慢。人工种苗繁育是兰科植物保育及产业化开发利用极为有效的措施。兰科植物人工种苗繁育常采用的方法为分株繁殖和种子无菌(非共生)繁殖，分株繁殖虽然操作简单，但鉴于野外活体数量极少，繁殖效率极低。对华白及非共生繁育方法的研究，能为华白及野外回归、复壮、重建保育和产业化规模化育苗提供技术支撑，在该方法下繁育的大量华白及种苗能储备该物种的基因并缓解濒危状况。
4.采用种子非共生萌发方法，是目前种苗快速繁育的一种方式，但使用不同的培养基，其内所含化学成分的种类和含量差异会使得种子萌发率及萌发时间有一定的差异。同时，不同的培养基在原球茎分化和幼苗成长中对苗的作用表现不同，有的会导幼苗褐化和白化、最终死亡。因此，通过大量实验筛选出种子萌发率高、原球茎能正常分化出叶、小苗不发生褐化、白化，最终幼苗能正常生长长大的培养基是华白及非共生萌发繁殖方法的关键。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种华白及种苗高效繁育方法以解决背景技术中华白及种苗繁育中存在的问题。
6.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种华白及非共生萌发培养基，所述培养基为改良kc培养基，所述改良kc培养基为：在kc基本培养基的基础上再加上10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉进行改良。
8.本发明还提供了一种华白及种苗高效繁育方法，包括以下步骤：
9.(1)华白及果荚消毒及种子处理；
10.(2)华白及非共生萌发及培养：将华白及种子播种至改良kc培养基上进行萌发，所述改良kc培养基为：在kc基本培养基的基础上再加上10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉进行改良；
11.(3)华白及幼苗继代培养：将华白及萌发培养后未褐化的幼苗长到3-4cm高时进行继代培养；
12.(4)华白及种苗移栽种植：华白及幼苗长到培养瓶盖顶时，即可炼苗出瓶移栽。
13.优选的，华白及果荚消毒方法为：0.1％升汞浸泡10分钟、大量灭菌水冲洗5次；5％次氯酸钠溶液浸泡10分钟、大量灭菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干表面水分；将果荚在酒精灯外焰快速烘烤10秒。
14.优选的，华白及非共生萌发及培养条件为：25
±
1℃的培养室中光照培养，光照强度为1000lx，光照时间4小时/天。
15.进一步的，继代培养使用的继代培养基为：改良kc培养基中活性炭的用量改为1000mg l-1
作为继代培养基。
16.优选的，继代培养条件为：温度25
±
1℃，光照强度为1000lx，光照时间14h/天。
17.进一步的，本发明还提供了华白及非共生培养后移栽种植的具体方法，步骤为：s1：炼苗；s2：根部杀菌：炼苗后将苗从培养瓶中取出，去除根部培养基后，使用杀菌剂进行杀菌消毒；s3：将消毒后的幼苗移栽至栽培基质中，并控制环境条件：温度：18-25℃，相对湿度60-80％，光照强度：1000-1500lx。
18.优选的，所述步骤s2中，所述杀菌消毒的具体方法为：使用2000倍的农用硫酸链霉素浸泡15min。
19.进一步的，所述步骤s3中，所述栽培基质为按体积比1:1:1配比的树皮(直径：9-12mm)、泥炭土、火山石(直径：1-2cm)混合基质。
20.优选的，所述栽培基质使用前用2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌。
21.本发明技术方案达到的效果：
22.华白及采用本发明中的培养基萌发率较高，萌发均在90％以上。在我们筛出来的改良kc培养基中，萌发率达到98％，种子播种后15天即可萌发、原球茎在分化、长苗和继代后均没有出现褐化死苗现象。该非共生萌发方法操作比较简单、不需要添加激素和添加物、成本低，播种7个月即能实现出瓶种植，大大缩短了育种周期。通过采用该方法和培养基配方，能在短期内获得大量华白及的种苗，为后续华白及的保育工作和产业化开发利用奠定基础。
附图说明
23.图1华白及果荚采摘状态图；
24.图2华白及果荚消毒处理后显示图；
25.图3华白及非共生萌发培养显示图；
26.图4华白及在培养基中褐化状态图；
27.图5华白及在改良kc培养基未褐化，正常生长苗状态图；
28.图6华白及幼苗继代培养状态图；
29.图7华白及幼苗培养过程中生根情况图；
30.图8华白及幼苗培养过程中苗的长势情况图；
31.图9华白及种苗出瓶移栽种植状态图。
具体实施方式
32.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以
充分地理解本技术的目的、特征和效果。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知技术将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
33.实施中所使用的试剂如中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
34.华白及迁地保护
35.2021年9月云南省林业和草原科学院兰花保育团队开展云南省兰科植物资源调查，在云南省镇康县发现了华白及bletilla sinensis的野外居群，这是时隔122年后华白及再次出现在世人面前。本次在镇康县调查发现的华白及居群，其种群数量不超过300株，仅发现2份种子，自然结实率相当低。为了对这一濒危物种进行保育繁育研究，按照国家重要野生植物种质资源库的技术规范和要求采集一棵带果荚的活体植株及2棵无果荚植株移植到国家重要野生植物种质资源库兰科植物保存中心的兰花温室进行迁地保护。后续繁殖研究所用种子即为迁地保护的在野外自然结实的种子。
36.实施例1
37.1、华白及迁地保护成效及果荚采收
38.2021年9月从镇康发现的华白及bletilla sinensis的居群中采集3棵华白及植株(一棵植株挂果)移植到兰科植物保存中心的兰花温室中作为种源进行迁地保护，经过三个多月的管护，3棵植株均成活，且植株状态良好。2021年11月23日，对已成熟且未开裂的果荚进行采摘(采摘时果夹状态如图1所示)，用于后续华白及种苗繁育研究(华白及开花时间为6-7月，在开花期自然结实的果荚，在11月进行采摘，时间大概为授粉后的4-5个月，即120-150天)。
39.2.华白及果荚及种子处理
40.将采摘下的果荚用大量自来水冲洗，用毛刷刷洗，在超净工作台中用灭菌水冲洗。将果荚按照下列程序进行消毒处理；0.1％升汞浸泡10分钟、大量灭菌水冲洗5次；5％次氯酸钠溶液浸泡10分钟、大量灭菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干表面水分；将果荚在酒精灯外焰快速烘烤10秒。将处理好的果荚(图2)放入无菌培养皿中暂时保存，播种时用无菌剪刀将果荚横向剪成两段，种子裸露出来，即可用于播种。
41.3.华白及种子非共生繁育培养基配方
42.改良b5培养基：在b5基本培养基的基础上再加上10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉进行改良。b5基本培养基配方如下：113.24mg l-1
无水氯化钙、150mg l-1
磷酸二氢钠、2500mg l-1
硝酸钾、134mg l-1
硫酸铵、122.09mg l-1
无水硫酸镁、27.8mg l-1
硫酸亚铁、37.3mg l-1
乙二胺四乙酸二钠、10.0mg l-1
硫酸锰、2.0mg l-1
硫酸锌、0.25mg l-1
钼酸钠、0.025mg l-1
氯化钴、3.0mg l-1
硼酸、0.75mg l-1
碘化钾、0.025mg l-1
硫酸铜、10.0mg l-1
维生素b1、1.0mg l-1
维生素b6、1.0mg l-1
烟酸、100.0mg l-1
肌醇、20000mg l-1
蔗糖、7000mg l-1
琼脂。
43.改良kc培养基：在kc基本培养基的基础上再加上10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉进行改良。kc基本培养基配方如下：1000mg l-1
四水硝酸钙、250mg l-1
磷酸二氢钾、500mg l-1
硫酸铵、250mg l-1
七水硫酸镁、25mg l-1
七水硫酸亚铁、7.5mg l-1
四水合硫酸锰、20000mg l-1
蔗糖、7000mg l-1
琼脂。
44.改良1/4ms培养基：在1/4ms基本培养基的基础上再加上10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉进行改良。1/4ms基本培养基配方如下：475mg l-1
硝酸钾、412.5mg l-1
硝酸铵、0.11mg l-1
氯化钙、0.2075mg l-1
碘化钾、2.15mg l-1
硫酸锌、0.00625mg l-1
氯化钴、6.95mg l-1
硫酸亚铁、0.5mg l-1
甘氨酸、0.125mg l-1
烟酸、25mg l-1
肌醇、42.5mg l-1
磷酸二氢钾、92.5mg l-1
硫酸镁、1.55mg l-1
硼酸、5.575mg l-1
硫酸锰、0.0625mg l-1
钼酸钠、0.00625mg l-1
硫酸铜、0.125mg l-1
盐酸吡哆醇、0.025mg l-1
盐酸硫胺素、9.325mg l-1
乙二胺四乙酸二钠、20000mg l-1
蔗糖、7000mg l-1
琼脂。
45.改良花宝1号培养基：在1000mg l-1
花宝1号(n:p:k＝7:6:19)溶液中加入20000mg l-1
蔗糖、7000mg l-1
琼脂、10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉。
46.改良花宝2号培养基：在1000mg l-1
花宝2号(n:p:k＝20:20:20)溶液中加入20000mg l-1
蔗糖、7000mg l-1
琼脂、10000mg l-1
椰子粉、500mg l-1
活性碳粉。
47.配制好的培养基ph值调节至5.6-5.8，在121℃高压灭菌20分钟。
48.5、华白及非共生萌发及培养
49.将华白及种子均匀的播撒到5种培养基表面(图3)，每瓶约50粒种子，每种培养基播撒5瓶。将培养瓶放在25
±
1℃的培养室中光照培养，光照强度为1000lx，光照时间4小时/天，记录种子萌发时间及萌发率。种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率以萌发种子数除以种子总数并乘以100。(播种时间：2021年11月24日)
50.表1华白及种子在不同培养基中萌发时间
[0051][0052][0053]
华白及种子播种后到第9天开始，就陆陆续续的有种子突破种皮萌发出来，5种培养基萌发时间差别不是很大，基本上在播种20天内都能萌发。以播种后第30天为统计种子萌发率的时间(表2)，华白及在5种培养基中的萌发率差别不大，基本都高于90％的萌发率，最高的达到98％的萌发率。根据实际萌发时间及萌发率情况来看，华白及种子在研究中的非共生培养基中极易萌发。
[0054]
表2华白及种子在不同培养基中萌发率(播种后30d)
[0055][0056]
华白及种子在5种培养基中萌发后均能分化出子叶，长出叶片。在播种后60天，幼苗长得密密麻麻，在不同培养基中，幼苗出现褐化枯死现象(图4)。在改良b5培养基、改良1/4ms培养基、改良花宝2号培养基中小苗均全部褐化枯死，在改良花宝1号培养基中有一半黄化枯死，在继续培养十多天后也全部褐化枯死。在改良kc培养基中，幼苗一直长得很健壮，没有出现褐化、黄化枯死现象(图5)，说明改良kc培养基比较适合华白幼苗的生长，过多或者过少的营养物质均会导致华白及幼苗褐化枯死。
[0057]
表3华白及幼苗在不同培养基中褐化枯死情况(播种后60d)
[0058][0059]
6、华白及幼苗继代培养
[0060]
未褐化的幼苗长到3-4cm高时，将华白及幼苗进行继代培养。培养条件为：温度25
±
1℃，光照1000lx，14h/天。将改良kc培养基中活性炭的用量改为1000mg l-1
作为继代培养的培养基。继代培养过程中球茎不断长成长状，当幼苗长到培养基盖顶时(如图6、7、8所示)，即可炼苗出瓶移栽。采用非共生萌发的方法、在改良kc培养基中，从播种后7个月左右，华白及种苗即可出瓶种植(研究中第一批出瓶种植时间为2022年6月27日)。
[0061]
7、华白及种苗移栽种植
[0062]
华白及幼苗长到培养基盖顶时，即可炼苗出瓶移栽。炼苗的程序为：将可出苗培养瓶从培养间拿到兰花大棚缓苗3-5天，然后拧松瓶盖，放置1-2天，打开一半瓶盖，放置2-3天，完全打开瓶盖放置1-2天即可将苗从培养瓶中拿出。去除苗根上的培养基，用大量水冲洗干净，后用2000倍的农用硫酸链霉素浸泡15min杀菌消毒，晾干水分后将种苗栽入事先准备好的栽培基质中。华白及栽培基质为以体积比1:1:1配比的树皮(直径：9-12mm)、泥炭土、火山石(直径：1-2cm)混合基质(用2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌)。华白及种植条件为：温度：18-25℃，相对湿度60-80％，光照强度：1000-1500lx。种植后的华白及按照事先放入缓释肥和基质发白喷洒水进行水肥管理，种植情况如图9所示，华白及种苗移栽90天后，种球成活率为99％。
[0063]
显然，以上所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。