丹参酮IIA在抑制HPV16感染中的应用

丹参酮iia在抑制hpv16感染中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及丹参酮iia在抑制hpv16感染中的应用。


背景技术：

2.人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)是环状双链dna病毒，有研究表明，99.8％的宫颈癌标本中有高危型hpv dna存在，有超过80％处于育龄期性生活频繁的女性存在高危hpv感染，大多数感染可自行消退，10％的可持续感染，1％可发展为宫颈癌，随着目前临床对宫颈癌的发生与宫颈高危hpv感染的相关性的深入探讨与研究，如何有效预防hpv感染，防止其进一步发展为宫颈癌，引发相关领域人员的持续关注。
3.hpv对子宫颈等处的复层鳞状上皮具有高度组织嗜性。病毒颗粒通过女性生殖道上皮的微小创口进入组织，只有通过感染复层鳞状上皮的基底细胞才能完成其完整生命周期，产生新的hpv病毒颗粒进入再感染过程，通过感染
‑‑
释放
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再感染的循环，造成持续感染。在持续感染期间，高危型hpv的dna经常整合到宿主细胞的基因组中，最终可导致宿主细胞的恶性转化。然而目前针对hpv持续性感染并无有效药物，临床策略以随访观察为主，给患者造成极大的心理负担，也容易导致过度治疗，增加社会卫生经济压力。因此，有必要研究开发hpv感染宿主细胞的抑制剂，为阻断hpv持续感染发展为宫颈癌前病变和宫颈癌的疾病进程提供干预手段，有助于推进宫颈癌等hpv相关肿瘤的早期防治。
4.丹参为唇形科鼠尾草属植物，以干燥根及根茎入药，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的作用。丹参的根(roots of salvia miltiorrhiza bunge,lamiaceae)被广泛应用于临床治疗。丹参的主要成分可根据结构特点分为两类：第一类含有水溶性多酚化合物，如丹酚酸b(salvianolic acid b,sal b)、丹酚酸a(salvianolic acid b,sal a)和丹参素。第二类包含亲油性化学物质，如丹参酮i(tanshinone i,tan i)、丹参酮iia(tanshinone iia,tan iia)、隐丹参酮(cryptotanshinone)和二氢丹参酮(dihydrotanshinone)。其中，丹参酮为丹参根部的乙醚或乙醇提取物,而丹参酮ⅱa是主要的丹参脂溶性有效成分，《中国药典》2020年版将其作为丹参提取物的质量控制指标之一。多年来丹参酮ⅱa广泛应用于各种人类疾病的治疗策略中，包括心血管疾病、神经系统疾病、免疫调节、抗感染、抗肿瘤等方面。同时，丹参酮iia也具有一定的抗病毒作用。那么丹参酮iia能否抑制高危型hpv(例如hpv16)的感染，目前尚未有此方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出丹参酮iia在抑制hpv16感染中的应用，试验发现，丹参酮iia可通过下调wnt/β-catenin通路抑制hpv16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依赖性，故丹参酮iia可用于制备hpv16感染的抑制剂。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.本发明提供丹参酮iia在抑制hpv16感染中的应用。
8.作为本发明的进一步改进，所述丹参酮iia的结构式如式i所示：
[0009][0010]
作为本发明的进一步改进，所述丹参酮iia在抑制hpv16感染宿主细胞中的应用。
[0011]
作为本发明的进一步改进，所述宿主细胞包括人永生化角质形成细胞系hacat细胞。
[0012]
作为本发明的进一步改进，所述丹参酮iia在制备抑制hpv16感染的药物中的应用。
[0013]
作为本发明的进一步改进，所述丹参酮iia的抑制作用具有时间依赖性。
[0014]
作为本发明的进一步改进，所述丹参酮iia的抑制作用具有浓度依赖性。
[0015]
第一，通过丹参酮iia作用于hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的效应实验发现，丹参酮iia可抑制hpv16-gfp假病毒感染hacat细胞。
[0016]
第二，通过丹参酮iia作用于hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的时效实验发现，丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染hacat细胞具有时间依赖性。
[0017]
第三，通过丹参酮iia作用于hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验发现，丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有时间依赖性。
[0018]
第四，通过丹参酮iia作用于hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的量效实验发现，丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染hacat细胞具有浓度依赖性。
[0019]
第五，通过丹参酮iia作用于hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的量效实验发现，丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有浓度依赖性。
[0020]
第六，通过体外人永生化角质形成系hacat细胞实验发现，丹参酮iia通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制hpv16-gfp假病毒感染hacat细胞。
[0021]
由此可以判定，丹参酮iia可通过下调wnt/β-catenin通路抑制hpv16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依耐性，故丹参酮iia可用于制备hpv16感染的抑制剂。
[0022]
本发明具有如下有益效果：
[0023]
1.经过长期大量的试验发现，丹参酮iia可通过下调wnt/β-catenin通路抑制hpv16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依耐性，故丹参酮iia可用于制备hpv16感染的抑制剂。
[0024]
2.本发明发现了丹参酮iia的新应用，为提升丹参的开发利用提供了参考价值；同时，丹参酮iia为天然植物成分，具有良好的生物利用度，而在丹参中含量丰富，毒副作用偏小，来源广泛，在医疗领域具有广阔的应用前景。
[0025]
3.本发明为高危型hpv持续感染的治疗提供了新方法和新思路，推动了医学进步。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为本发明的实施例1免疫荧光显微镜镜下观察丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞。
[0028]
图2为本发明的实施例1流式荧光分选检测到丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞。与对照组结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
[0029]
图3为本发明的实施例2丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的时间效应图。与0h结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
[0030]
图4为本发明的实施例3丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时间效应图。与0h结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
[0031]
图5为本发明的实施例4丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的浓度效应图。与对照组结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
[0032]
图6为本发明的实施例5丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的浓度效应图。与对照组结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
[0033]
图7为本发明的实施例6丹参酮iia抑制人永生化角质形成细胞系hacat细胞wnt/β-catenin通路的效应图。与对照组结果对比，*表示p＜0.05差异显著，**表示p＜0.01差异极显著。
具体实施方式
[0034]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
在美国atcc细胞库购买的人永生化角质形成细胞系hacat细胞。hacat细胞培养条件为：dmem高糖培养基(atcc) 10％胎牛血清(gibco),37℃，5％二氧化碳，ph值7.2-7.4，无菌恒温培养。细胞特性：该细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性，贴壁生长。
[0036]
在mce公司购买的丹参酮iia(目录号:hy-n0135。cas号：568-72-9)，分子量294.34，分子式c
19h18
o3，纯度99.74％。所述丹参酮iia的结构式如式i所示：
[0037][0038]
实施例1：丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞
[0039]
在人永生化角质形成细胞hacat细胞中，加入20μm丹参酮iia(实例1-6中均为储存液(dmso:100mg/ml)溶解)；作用8h，moi＝100的hpv16-gfp假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染情况。
[0040]
由图1可知，免疫荧光显微镜镜下观察到丹参酮iia作用后可降低hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染率。由图2可知，流式荧光分选检测到丹参酮iia作用后可降低hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染率(感染率下降79.77％)。由此可知，丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞。
[0041]
实施例2：丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞系hacat细胞的时效实验
[0042]
在人永生化角质形成细胞hacat细胞中，加入10μm丹参酮iia。分别作用0h、1h、2h和4h后，moi＝100的hpv16-gfp假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染情况。
[0043]
由图3可知，丹参酮iia分别作用1h、2h和4h后，hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染率依次下降9.45％、62.11％和73.39％。由此可知，丹参酮iia对hpv16-gfp假病毒感染hacat细胞的抑制效果具有时间依赖性。
[0044]
实施例3：丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验
[0045]
在原代人宫颈上皮细胞中，加入10μm丹参酮iia。分别作用0h、1h、2h和4h后，moi＝100的hpv16-gfp假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染情况。
[0046]
由图4可知，丹参酮iia分别作用1h、2h和4h后，hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染率依次下降11.90％、39.63％和57.72％。由此可知，丹参酮iia对hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。
[0047]
实施例4：丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染人永生化角质形成细胞hacat细胞的浓度效应实验
[0048]
在人永生化角质形成细胞hacat细胞中，分别加入0μm、1μm、5μm和10μm丹参酮iia。分别作用4h后，moi＝100的hpv16-gfp假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后
分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染情况。
[0049]
由图5可知，1μm、5μm和10μm丹参酮iia作用后，hpv16-gfp假病毒对hacat细胞的感染率依次下降4.50％、62.44％和72.23％。由此可知，丹参酮iia对hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。
[0050]
实施例5：丹参酮iia抑制hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞细胞的浓度效应实验
[0051]
在原代人宫颈上皮细胞中，分别加入0μm、1μm、5μm和10μm丹参酮iia。分别作用4h后丹参酮iia。分别作用4h后，moi＝100的hpv16-gfp假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测hpv16-gfp假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染情况。
[0052]
由图6可知，1μm、5μm和10μm丹参酮iia作用后，hpv16-gfp假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染率依次下降8.99％、53.61％和67.84％。由此可知，丹参酮iia对hpv16-gfp假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有浓度依赖性。
[0053]
实施例6：人永生化角质形成细胞hacat细胞内丹参酮iia可下调wnt/β-catenin信号通路
[0054]
在人永生化角质形成细胞hacat细胞中，分别加入10μm丹参酮iia和0.5μm wnt通路抑制剂iwp-2，作用4h后，使用rt-qpcr检测β-catenin的表达水平。
[0055]
由图7可知，与对照组相比，丹参酮iia组(10μm，4h)和wnt通路抑制剂iwp-2组(0.5μm，4h)的hacat细胞中β-catenin的表达水平显著下降。由此可知，丹参酮iia可下调人永生化角质形成细胞hacat细胞的wnt/β-catenin信号通路。
[0056]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。