一种脐带间充质干细胞冻存保护剂及冻存方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞冻存保护剂及冻存方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。脐带间充质干细胞是指存新生儿脐带组织中分离获得的一种多功能干细胞，它可以分化成多种功能细胞，具有易于获取、高度自我更新、多向分化潜能、弱免疫原性和不易衰老等特点，且具有间充质干细胞的所有特性，因此成为目前比较理想的干细胞来源。
3.脐带间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后虽然仍具有多向分化潜能，但是在连续培养过程中细胞会逐渐发生衰老和功能丧失，同时存在发生自发分化、交叉污染和污染的风险。为保证实验的连续性、稳定性和安全性，保存适宜数量的脐带间充质干细胞就显得尤为重要。在液氮中超低温冻存是脐带间充质干细胞保存的主要方法之一。脐带间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于液氮中进行长期冻存。冻存保护试剂的选择对冻存后细胞活率和活性的恢复尤为关键。
4.目前，常用的冻存保护液主要含有二甲基亚砜、胎牛血清和基础培养基。此外还有一些配方是在上述成分的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存脐带间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞活率低，增殖活性下降。因此，有必要研究一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，提高成分的安全性，提高脐带间充质干细胞冻存后的活性。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，经冻存后的细胞存活率高，活性好。
6.本发明的目的之二在于提供一种脐带间充质干细胞的冻存方法。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
8.一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，由基础培养基和添加在培养基中的以下成分组成：芝麻素8.5-12μg/ml、甲基丙烯酸羟乙酯4.5-6.5ng/ml、纳米碳化铌5.3-8.9ng/ml、谷氨酰胺10-15μg/ml、脯氨酸1-4mg/ml。
9.优先地，所述脐带间充质干细胞冻存保护剂由基础培养基和添加在培养基中的以下成分组成：芝麻素10.5μg/ml、甲基丙烯酸羟乙酯5.5ng/ml、纳米碳化铌7.2ng/ml、谷氨酰胺13μg/ml、脯氨酸2mg/ml。
10.优先地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
11.优先地，所述纳米碳化铌平均粒径为100nm。
12.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
13.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下过程：
14.(1)取基础培养基加入芝麻素、谷氨酰胺和脯氨酸，混合均匀，加入处于对数生长期的脐带间充质干细胞，在2-6℃预冷一段时间；
15.(2)向步骤(1)中加入甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌，以3-5℃/min降温至-80℃，在-80℃下保存24h后转移至液氮中。
16.优先地，步骤(1)中脐带间充质干细胞的密度为6-9
×
106个/ml。
17.优先地，步骤(1)中预冷处理10-15min。
18.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，保护剂中的芝麻素、谷氨酰胺和脯氨酸为冻存的脐带间充质干细胞复苏提供能量，有助于脐带间充质干细胞快速恢复活性。保护剂中的甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌对脐带间充质干细胞进一步起到保护作用，减少冻存过程中对细胞造成的不可逆的损伤，复苏后的细胞存活率高。上述各组分协同作用有效保障了脐带间充质干细胞经过冻存、复苏后细胞的存活率和增殖活性。
19.本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，以处于对数生长期的脐带间充质干细胞为保存对象，采用本发明提供的冻存保护剂，通过控制保护剂中各组分的添加时机，进一步提高脐带间充质干细胞冻存的效率。
附图说明
20.图1为本发明实施例1，对比例1至6中的脐带间充质干细胞随着保存时间的延长，细胞存活率的变化；
21.图2为本发明实施例1，对比例1至6中保存6个月的脐带间充质干细胞在复苏后，培养3天收集的细胞数量。
具体实施方式
22.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
23.实施例1
24.一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：芝麻素10.5μg/ml、甲基丙烯酸羟乙酯5.5ng/ml、平均粒径为100nm的纳米碳化铌7.2ng/ml、谷氨酰胺13μg/ml、脯氨酸2mg/ml。
25.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下过程：
26.(1)取dmem/f12培养基加入芝麻素、谷氨酰胺和脯氨酸，混合均匀，加入处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞的密度为7
×
106个/ml，在4℃预冷13min；
27.(2)向步骤(1)中加入甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌，分装在冻存管中，每管1ml，以4℃/min降温至-80℃，在-80℃下保存24h后转移至液氮中。
28.实施例2
29.一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：芝麻素8.5μg/ml、甲基丙烯酸羟乙酯4.5ng/ml、平均粒径为100nm的纳米碳化铌5.3ng/ml、谷氨酰胺10μg/ml、脯氨酸1mg/ml。
30.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下过程：
31.(1)取dmem/f12培养基加入芝麻素、谷氨酰胺和脯氨酸，混合均匀，加入处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞的密度为6
×
106个/ml，在2℃预冷10min；
32.(2)向步骤(1)中加入甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌，分装在冻存管中，每管1ml，以3℃/min降温至-80℃，在-80℃下保存24h后转移至液氮中。
33.实施例3
34.一种脐带间充质干细胞冻存保护剂，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：芝麻素12μg/ml、甲基丙烯酸羟乙酯6.5ng/ml、平均粒径为100nm的纳米碳化铌8.9ng/ml、谷氨酰胺15μg/ml、脯氨酸4mg/ml。
35.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下过程：
36.(1)取dmem/f12培养基加入芝麻素、谷氨酰胺和脯氨酸，混合均匀，加入处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞的密度为9
×
106个/ml，在6℃预冷15min；
37.(2)向步骤(1)中加入甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌，分装在冻存管中，每管1ml，以5℃/min降温至-80℃，在-80℃下保存24h后转移至液氮中。
38.对比例1
39.对比例1和实施例1的区别为：省去保护剂中的芝麻素，其余均和实施例1相同。
40.对比例2
41.对比例2和实施例1的区别为：省去保护剂中的甲基丙烯酸羟乙酯，其余均和实施例1相同。
42.对比例3
43.对比例3和实施例1的区别为：省去保护剂中的纳米碳化铌，其余均和实施例1相同。
44.对比例4
45.对比例4和实施例1的区别为：省去保护剂中的甲基丙烯酸羟乙酯，将纳米碳化铌的用量调整为12.7ng/ml，其余均和实施例1相同。
46.对比例5
47.对比例5和实施例1的区别为：省去保护剂中的纳米碳化铌，将甲基丙烯酸羟乙酯的用量调整为12.7ng/ml，其余均和实施例1相同。
48.对比例6
49.对比例6和实施例1的区别为：取dmem/f12培养基加入芝麻素、谷氨酰胺、脯氨酸、甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌，混合均匀，加入处于对数生长期的p3代脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞的密度为7
×
106个/ml，在4℃预冷13min，分装在冻存管中，每管1ml，以4℃/min降温至-80℃，在-80℃下保存24h后转移至液氮中，其余均和实施例1相同。
50.将实施例1，对比例1至6中冻存的细胞，分别在冻存前(冻存0个月)、冻存1个月、3
个月、6个月后取出三管，在37℃的水浴中迅速复苏，然后用台盼蓝染色法统计细胞总数以及活细胞的数量，计算各组细胞的存活率(取三管的平均值)，结果如图1所示。
51.由图1可以看出实施例1，对比例1至6中的脐带间充质干细胞随着保存时间的延长，脐带间充质干细胞的存活率呈降低趋势，但是不同组别的细胞存活率降低趋势的大小不同。如实施例1中的脐带间充质干细胞在保存6个月后细胞存活率在90％以上，但是在相同的保存时间下，对比例1至6中的脐带间充质干细胞存活率均不及实施例1。
52.对比例1中省去了芝麻素，脐带间充质干细胞在液氮中保存6个月后细胞存活率为84.73％，低于实施例1。说明芝麻素的添加有助于脐带间充质干细胞维持冻存后的存活率。对比例2至5中分别省去了甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌中的一种，或者在省去其中一种后增加了另一成分的用量，随着保存时间的延长细胞存活率下降显著，不及实施例1，说明保护剂中的甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌对脐带间充质干细胞起到保护作用，减少冻存过程中对细胞造成的不可逆的损伤，复苏后的细胞存活率高。对比例6中调整了冻存方法，将甲基丙烯酸羟乙酯和纳米碳化铌和其他成分一起加入培养基中，然后接种细胞，由图1可以看出，对比例6的细胞存活率高于对比例1至5，但是不及实施例1，说明本发明的冻存过程可以进一步降低冻存对细胞造成的损伤，提高细胞的存活率。
53.分别取实施例1，对比例1至6中冻存6个月的脐带间充质干细胞在37℃的水浴中迅速复苏，离心去除冻存保护剂，pbs冲洗后加入培养基(含10％fbs的dmem/f12培养基)重悬，调整细胞密度为1
×
104个/ml，接种于12孔板中，每孔添加1ml培养基，在37℃，5％co2的培养箱中培养3天，用台盼兰染色进行细胞计数，结果图2所示。
54.由图2可以看出，不同组别的细胞经过相同的培养时间后得到的脐带间充质干细胞数量不同。实施例1中经培养得到的细胞数量最多，高于对比例1至6，说明实施例1中的脐带间充质干细胞的增殖活性最好。对比例1至5中调整了冻存保护剂的组成，对比例6中调整了冻存过程，冻存后脐带间充质干细胞的增殖活性均有不同程度的下降。
55.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。