一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法与流程

1.本发明属于外泌体检测分析领域，尤其是涉及一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法。


背景技术：

2.外泌体是细胞分泌的脂质双层结构囊泡，直径约为30~150nm，外泌体广泛存在于唾液、细胞培养液、乳液、血液及尿液等多种体液中，由于外泌体存在于多种复杂的生物环境中，不同来源甚至是同一来的外泌体在形态和生化特性方面都有着极大差异源。外泌体在疾病诊断和治疗领域有着广阔的应用前景，获得较高纯度和质量的外泌体是科研及应用的关键要素，因此建立更准确而高效的评价外泌体纯度的方法显得至关重要。
3.目前评价外泌体纯度的方法有多种多样，对于外泌体纯度分析并没有统一的标准，有蛋白/颗粒法、q-pcr法、纳米颗粒跟踪分析法等。蛋白/颗粒法和q-pcr法检测方法耗费时间过长、样品配制方式复杂，不适用于多批次大量检测；而纳米颗粒跟踪分析法虽然检测时间并不长，但是只能测定部分标记的的外泌体，未标记的外泌体纯度无法测定，准确度不高，因此存在一定的局限性。
4.液相色谱仪根据其分离模式不同可以分为反相色谱、正相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱。尺寸排阻法是液相色谱仪常用的检测方法，尺寸排阻色谱柱里面填充着一定分子孔径的填料，当样品流经色谱柱时，大粒径的颗粒率先流出色谱柱，小颗粒的样品后流出，因此可以达到不同粒径颗粒的分离效果，但是无法分析出与主成分物质颗粒大小相近的杂质。
5.外泌体是带有电荷的，外泌体的负电荷是由于其表面分子带负电荷导致的，离子色谱法被广泛应用于不同电荷分子的分离，这些分子与色谱柱结合时被捕捉，大量富集在离子色谱柱上然后采用流动相将外泌体洗脱出来，但是同样带电情况的杂质无法分析出来，这是单纯离子色谱法的局限性。
6.现有评价外泌体纯度的方法中，例如，专利《一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法》采用q-pcr法测定外泌体纯度，q-pcr法对人员操作专业性要求更高，且实验过程繁琐、耗时长、易污染；专利《从脐带间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法》其中采用纳米颗粒跟踪分析法测定测定纯度，此方法只能测定部分标记的的外泌体，例如cd63、cd9、cd81等，但是未标记的外泌体纯度无法测定，因此存在一定的局限性。蛋白/颗粒法需要分别检测蛋白浓度和颗粒数，需要结合两种检测方法的结果，检测时间较长。q-pcr法同样检测过程时间较长，易污染，且对人员专业操作要求高。纳米颗粒跟踪分析法只能测定部分标记的的外泌体，但是未标记的外泌体纯度无法测定，因此存在一定的局限性。由于传统液相存在的不足（如果主峰和杂质峰分离度较低或者重合无法进行分析），外泌体如果采用液相方法检测纯度就需要克服这一大难题。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明提供一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法。
8.本发明采用的技术方案是：一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法，通过二维液相色谱评价外泌体纯度；第一维采用尺寸排阻色谱柱，流动相等度洗脱；第二维采用离子色谱柱，流动相梯度洗脱。
9.优选地，先通过第一维液相色谱对外泌体样本首次分析，再切换六通阀对外泌体主峰进行中心切割进入第二维液相色谱。
10.优选地，第一维液相色谱流动相为tris缓冲液，ph值为7-7.5，优选ph值为7.2；第二维液相色谱流动相a为tris缓冲液，第二维液相色谱流动相b为tris缓冲液-盐溶液；流动相a和流动相b的ph值为7-7.5，优选ph值为7.2。
11.优选地，tris缓冲液浓度为20mm，盐溶液为nacl溶液，nacl盐浓度为1.0m。
12.优选地，第一维流动相洗脱条件为等度洗脱，流动相流速为0.3-0.6 ml/min；液相六通阀切换阀时间分别为3-3.8min。
13.优选地，第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流动相流速为0.3ml/min，包括多余两个的固定值洗脱阶段；包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-75%流动相a；5.0-5.1min，75-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-55%流动相a；6.2-7.2，55%流动相a；7.2-7.3min，55-45%流动相a；7.3-8.3min，45%流动相a；8.3-8.4min，45-35%流动相a；8.4-9.4min，35%流动相a；9.4-9.5min，35-15%流动相a；9.5-10.5min，15%流动相a；10.5-10.6min，15-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。
14.优选地，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为阴离子交换色谱柱为bia deae-0.1 analytical column，1.3μm。
15.优选地，在所得图谱中，根据峰面积归一化法分别计算第一维液相色谱和第二维液相色谱中外泌体纯度，二者的乘积即为所检测外泌体样本的纯度。
16.本发明具有的优点和积极效果是：本纯度评价方法操作简单，自动化水平高，占用时间短，准确度高，适合大批样品同时检测，尤其适合未来外泌体大规模工业化生产的纯度评价工作，高效且过程可控。
附图说明
17.图1是本发明实施例1的液相色谱图；图2是本发明实施例2的液相色谱图；图3是本发明实施例3的液相色谱图；图4是本发明实施例4的液相色谱图；图5是本发明二维液相六通阀管路示意图。
具体实施方式
18.二维液相色谱是将分离机理不同的两支色谱柱串联起来的系统，样品经过第一维的色谱柱和检测器后，通过捕集或切割后切换进入第二维色谱柱和检测器中。在一维分离系统中不能完全分离的组分，在二维系统中可以更好地分离。柱切换模式可以分为全二维和中心切割，中心切割技术可以只将需要二次分析的部分进入到第二维中进一步分析。因
此，开发一种二维液相评价外泌体的方法可以明显提高针对外泌体纯度分析的准确度，对于未来外泌体工业化生产的质量控制提供一种更适宜的方法。
19.本发明通过二维液相色谱仪采用尺寸排阻法和离子交换色谱法结合的方法来评价外泌体纯度。尺寸排阻法利用的物质颗粒大小不同进行分析，由于样品内物质颗粒大小不同，在检测器会反映出不同颗粒大小的出峰时间不同，明显远离主峰的色谱峰为杂质峰，以此来区分杂质。离子交换色谱法利用弱阴离子色谱柱可以特异性捕集带负电荷的物质，而外泌体在近中性流动相条件下带负电荷，外泌体可以在弱阴离子色谱柱上捕集后通过第二维流动相梯度洗脱，进入检测器进行二次分析。
20.传统液相只能单独采用某一种色谱方法进行分析，单独使用尺寸排阻色谱法无法分析出和外泌体颗粒大小相近的杂质，而单独使用离子交换色谱法又无法将主峰和牛血清白蛋白等杂质分析出来，因此，我们创造性地采用二维液相将尺寸排阻法和离子交换色谱法结合起来采用中心切割测定外泌体纯度，如图5所示为二维液相六通阀管路，通过二维液相进行分析评价，可以更准确地测定外泌体纯度。第一维的纯度计算是初步纯度计算，第二维将第一维主峰部分的“纯外泌体”再进行第二次分析，通过两个维度的综合分析，实现对样本更为准确的判断。
21.样品首先进入液相色谱仪第一维的尺寸排阻色谱柱，采用第一维液相的流动相等度洗脱，使外泌体进入检测器进行首次分析。再通过切换液相色谱仪的六通阀，对外泌体主峰部分进行中心切割进入第二维的离子色谱柱对其进行捕捉收集，之后通过第二维的流动相梯度洗脱进入检测器进行第二次分析。二维液相六通阀管路如图5所示。
22.实施时，将外泌体样本通过二维液相色谱评价外泌体纯度，使用二维液相色谱仪；第一维采用尺寸排阻色谱柱，流动相等度洗脱；第二维采用离子色谱柱，流动相梯度洗脱。先通过第一维液相色谱对外泌体样本首次分析，再切换六通阀对外泌体主峰进行中心切割进入第二维液相色谱。第一维液相色谱流动相为tris缓冲液；第二维液相色谱流动相a为tris缓冲液，第二维液相色谱流动相b为tris缓冲液-盐溶液，tris缓冲液浓度为20mm，盐溶液为nacl溶液，nacl盐浓度为1.0m；流动相a和流动相b的ph值为7.2。
23.本发明某些实施例中，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为阴离子交换色谱柱为bia deae-0.1 analytical column，1.3μm。
24.第一维流动相洗脱条件为等度洗脱，流动相流速为0.3-0.6 ml/min，优选为0.5 ml/min，液相六通阀切换阀时间分别为3-3.8min，其中流动相流速和六通阀切换时间呈反比，流速较快时，可采用较短的切换时间，流速较慢时，可洗脱较长时间后再切换，其目的在于，保证外泌体所在峰型能够完整体现。第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流动相流速为0.3ml/min，包括多余两个的固定值洗脱阶段；包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-75%流动相a；5.0-5.1min，75-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-55%流动相a；6.2-7.2，55%流动相a；7.2-7.3min，55-45%流动相a；7.3-8.3min，45%流动相a；8.3-8.4min，45-35%流动相a；8.4-9.4min，35%流动相a；9.4-9.5min，35-15%流动相a；9.5-10.5min，15%流动相a；10.5-10.6min，15-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。
25.液相纯度分析采用面积归一化法，外泌体主峰纯度为主峰峰面积占全部峰面积的百分比，在所得图谱中，根据峰面积归一化法分别计算第一维液相色谱和第二维液相色谱中外泌体纯度，二者的乘积即为所检测外泌体样本的纯度。如，第一维中外泌体主峰纯度为
a，第二维中外泌体主峰纯度b是对第一维主峰部分的二次分析，其外泌体最终纯度为a
×
b。
26.专利《一种分析外泌体电荷异质性的方法》公开一种根据外泌体电荷异质性分离得到外泌体亚群的方法，本发明为在此专利基础上的更深入研究。舍去了保护剂以节省成本并简化流动相配制。该发明方案中采用离子色谱法，带有同样负电荷的杂质在液相的出峰时间可能会与外泌体主峰重合，无法更准确测定外泌体纯度；例如，根据我们后续实验发现，牛血清白蛋白作为工艺中可能出现的杂质，在离子交换色谱法中液相色谱图中，其牛血清白蛋白会与外泌体其中一个峰的保留时间相同，因此单独使用离子交换色谱法对于更准确地测定外泌体纯度的专属性不适用。而本发明采用尺寸排阻法结合离子色谱法的二维液相方法可以弥补这种不足，本发明方法中样品首先通过尺寸排阻色谱柱，可以根据颗粒大小在液相色谱图上表现出外泌体主峰及杂质峰；例如，根据实验结果表明，牛血清白蛋白在尺寸排阻法中出峰时间与外泌体主峰的时间可以明显区分开，之后再通过二维液相只将主峰部分样品中心切割进入离子色谱柱，将在尺寸排阻法中所谓的“纯外泌体”部分进行二次分析，通过带电量不同可以分析出尺寸排阻法无法分析出的杂质，使纯度测定更为准确，更准确地确定图谱中各组分的相对含量。而且本发明相对于之前的专利，由于变更了先使用尺寸排阻法、不使用保护剂且只将尺寸排阻法中外泌体主峰部分再通过离子色谱法分析，尺寸排阻法与离子色谱法使用的流动相为不同流动相系统方式，这使得其分出了五个组分，不同于之前专利的六个组分，且通过开发液相方法使其不同组分的峰离得更远，便于更准确、更完整地收集不同馏分。
27.不同种类的外泌体或者其不同制备工艺的外泌体有其不同的专属性，需要根据外泌体种类和特异性进行选择更为适合的方法。
28.下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
29.实施例1：二维液相色谱仪为waters acquity uplc plus bio，采用尺寸排阻法结合离子交换色谱法分析牛奶外泌体纯度，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为弱阴离子色谱柱，bia deae-0.1 analytical column，1.3μm；进样量为25μl，柱温25℃，检测波长280nm，样品仓6℃；第一维流动相和第二维流动相a均使用20mm的tris缓冲液（ph 7.2），第二维流动相b为20mm的tris，1m nacl溶液（ph 7.2）。
30.第一维流动相洗脱条件为流动相a等度洗脱，流速为0.5ml/min；第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流速为0.3ml/min，包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-75%流动相a；5.0-5.1min，75-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-55%流动相a；6.2-7.2min，55%流动相a；7.2-7.3min，55-45%流动相a；7.3-8.3min，45%流动相a；8.3-8.4min，45-35%流动相a；8.4-9.4min，35%流动相a；9.4-9.5min，35-15%流动相a；9.5-10.5min，15%流动相a；10.5-10.6min，15-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。二维液相切换阀时间为3.5min。
31.结果如图1所示，0-3.5min为第一维尺寸排阻法色谱图，3.5-12min为第二维离子交换色谱法色谱图，根据峰面积归一化法，在第一维中外泌体纯度为74.15%，在第二维中外泌体纯度为99.22%，外泌体最终纯度则为74.15%
×
99.22%=73.57%。对于第一维和第二维都
检测出杂质，色谱图峰型和每个峰之间的分离度良好，纯度检测仅需要12分钟，高效快捷。从图1结果也能够看出，第二维离子交换色谱中能够体现第一维离子交换色谱无法分辨的杂质。
32.实施例2：二维液相色谱仪为waters acquity uplc plus bio，采用尺寸排阻法结合离子交换色谱法分析已进行纯化后的牛奶外泌体纯度，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为弱阴离子色谱柱，bia deae-0.1 analytical column，1.3μm；进样量为25μl，柱温25℃，检测波长280nm，样品仓6℃；第一维流动相和第二维流动相a均使用20mm的tris缓冲液（ph 7.2），第二维流动相b为20mm的tris，1m nacl溶液（ph 7.2）。
33.第一维流动相洗脱条件为流动相a等度洗脱，流速为0.5ml/min；第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流速为0.3ml/min，包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-75%流动相a；5.0-5.1min，75-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-55%流动相a；6.2-7.2min，55%流动相a；7.2-7.3min，55-45%流动相a；7.3-8.3min，45%流动相a；8.3-8.4min，45-35%流动相a；8.4-9.4min，35%流动相a；9.4-9.5min，35-15%流动相a；9.5-10.5min，15%流动相a；10.5-10.6min，15-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。二维液相切换阀时间为3.5min。
34.结果如图2所示，第一维尺寸排阻法色谱图和第二维离子交换色谱法色谱图中均无杂质峰出现；本实施例为对纯化后的外泌体样本进行评价，样品纯度为100%，可作为“标准品”色谱图，能够直观对比其他实施例中杂质出现的位置。
35.实施例3：二维液相色谱仪为waters acquity uplc plus bio，采用尺寸排阻法结合离子交换色谱法分析牛奶外泌体纯度，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为弱阴离子色谱柱，bia deae-0.1 analytical column，1.3μm；进样量为25μl，柱温25℃，检测波长280nm，样品仓6℃；第一维流动相和第二维流动相a均使用20mm的tris缓冲液（ph 7.2），第二维流动相b为20mm的tris，1m nacl溶液（ph 7.2）。
36.采用与实施例一相同的牛奶外泌体作为样品，第一维流动相洗脱条件为流动相a等度洗脱，流速为0.5ml/min；第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流速为0.3ml/min，包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-70%流动相a；5.0-5.1min，70-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-60%流动相a；6.2-7.2min，60%流动相a；7.2-7.3min，60-50%流动相a；7.3-8.3min，50%流动相a；8.3-8.4min，50-40%流动相a；8.4-9.4min，40%流动相a；9.4-9.5min，40-20%流动相a；9.5-10.5min，20%流动相a；10.5-10.6min，20-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。二维液相切换阀时间为3.8min。
37.结果如图3所示，0-3.8min为第一维尺寸排阻法色谱图，3.8-12min为第二维离子交换色谱法色谱图，根据峰面积归一化法，在第一维中外泌体纯度为73.97%，在第二维中外泌体纯度为100.00%，外泌体最终纯度则为74.15%
×
100.00%=73.97%；第二维未检测到杂质。与实施例1比较，本实施例第二维流动相采用了不同的梯度洗脱条件，能够看出，流动相盐浓度对于液相色谱仪的检测有较大影响。
38.实施例4：
二维液相色谱仪为waters acquity uplc plus bio，采用尺寸排阻法结合离子交换色谱法分析与实施例2相同的已进行纯化后的牛奶外泌体纯度，尺寸排阻色谱柱为waters beh 450
ǻ sec，2.5μm，4.6
×
150mm；离子交换色谱柱为弱阴离子色谱柱，bia deae-0.1 analytical column，1.3μm；进样量为25μl，柱温25℃，检测波长280nm，样品仓6℃；第一维流动相和第二维流动相a均使用20mm的tris缓冲液（ph 7.2），第二维流动相b为20mm的tris，1m nacl溶液（ph 7.2）。
39.第一维流动相洗脱条件为流动相a等度洗脱，流速为0.5ml/min；第二维流动相洗脱条件为流动相a和b梯度洗脱，流速为0.3ml/min，包括0-4.3min，100%流动相a；4.3-5.0min，100-75%流动相a；5.0-5.1min，75-65%流动相a；5.1-6.1min，65%流动相a；6.1-6.2min，65-55%流动相a；6.2-7.2min，55%流动相a；7.2-7.3min，55-45%流动相a；7.3-8.3min，45%流动相a；8.3-8.4min，45-35%流动相a；8.4-9.4min，35%流动相a；9.4-9.5min，35-15%流动相a；9.5-10.5min，15%流动相a；10.5-10.6min，15-0%流动相a；10.6-12min，0%流动相a。二维液相切换阀时间为2.5min。
40.结果如图4所示，由于切换阀时间过早，造成外泌体主峰不能完全显示进入第二维，并且第二维出现的峰型与图2标准品的峰型不一致；由此可见，切换阀时间对外泌体分析有较大影响。
41.通过二维液相来评价外泌体纯度，评价结果更为精准，采用相同的样本连续测评，杜绝了不同批次检测时带来的样本误差，并且效率更高，检测速度更快。本发明实施例中详细描述了对牛奶外泌体样本的纯度检测，本检测方案还能够用于尿液、血液、唾液等原料制备得到的外泌体样本。
42.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。