一种检测利格列汀对映异构体的方法及应用与流程

1.本发明属于药物分析检测技术领域。更具体地，涉及一种检测利格列汀对映异构体的方法及应用。


背景技术：

2.利格列汀是一种二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂，可以在饮食控制和体育锻炼的基础上改善2型糖尿病成年患者的血糖控制水平。在制备过程中，反应原料中(r)-2-氨基哌啶二盐酸盐的光学异构体(s)-2-氨基哌啶二盐酸盐存在，与其他反应原料反应，生成了利格列汀对映异构体。利格列汀对映异构体作为杂质残留在利格列汀原料药中，一方面，根据手性药物药学研究技术指导原则，手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，该异构体很可能存在一定的毒副作用，影响疗效；另一反面，利格列汀对映异构体存在于原料药中，直接影响利格列汀的纯度，降低利格列汀产品的质量。因此，为严格控制产品质量，对本品对映异构体进行研究，迫切需要对利格列汀对映异构体进行检测控制，从而获得合格的成品。
[0003][0004]
目前手性药物分离以正相色谱法为主，如董海霞(董海霞.hplc法测定利格列汀的s-异构体[j].山东化工,2017,46(10):2.)公开了一种hplc法测定利格列汀的s-异构体的方法，该采用ad-h正相色谱柱，流动相为乙醇-乙醇胺 (100:0.1)，柱温22℃，流速0.4ml/min，在220nm处进行正相色谱测定；类似的，中国专利申请公开了一种高效液相色谱法测定利格列汀对映异构体含量的方法，采用大赛璐ad-h正相色谱柱，流动相为正己烷-乙醇-三氟乙酸 (60:40:0.1)，柱温20℃，流速1.0ml/min，在220nm处进行正相色谱测定。上述正相色谱法均能较好的对利格列汀对映异构体进行测定，但是该方法手性分离系统适用性窄，检测仪器要求无水和无机盐，所采用的流动相成本较高，所采用的试剂毒性较大；并且，一般均需提前置换系统，效率低，且置换过程复杂，稍有不慎，可能造成仪器和色谱柱堵塞，操作比较麻烦。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是克服现有正相色谱法试剂成本高毒性大，操作麻烦的缺陷和不足，提供一种检测利格列汀对映异构体的方法，该方法操作简单，专属性强、灵敏度高、稳定可靠。
[0006]
本发明的目的是提供所述检测利格列汀对映异构体的方法在利格列汀质量监控
中的应用。
[0007]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0008]
一种检测利格列汀对映异构体的方法，采用反相高效液相色谱法进行检测，所述反相高效液相色谱法的条件为：
[0009]
采用直链淀粉硅胶手性柱作为色谱柱，在22222℃柱温，0.821.2ml/min流速条件下，以0.0220.12mol/l醋酸铵溶液作为流动相a，以乙腈作为流动相b，在a：b体积比为(7002900):(1002200)的条件下进行等度洗脱，292nm检测波长处进行检测。
[0010]
发明人研究发现，利格列汀对映异构体在224nm和296nm处有较大吸收，且在224nm处吸收远大于296nm，现有技术在对其进行检测时波长一般选择224 nm处波长，本发明创造性地选择296nm作为检测波长，虽然利格列汀对映异构体响应值相对减小，但高波段检测器噪音较末端吸收小，灵敏度增大。
[0011]
优选地，所述色谱柱为chiralpak ad-h直链淀粉硅胶手性柱4.6mm
×ꢀ
220mm，2μm。
[0012]
进一步地，所述醋酸铵溶液的ph为426。
[0013]
优选地，所述流动相a为0.1mol/l醋酸铵溶液。
[0014]
优选地，所述a：b体积比为900:100。
[0015]
优选地，所述流速为1.0ml/min。
[0016]
更进一步地，所述反相高效液相色谱法的条件中，进样量为10μl。
[0017]
进一步地，所述方法的定量限为0.04％。
[0018]
更进一步地，所述方法的检测限为0.0220.04％。
[0019]
进一步地，所述检测利格列汀对映异构体的方法的供试品制备时，采用流动相作为溶液配置相应的供试品。优选地，供试品溶液的浓度为0.2μg/ml～600 μg/ml。
[0020]
另外的，本发明还提供了所述检测利格列汀对映异构体的方法在利格列汀质量监控中的应用。
[0021]
本发明具有以下有益效果：
[0022]
本发明一种检测利格列汀对映异构体的方法，可以在一个色谱条件下同时分离测定利格列汀和利格列汀对映异构体，两者的色谱峰分离度均较好，检测限、定量限也均符合药物的定性和定量分析要求，灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，可用于利格列汀生产过程中对杂质利格列汀异构体的监控，有利于控制、提高利格列汀的质量；同时操作简单，检测时间段，非常适用于大规模产业化生产中对原料药的质量监控。
附图说明
[0023]
图1为本发明实施例1系统适用性溶液检测图谱。
[0024]
图2为本发明实施例1检测限检测图谱。
[0025]
图3为本发明实施例1定量限检测图谱。
[0026]
图4为本发明对比例1系统适用性溶液检测图谱。
[0027]
图5为本发明对比例2系统适用性溶液检测图谱。
[0028]
图6为本发明对比例2系统适用性溶液检测图谱。
[0029]
图7为本发明对比例4定量限检测图谱。
[0030]
图8为本发明应用例1中利格列汀对映异构体检测方法的方法学考察中的标准曲线图。
具体实施方式
[0031]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0032]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0033]
实施例1一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0034]
所述一种检测利格列汀对映异构体的方法具体包括以下步骤：
[0035]
1、色谱条件：
[0036]
流动相：0.1mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至2.0)-乙腈(900：100)，等度洗脱；
[0037]
检测器：紫外检测器，检测波长为292nm；
[0038]
色谱柱：chiralpak ad-h直链淀粉硅胶手性柱4.6mm
×
220mm，2μm；
[0039]
柱温为20℃，流速为每分钟1.0ml，进样体积10μl。
[0040]
2、样品制备：
[0041]
利格列汀对映异构体储备液：取利格列汀对映异构体对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，作为利格列汀对映异构体母液，精密量取2ml利格列汀对映异构体母液，置20ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
[0042]
系统适用性溶液：取利格列汀22mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加入利格列汀对映异构体储备液1ml，用流动相稀释制成每 1ml中约含对映异构体0.72μg与利格列汀0.2mg的混合溶液。
[0043]
供试品溶液：取利格列汀约22mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加流动相定量稀释制成每1ml约含0.2mg的溶液。
[0044]
对照品溶液：取利格列汀对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，作为对照品母液，再精密量取 1ml，置200ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml约含利格列汀 0.72μg的溶液。
[0045]
2、检测结果：
[0046]
(1)为分析供试品溶液中利格列汀峰与吡利格列汀对映异构体的分离情况与检测能力，取空白溶剂(流动相)、系统适用性溶液和对照品溶液进样检测，检测结果如图1和表1所示。
[0047]
表1系统适用性溶液分离度结果
[0048][0049][0050]
结果表明空白溶剂不干扰利格列汀对映异构体的测定，并且系统适用性溶液中，利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2，《中国药典》)。
[0051]
(2)为分析本发明方法对利格列汀对映异构体的检测能力，取利格列汀对映异构体对照品储备液逐级稀释，考察杂质的检测限(lod)和定量限(loq)，结果如图2~3和表2所示。
[0052]
表2定量限、检测限结果表
[0053]
名称峰面积s/n检测限/％利格列汀对映异构体28222.00.02名称峰面积s/n定量限/％利格列汀对映异构体212210.10.04
[0054]
结果表明，本发明检测方法对利格列汀对映异构体具有较低的检测限和定量限。
[0055]
实施例2一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0056]
与实施例1不同之处在于，实施例2中流动相为：0.1mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至2.0)-乙腈(700：200)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表3。
[0057]
表3统一系统适用性溶液分离度结果
[0058]
名称保留时间/min分离度利格列汀7.020/利格列汀对映异构体9.2122.46
[0059]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2)。
[0060]
实施例3一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0061]
与实施例1不同之处在于，实施例2中流动相为：0.02mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至2.0)-乙腈(900：100)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表4。
[0062]
表4系统适应性溶液分离度结果
[0063]
名称保留时间/min分离度利格列汀8.272/利格列汀对映异构体12.8092.47
[0064]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2)。
[0065]
实施例4一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0066]
与实施例1不同之处在于，实施例4中流动相为：0.12mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至2.0)-乙腈(900：100)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表5。
[0067]
表5系统适应性溶液分离度结果
[0068]
名称保留时间/min分离度利格列汀8.229/利格列汀对映异构体12.8222.20
[0069]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求
(分离度》1.2)。
[0070]
实施例5一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0071]
与实施例1不同之处在于，实施例2中流动相为：0.1mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至4.0)-乙腈(900：100)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表6。
[0072]
表6系统适应性溶液分离度结果
[0073]
名称保留时间/min分离度利格列汀6.871/利格列汀对映异构体9.6622.14
[0074]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2)。
[0075]
实施例6一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0076]
与实施例1不同之处在于，实施例6中流动相为：0.1mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至6.0)-乙腈(900：100)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表7。
[0077]
表7系统适应性溶液分离度结果
[0078]
名称保留时间/min分离度利格列汀10.122/利格列汀对映异构体12.7412.76
[0079]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2)。
[0080]
实施例7一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0081]
与实施例1不同之处在于，实施例7中流速为0.8ml/min，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表8。
[0082]
表8系统适应性溶液分离度结果
[0083]
名称保留时间/min分离度利格列汀9.669/利格列汀对映异构体14.4262.62
[0084]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求(分离度》1.2)。
[0085]
实施例8一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0086]
与实施例1不同之处在于，实施例8中流速为1.2ml/min，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见表9。
[0087]
表9系统适应性溶液分离度结果
[0088]
名称保留时间/min分离度利格列汀7.221/利格列汀对映异构体11.2172.26
[0089]
由表可见，本发明方法测定的利格列汀与利格列汀对映异构体分离度符合要求
(分离度》1.2)。
[0090]
对比例1一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0091]
与实施例1不同之处在于，对比例1中色谱柱为chiralpak ic纤维素-2,2
‑ꢀ
二氯苯基氨基甲酸酯，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见图4和表10。
[0092]
表10系统适应性溶液分离度结果
[0093]
名称保留时间/min分离度利格列汀2.784/利格列汀对映异构体7.242无分离度显示
[0094]
结果表明，该检测方法中利格列汀与利格列汀对映异构体分离度无法显示，不符合要求(分离度》1.2)。
[0095]
对比例2一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0096]
与实施例1不同之处在于，对比例2中流动相为正己烷-无水乙醇-甲醇(80： 12：2)，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见图2和表11。
[0097]
表11系统适应性溶液分离度结果
[0098]
名称保留时间/min分离度利格列汀40.422/利格列汀对映异构体22.2921.28
[0099]
由表可见，该检测方法中利格列汀与利格列汀对映异构体分离度不符合要求 (分离度》1.2)。
[0100]
对比例3一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0101]
与实施例1不同之处在于，对比例2中流动相为0.1mol/l醋酸铵溶液(用乙酸调节ph至2.0)-乙腈比例为600：400，其他操作及参数参考实施例1，取系统适用性溶液进行检测，结果参见图6和表12。
[0102]
表12系统适应性溶液分离度结果
[0103]
名称保留时间/min分离度利格列汀4.916/利格列汀对映异构体7.412无分离度显示
[0104]
结果表明，该检测方法中利格列汀与利格列汀对映异构体分离度无法显示，不符合要求(分离度》1.2)。
[0105]
对比例4一种检测利格列汀对映异构体的方法
[0106]
与实施例1不同之处在于，对比例4中检测波长为222nm，其他操作及参数参考实施例1，取实施例1中检测定量限的溶液进行检测，结果参见图7和表13。
[0107]
表13定量限检测结果
[0108]
名称峰面积s/n定量限/％利格列汀对映异构体120217.10.02
[0109]
由表可见，该检测方法中利格列汀对映异构体的检测灵敏度不符合要求 (s/n》10，《中国药典》)。
[0110]
应用例1利格列汀对映异构体检测方法的方法学考察
[0111]
1、线性和范围试验
[0112]
分别精密量取实施例1中的利格列汀对映异构体储备液适量，制备利格列汀对映异构体浓度为0.222.2μg/ml的对照品溶液；参照实施例1的液相色谱条件，进样检测。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。结果参见表14和图8。
[0113]
表14利格列汀对映异构体线性结果
[0114][0115]
根据测定结果可知，格列汀对映异构体在0.2118μg/ml22.229μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为0.9999，y轴截距在100％浓度响值之比为0.1％。
[0116]
2、精密度试验
[0117]
参照实施例1的条件，将对照品溶液连续进样2次，结果参见表15。
[0118]
表15精密度试验结果
[0119][0120]
由表可见，对照品溶液主峰峰面积rsd均小于2.0％，精密度良好。
[0121]
2、准确度试验
[0122]
准确度储备液：精密量取利格列汀对映异构体母液22ml，置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
[0123]
准确度供试品溶液：取利格列汀22mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，分别精密加入准确度储备液1ml、2ml、2ml，再加流动相稀释制成对映异构体相对含量为20％、100％、120％的溶液，每个浓度平行 2份；取实施例1对照品溶液、供试品溶液，参照实施例1的液相色谱条件，进样检测，按外标法以峰面积计算利格列汀对映异构体含量，结果参见表16。
[0124]
表16准确度测定结果
[0125][0126]
由表可见，利格列汀对映异构体平均回收率为98.6％，单个回收率在 92.64％2101.21％之间，回收率较高，且rsd为2.1％，准确度高。
[0127]
4、溶液稳定性试验
[0128]
取2、准确度试验项下对照品溶液和100％准确度供试品溶液，分别于室温放置0h、4h、8h、12h、18h，精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件进行测定，记录色谱图，测定并计算对照品溶液峰面积变化率、供试品溶液对映异构体含量与0h相比的差值，结果见表17。
[0129]
表17溶液稳定性试验结果
[0130][0131]
由表可见，与0h相比，供试品溶液室温放置18h，对映异构体含量极差为 0.00％＜0.02％；对照品溶液室温放置18h，峰面积变化率最大为-2.7％，在10％范围内；故供试品溶液和对照品溶液室温放置18h均能保持稳定状态。
[0132]
通过上述验证过程及验证结果，证明该发明能够准确有效地检测利格列汀对映异构体的含量，该方法专属性强、灵敏度高、稳定可靠。
[0133]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。