一种靶向纳米复合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种靶向纳米复合物，尤其涉及一种d型多肽配体靶向纳米复合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.癌症仍然是目前人类健康所面临的一个严峻问题。全球每年大约有1400万新癌症患者和800万人死于癌症相关疾病。因此世界各地的研究人员一直在努力开发更精确、更快速的诊疗方法来对抗癌症。由于纳米材料的优越性，它在肿瘤的诊断和治疗方面得到了广泛的研究。特别是，纳米材料可以将多种治疗功能整合到一个平台上，制备成结合诊断和治疗于一体的纳米复合制剂，在癌症治疗中已经发挥着越来越重要的作用，是当今国际的研究热点和前沿领域。
3.受体-配体介导靶向治疗肿瘤也已被广泛应用于临床。神经肽y(npy)家族是一个多受体/多配体的家族，由四个受体亚型(hy1、hy2、hy4、hy5)和三个激动剂(npy、pyy、pp)组成。目前有研究表明，在乳腺癌、脑癌、卵巢癌、肾癌等疾病的临床病例中均发现了神经肽y受体的过表达，且正常组织器官中这种受体的表达均较低。这说明神经肽y受体是一种可用于肿瘤靶向诊疗的一种潜在靶点，为上述肿瘤的临床诊治提供新的途径。
4.传统多肽配体的具有低毒性、低免疫原性、高组织渗透性和易合成修饰等优势，但是作为成像或治疗剂的靶向分子，多肽配体必须保持稳定并具有与受体结合的活性。不稳定的配体可能会失去生物活性，从而导致药物输送系统脱靶。多肽通常对酶促微环境(例如在血液循环和溶酶体中)敏感，并且易于降解，这严重限制了其在靶向药物递送中的应用。拟多肽的开发也是一种使用非天然氨基酸作为构建基来设计稳定肽的有用方法。d型多肽(全d型化氨基酸序列)设计与开发已成为多肽设计的发展方向。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种靶向纳米复合物，该靶向纳米复合物可实现成像及治疗。，以克服现有技术中的不足。
6.本发明的另一目的还在于提供所述靶向纳米复合物的应用。
7.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
8.本发明实施例提供了一种靶向纳米复合物，其包括纳米载体、生物靶向分子、治疗功能物质和/或成像功能物质，所述生物靶向分子偶联修饰于所述纳米载体的表面，所述治疗功能物质和/或成像功能物质负载于所述纳米载体的内部，所述生物靶向分子包括d型神经肽y系列的多肽配体。
9.在一些实施例中，所述d型神经肽y系列的多肽配体采用逆反技术合成。
10.进一步地，所述d型神经肽y系列的多肽配体选自以下肽段中的任意一种进行全部氨基酸d型化：d-npy、d-npy(28-36)、d-pnpy、d-[arg6，pro34]pnpy、d-[phe6，pro34]pnpy、d-[asn6，pro34]pnpy、d-[cys6，pro34]pnpy、d-[phe7，pro34]pnpy、d-[pro30，nle31，
bpa32，leu34]npy(28-36)、d-[arg7，pro34]pnpy、d-[leu31，pro34]pnpy、d-pyy(3-36)、d-[ahx5-24]npy、d-[ala31，aib32]pnpy、d-hpp、d-[cpp1-7，pnpy19-23，ala31，aib32，gln34]hpp、d-npy(3-36)、d-npy(22-36)、d-[pro30，tyr32，pro34]npy(25-36)、d-[pro30，tyr32]npy(25-36)、d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)、d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)、d-npy(25-36)、d-[leu31，pro34]pnpy、d-pyy(3-36)、d-[32-34βacc]-npy(25-36)、d-[ahx5-24]npy、d-[gln 34]-hpp。
[0011]
在一些实施例中，所述纳米载体包括脂质体、聚合物胶束纳米颗粒、藻酸盐水凝胶、树枝状聚合物、金属有机框架材料、介孔硅、沸石、四氧化三铁、金纳米颗粒、碳纳米管、中空二氧化锰等中的任意一种或两种以上的组合。
[0012]
在一些实施例中，所述治疗功能物质包括用于光热治疗或光动力治疗的物质、用于磁热治疗的物质、用于声动力治疗的物质、用于化学治疗的物质、用于核素治疗的物质等中的任意一种或两种以上的组合。
[0013]
在一些实施例中，所述成像功能物质包括用于荧光成像的物质、用于光声成像的物质、用于核素成像的物质等中的任意一种或两种以上的组合。
[0014]
本发明实施例还提供了一种靶向纳米复合物的制备方法，其包括：
[0015]
使d型神经肽y系列的多肽配体与活化后的纳米载体进行第一反应，得到偶联生物靶向分子的复合物；
[0016]
以成像功能物质和/或治疗功能物质对所述偶联生物靶向分子的复合物进行修饰，获得所述靶向纳米复合物。
[0017]
在一些实施例中，所述d型神经肽y系列的多肽配体与纳米载体的质量比为1∶130。
[0018]
在一些实施例中，所述成像功能物质与纳米载体的质量比为1∶1～30。
[0019]
在一些实施例中，所述治疗功能物质与纳米载体的质量比为1∶1～30。
[0020]
本发明实施例还提供了前述上述靶向纳米复合物，或者由上述任一项方法制备得到的靶向纳米复合物在制备具有治疗疾病的功能的药物组合物中的应用，所述疾病包括乳腺癌、脑癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌等中的至少一种。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
[0022]
1)本发明所提供的d型神经肽y系列的多肽配体靶向纳米复合物，具有肿瘤靶向治疗效果，通过改造现有抗癌纳米制剂，通过配体的优化提高了靶向分子体内的稳定性，以及对肿瘤组织的选择性，实现了药物的定向输送、逐步释放，改善了药物的代谢动力学和理化性质，降低了药物的毒副作用；
[0023]
2)本发明所提供的d型神经肽y系列的多肽配体靶向纳米复合物，具有肿瘤靶向治疗效果的同时有与抗体相似的亲和力和特异性、无免疫原性、抗蛋白酶降解、更长的半衰期、更好的组织穿透性等优点；
[0024]
3)本发明所提供的d型神经肽y系列的多肽配体靶向纳米复合物，可实现化学药物治疗或光热治疗、或光动力治疗、或声动力治疗、或磁热治疗结合了成像物质实现了荧光成像、或光声成像、或核素成像，实现了肿瘤地诊疗一体化。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]
图1a和图1b为本发明实施例1所得靶向纳米复合物的hplc图谱，其中图1a为偶联靶向分子前聚乙二醇hplc图谱，图1b为偶联靶向分子后聚乙二醇hplc图谱；
[0027]
图2a和图2b为本发明d型多肽配体d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)与其对应配体l型：[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)细胞靶向示意图。
具体实施方式
[0028]
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种d型神经肽y系列的多肽配体靶向纳米复合物，该靶向纳米复合物可实现成像及治疗。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0029]
本发明实施例的一个方面提供的一种靶向纳米复合物包括纳米载体、生物靶向分子、治疗功能物质和/或成像功能物质，所述生物靶向分子偶联修饰于所述纳米载体的表面，所述治疗功能物质和/或成像功能物质负载于所述纳米载体的内部，所述生物靶向分子包括d型神经肽y系列的多肽配体。
[0030]
进一步地，所述生物靶向分子与纳米载体通过酰胺键连接。
[0031]
在一些实施例中，所述d型神经肽y系列的多肽配体采用逆反技术合成，进一步的，所述d型神经肽y系列的多肽配体选自以下肽段中的任意一种进行全部氨基酸d型化：d-npy、d-npy(28-36)、d-pnpy、d-[arg6，pro34]pnpy、d-[phe6，pro34]pnpy、d-[asn6，pro34]pnpy、d-[cys6，pro34]pnpy、d-[phe7，pro34]pnpy、d-[pro30，nle31，bpa32，leu34]npy(28-36)、d-[arg7，pro34]pnpy、d-[leu31，pro34]pnpy、d-pyy(3-36)、d-[ahx5-24]npy、d-[ala31，aib32]pnpy、d-hpp、d-[cpp1-7，pnpy19-23，ala31，aib32，gln34]hpp、d-npy(3-36)、d-npy(22-36)、d-[pro30，tyr32，pro34]npy(25-36)、d-[pro30，tyr32]npy(25-36)、d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)、d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)、d-npy(25-36)、d-[leu31，pro34]pnpy、d-pyy(3-36)、d-[32-34βacc]-npy(25-36)、d-[ahx 5-24]npy、d-[gln34]-hpp。
[0032]
其中，以上各d型神经肽y系列的多肽配体的氨基酸序列如下表所示：
[0033]
[0034][0035]
在一些实施例中，所述靶向纳米复合物包括d型神经肽y系列的多肽配体、纳米载体、治疗功能物质和成像功能物质，具有以下技术效果：
[0036]
1)多肽配体具备更高的血清稳定性，酶稳定性及y1受体高亲和性赋予了纳米复合物更好的肿瘤靶向性效果；
[0037]
2)纳米载体所包载功能性物质可实现化学药物治疗或光热治疗、或光动力治疗、或声动力治疗、或磁热治疗结合了成像物质实现了荧光成像、或光声成像、或核素成像，实现了肿瘤地诊疗一体化。
[0038]
在一些实施例中，所述纳米载体包括脂质体、聚合物胶束纳米颗粒、藻酸盐水凝
胶、树枝状聚合物、金属有机框架材料(mof)、介孔硅、沸石、四氧化三铁、金纳米颗粒、碳纳米管、中空二氧化锰等用于作为载体的中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0039]
进一步地，形成所述脂质体的原料可以采用聚乙二醇化脂质体、壳聚糖、聚多巴胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)等中的任意一种，但不限于此。
[0040]
在一些实施例中，所述治疗功能物质包括用于光热治疗或光动力治疗的物质、用于磁热治疗的物质、用于声动力治疗的物质、用于化学治疗的物质、用于核素治疗的物质等中的任意一种或两种以上的组合。
[0041]
在一些更优选的实施例中，所述用于光热治疗或光动力治疗的物质包括聚多巴胺、贵金属纳米材料、金属硫族化合物纳米粒子、偶氮苯和邻硝基苄基衍生物、量子点、碳衍生物、上转换纳米颗粒、闪烁纳米颗粒、余辉发光纳米颗粒、光敏剂、有机染料等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0042]
进一步地，所述贵金属纳米材料可以选用纳米金壳、金棒、金球、纳米金笼、纳米钯、pd@ag等中的至少一种。其中，在pd@ag中pd为核，ag为壳层。
[0043]
进一步地，所述金属硫族化合物纳米粒子可以选用硫化铜纳米粒子、硒化亚铜纳米粒子等中的至少一种。
[0044]
进一步地，所述量子点可以选用cdse、cds、zns等中的至少一种。
[0045]
进一步地，所述碳衍生物可以选用碳纳米管、石墨烯、富勒烯等中的至少一种。
[0046]
进一步地，所述上转换纳米颗粒可以选用镧系掺杂的上转换纳米颗粒。
[0047]
进一步地，所述闪烁纳米颗粒可以选用tb2o3。
[0048]
进一步地，所述余辉发光纳米颗粒可以选用zns∶cu纳米颗粒、zns∶co纳米颗粒等中的至少一种。
[0049]
进一步地，所述光敏剂可以选用卟啉的光敏剂、基于叶绿素的光敏剂中的任意一种。
[0050]
更进一步地，所述卟啉的光敏剂可以选用photofrin、ala、ppix、bpd-ma、purpurin18、5-氨基酮戊酸、talaporfin等中的任意一种。
[0051]
更进一步地，所述基于叶绿素的光敏剂可以选用二氢卟酚、紫嘌呤、菌绿素、mthpc、叶绿素-a(chl-a)、p-bromo-phenylhydrazone-methyl pyropheophorbide-a(bpmppa)、脱镁叶绿酸a(pheophorbidea)、二氢卟吩e6(chlorin e6，ce6)、焦脱镁叶绿酸-a(pyropheophorbidea，ppa)、焦脱镁叶绿酸a己醚(hpph)、单-天冬酰胺基二氢卟吩-e6(n-aspartyl chlorin e6，npe6)等中的任意一种。
[0052]
进一步地，所述有机染料可以选用酞菁类、吲哚菁绿、萘氰胺、环戊酸盐、妥卡德、卟啉类化合物、异硫氰酸荧光素hypocrellin a、hypocrellin b、2-selenouracil、ppa-904、cercosporin、gplgiagq、亚甲基蓝等中的任意一种。
[0053]
在一些更优选的实施例中，所述用于磁热治疗的物质包括磁性核-壳纳米颗粒、磁性脂质体、含铁的多孔金属纳米胶囊等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0054]
进一步地，所述磁性核-壳纳米颗粒可以选用由涂覆有二氧化硅或聚合物的磁铁矿(fe3o4)制成的磁芯。
[0055]
进一步地，所述磁性脂质体可以选用包封在脂质体中的fe3o4或磁赤铁矿(fe2o3)纳米晶体。
[0056]
进一步地，所述含铁的多孔金属纳米胶囊是指多孔金属纳米胶囊中含有fe3o4、fe2o3、fe、mnfe2o4、co、mn
0.4
zn
0.6
fe2o4、mn
0.4
zn
0.6
fe
1.96-gd0
.06
o4、cofe2o4、co
0.95
fe
2.05
o4等成分。
[0057]
在一些更优选的实施例中，所述用于声动力治疗的物质包括卟啉及其衍生物、吖啶类化合物、染料、全氟化碳类纳米乳剂等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0058]
进一步地，所述卟啉及其衍生物可以选用血卟啉、血卟啉甲醚等中的至少一种。
[0059]
进一步地，所述吖啶类化合物可以选用吖啶红、吖啶橙等中的至少一种。
[0060]
进一步地，所述染料可以选用玫瑰红b、竹红菌素b等中的至少一种。
[0061]
在一些更优选的实施例中，所述用于化学治疗的物质包括烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类抗肿瘤药物、激素类药物、杂类药物等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0062]
进一步地，所述烷化剂类药物可以选用替莫唑胺、环磷酰胺、美法仑、白消安、赛替派、亚硝脲类等中的任意一种。
[0063]
进一步地，所述抗代谢类药物可以选用抗叶酸类药物、抗嘌呤类药物、抗嘧啶类药物中的任意一种。
[0064]
更进一步地，所述抗叶酸类药物可以选用甲氨蝶呤、培美曲塞、六甲蜜胺等中的任意一种。
[0065]
更进一步地，所述抗嘌呤类药物可以选用巯嘌呤等。
[0066]
更进一步地，所述抗嘧啶类药物可以选用氟尿嘧啶、优福定、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨、羟基脲等中的任意一种。
[0067]
进一步地，所述抗生素类药物可以选用蒽环类抗生素、博来霉素类抗生素或其他抗生素。
[0068]
更进一步地，所述蒽环类抗生素可以选用柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、米托蒽醌等中的任意一种。
[0069]
更进一步地，所述博来霉素类抗生素可以选用博来霉素、平阳霉素等中的任意一种。
[0070]
更进一步地，所述其他抗生素可以选用更生霉素、丝裂霉素、光辉霉素、伊沙匹隆、链脲霉素等中的任意一种。
[0071]
进一步地，所述植物类抗肿瘤药物可以选用微管抑制剂类药物或拓扑抑制酶抑制剂类药物。
[0072]
更进一步地，所述微管抑制剂类药物可以选用长春碱类或紫杉醇类药物。
[0073]
更进一步地，所述拓扑抑制酶抑制剂类药物可以选用喜树碱类、依托泊苷等中的任意一种。
[0074]
进一步地，所述激素类药物可以选用泼尼松类，地塞米松、氢化可的松、丙酸睾酮、己烯雌酚、氟他胺等中的任意一种。
[0075]
进一步地，所述杂类药可以选用铂类或其他杂类药。
[0076]
更进一步地，所述铂类药可以选用顺铂、卡铂、奥沙利铂等中的任意一种。
[0077]
更进一步地，所述其他杂类药可以选用丙门冬酰胺酶、达卡巴嗪、亚砷酸等中的任意一种。
[0078]
在一些更优选的实施例中，所述用于核素治疗的物质包括
211
at、
225
ac、
213
bi、
188
re、
90
y、
123
i、
125
i、
131
i、
64
cu、
67
ga等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0079]
在一些实施例中，所述成像功能物质包括用于荧光成像的物质、用于光声成像的物质、用于核素成像的物质等中的任意一种或两种以上的组合。
[0080]
进一步地，所述用于荧光成像的物质包括量子点、金纳米簇、上转化纳米粒子和荧光染料等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0081]
进一步地，所述用于光声成像的物质包括无机类光声造影剂和/或有机类光声造影剂，其中，所述无机类光声造影剂包括金纳米晶体、过渡金属硫化物、mxene基纳米材料等中的任意一种或两种以上的组合，所述有机类光声造影剂包括卟啉、黑色素、氰基染料、二亚胺、萘菁、酞菁、普鲁士蓝、半导体聚合物纳米粒子等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0082]
进一步地，所述用于核素成像的物质包括
11
c、
64
cu、
67
cu、
124
i、
125
i、
131
i、
111
in、
213
bi、
68
ga、
18
f、
99m
tc中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
[0083]
在一些优选实施例中，所述d型神经肽y系列的多肽配体与纳米载体的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0084]
进一步地，所述成像功能物质与纳米载体的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0085]
进一步地，所述治疗功能物质与纳米载体的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0086]
本发明实施例的另一个方面提供的一种靶向纳米复合物的制备方法包括：
[0087]
使d型神经肽y系列的多肽配体与活化后的纳米载体进行第一反应，得到偶联生物靶向分子的复合物；
[0088]
以成像功能物质和/或治疗功能物质对所述偶联生物靶向分子的复合物进行修饰，获得所述靶向纳米复合物。
[0089]
在一些实施例中，上述活化后纳米载体的方法为：
[0090]
edac(碳二亚胺)：nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)：cooh化的纳米载体以质量比为1∶3∶12在0～30℃搅拌4～72h。
[0091]
在一些实施例中，所述制备方法包括：使所述偶联生物靶向分子的复合物与成像功能物质进行第二反应，之后再与治疗功能物质进行第三反应，获得所述靶向纳米复合物。
[0092]
在一些实施例中，所述制备方法包括：将所述成像功能物质、治疗功能物质与溶剂混合，形成溶液或者分散液，之后再与所述偶联生物靶向分子的复合物进行第二反应和第三反应。
[0093]
在一些更为优选的实施例中，所述靶向纳米复合物的制备方法至少包括以下步骤：
[0094]
1)将d型多肽配体与纳米载体源进行第一反应(即反应i)，得到偶联生物靶向分子的复合物(亦可称为“偶联d型多肽配体的复合物”)；
[0095]
2)对所述偶联d型多肽配体的复合物进行治疗和成像单一或者共同作用的功能物质修饰，得到所述靶向纳米复合物。
[0096]
进一步地，反应i中，所述生物靶向分子与所述纳米载体源的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0097]
进一步地，所述步骤2)包括：将所述偶联d型多肽配体的复合物与含有成像功能物
质的原料ii和含有治疗功能性物质的原料iii进行反应，得到所述靶向纳米复合物。
[0098]
进一步地，所述原料ii(成像功能物质)与所述纳米载体源的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0099]
进一步地，所述原料iii(治疗功能物质)与所述纳米载体源的质量比为1∶1～30，优选为1∶20～30。
[0100]
进一步地，所述溶液或者分散液中治疗功能物质的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。
[0101]
进一步地，所述溶液或者分散液中成像功能物质的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。
[0102]
具体地，作为本发明的一种实施方式，所述靶向纳米复合物的制备方法至少包括以下步骤：
[0103]
1)将d型靶向分子与活化后的纳米载体的原料i进行反应i，得到含有d型靶向分子的混合物；
[0104]
活化是为了暴露d型靶向分子或纳米载体的原料i中的氨基或羧基，便于反应中两种反应物中的氨基和羧基形成酰胺键。
[0105]
2)将含有d型靶向分子的混合物与含有成像功能物质的原料ii进行反应ii和加入含有成像的原料iii进行反应iii，得到所述靶向纳米复合物。
[0106]
当靶向纳米复合物的纳米载体为脂质体时，由于脂质体是伴随着靶向纳米复合物形成的反应过程形成的，因此制备中加入的加入形成脂质体的原料。
[0107]
进一步地，所述步骤2)中还包括溶剂，所述溶剂选自超纯水、甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙三醇、n，n-二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、二氯亚砜、吡啶等中的至少一种，但不限于此。
[0108]
该溶剂用于形成含有协同治疗功能基团或放射性同位素的溶液或者分散液。本领域技术人员可根据溶质的分散或溶解需求选择其加入量。
[0109]
在一些实施例中，所述第一反应的条件为：反应温度为4℃～26℃，第一反应的时间为5min～72h。
[0110]
进一步地，所述第二反应的条件为：反应温度为4℃～300℃，第二反应的时间为5min～72h。
[0111]
进一步地，所述第三反应的的条件为：反应温度为4℃～300℃，ph值为5.5～7.4，第三反应的时间为5min～72h。
[0112]
根据本发明的又一个方面，提供了上述靶向纳米复合物，或者由上述任一项方法制备得到的靶向纳米复合物在制备具有治疗疾病的功能的药物组合物中的应用，所述疾病包括乳腺癌、脑癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌等中的至少一种。
[0113]
藉由上述技术方案，本发明所提供的靶向纳米复合物，具有肿瘤靶向治疗效果，通过改造现有抗癌纳米制剂，通过配体的优化提高了靶向分子体内的稳定性，以及对肿瘤组织的选择性，实现了药物的定向输送、逐步释放，改善了药物的代谢动力学和理化性质，降低了药物的毒副作用。
[0114]
进一步地，本发明所提供的靶向纳米复合物，可实现化学药物治疗或光热治疗、或光动力治疗、或声动力治疗、或磁热治疗结合了成像物质实现了荧光成像、或光声成像、或核素成像，实现了肿瘤地诊疗一体化。
[0115]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳
实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0116]
如无特别说明，本发明的实施例中的原料均通过商业途径购买。而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0117]
本发明的实施例中所涉及细胞mcf-7乳腺癌细胞、u87mg脑胶质瘤细胞、786-o肾癌细胞、skov3卵巢癌细胞、a498肾癌细胞、mgc-803胃癌细胞、hec-1-b人子宫内膜腺癌细胞、a2780人卵巢癌细胞、sk-es-1未分化骨肉瘤/尤文氏肉瘤均从美国细胞典藏库购得，并依照其说明进行培养后进行试验。
[0118]
在本发明的一种实施方式中，所述靶向纳米复合物的制备方法可以为：
[0119]
步骤1，将d型靶向分子与活化后的纳米载体的原料i进行反应，在反应12小时后在水中透析72小时，然后冷冻干燥得到含有d型靶向分子的混合物；
[0120]
步骤2，随后按照成像和治疗功能物质与原料i的质量比为1∶1-80，将上述含有d型靶向分子的混合物加入治疗和成像功能物质的溶液或分散液中，40℃水浴20min，即得到所述靶向纳米复合物。
[0121]
1、光热治疗联合荧光成像
[0122]
实施例1纳米复合物d1 d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)脂质体负载irdye780制备方法：
[0123]
将d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)溶解在0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液中，并与活化cooh后的cooh-peg2000-dspe(肽/cooh-peg2000-dspe，质量比1∶20)混合，在26℃反应16小时。将混合物置于截留分子量为3000da的透析袋中72小时，以去除残留的游离肽并冷冻干燥。
[0124]
脂质体是通过薄膜水化和挤压法制备的。对于负载irdye780的脂质体，在形成薄膜之前添加irdye780(每7.85mg hspc 0.4mg irdye780)。对hspc/胆固醇/mpeg2000-dspe/d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)-peg3400-dspe(摩尔比为52∶43∶3∶2)或hspc/胆固醇/dotap(dotap-lip，摩尔比为52∶43∶5)旋转蒸发在chcl3溶液中形成薄膜，然后在真空下干燥过夜。将干燥的脂质膜在60℃下用磷酸盐缓冲盐水水合。将脂质分散体挤出通过孔径为400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜。
[0125]
图1a和图1b为本实施例所得靶向纳米复合物的hplc图谱，其中图1a为偶联靶向分子前聚乙二醇hplc图谱，图1b为偶联靶向分子后聚乙二醇hplc图谱。
[0126]
实施例2纳米复合物d2～d31的制备
[0127]
本实施例中制备纳米复合物d2～d31，具体的操作与实施例1相同；其余条件参见表1。
[0128]
[0129][0130]
实施例3样品d1～d31细胞抑制率测试实验方法与结果
[0131]
实验为光热治疗，具体方法为：
[0132]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0133]
2)将材料与细胞孵育1-12小时，用相应波段激发光进行光照后于培养箱中培养1-6小时；
[0134]
3)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0135]
4)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0136]
5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0137]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0138]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0139]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0140]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0141]
实验结果如表2所示。
[0142][0143][0144]
2、光热治疗联合光声成像
[0145]
实施例4纳米复合物d32 d-[arg7，pro34]pnpy-gnr-aipcs4复合物制备方法：
[0146]
通过种子介导的方法制备纳米金棒(gnr)。方法如下：通过将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液(7.5ml，去离子水中的100mm ctab)与250μl10 mmol/l haucl4混合来制备种子溶液。在将混合物以400rpm搅拌的同时，添加600μl的10mmol/lnabh4，并将混合物以900rpm搅拌2分钟；随后，将其在25℃下保持2小时。同时，将1.7ml的10mmol/lhaucl4水溶液添加至40ml的100mmol/l ctab水溶液中，随后依次添加250μl的10mmol/lagno3水溶液和270μl的100mmol/l抗坏血酸水溶液。此后，加入420μl的种子溶液并反应12h；然后，于室温下搅拌12小时。然后将反应混合物在15000离心克在25℃下15分钟，以获得的gnr。
[0147]
d-[arg7，pro34]pnpy-peg-gnr的制备。将含有ctab涂层的gnr的水溶液以15000g离心静置15分钟，然后倒出；然后将gnr重新悬浮在去离子水中，以去除过量的ctab。重悬后gnr溶液的浓度为150nmol/l。向cooh-peg-sh(1mm)溶液添加到500μl150 nmol/lgnr溶液中并在25℃下搅拌保持20小时。然后将gnr溶液离心，倾析，然后在去离子水中重新分散3次，以去除未反应的mpeg-sh。最后，获得peg-gnr水溶液。将d-[arg7，pro34]pnpy肽溶解在去离子水中以制备2mm d-[arg7，pro34]pnpy肽溶液。将d-[arg7，pro34]pnpy溶液(100μl，2mmol/l肽)添加到900μlpeg-gnr溶液中，并在25℃下搅拌12h，以将肽进一步缀合在活化了cooh的cooh-peg-gnr表面上。将混合物离心，倾析并在去离子水中再分散3次以去除未结合的肽。最终将gnr重新分散在500μl去离子水中，以获得peg-gnr-d-[arg7，pro34]pnpy溶液。
[0148]
d-[arg7，pro34]pnpy-gnr-alpcs4复合物的制备。通过将带正电的peg-gnr-d-[arg7，pro34]pnpy与带负电的光敏剂al(iii)酞菁氯四磺酸(alpcs4)混合来制备gnr-光敏剂电荷配合物。首先，将alpcs4水溶液(100μl，4mm)添加到500μl的150nm peg-gnr-d-[arg7，pro34]pnpy溶液中，并将混合物在25℃下搅拌12h以形成电荷复合物。
[0149]
实施例5纳米复合物d33～d61的制备
[0150]
本实施例中制备纳米复合物d33～d61，具体的操作与实施例4相同；其余条件参见表3。
[0151]
[0152][0153]
实施例6样品d32～d61细胞抑制率测试实验方法与结果
[0154]
实验为光热治疗，具体方法为：
[0155]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0156]
2)将材料与细胞孵育1-12小时，用相应波段激发光进行光照后于培养箱中培养1-6小时；
[0157]
3)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0158]
4)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0159]
5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0160]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0161]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0162]
实验结果如表4所示。
[0163]
[0164][0165]
3、光动力治疗联合核素成像
[0166]
实施例7纳米复合物d62 d-[leu31，pro34]pnpy-hmnps-bsa制备方法：
[0167]
msn的合成。将60ml去离子水，6g十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和0.18g三乙醇胺(teoa)混合到100ml圆底烧瓶中，并在60℃下轻轻搅拌1h。在加入由4ml teos和16ml环己烷形成的20ml混合物之后，将所得的透明溶液在60℃下连续搅拌12h(150rpm)。之后，通过离心获得沉淀物，用乙醇洗涤3次，并在75℃下干燥12h。最后，将产品在550℃下退火5小时(2℃/min)以去除ctac模板以获得msn。
[0168]
hmnp的合成。0.5ml含0.5mmol/l的ga离子溶液的(no3)3，0.3mmol/l的gd(no3)3，0.0005mm的cr(ch3coo)3，和0.0005mmol/l的nd(no3)3被充分地用200mg使用玻璃棒以形成白色胶体上面得到的msn的混合。随后，将胶体在120℃下快速干燥3小时。最后，通过在900℃下退火5小时(5℃ min-1
)获得hmnp。
[0169]
hmnps的表面功能化。将hmnp添加到naoh溶液(5mmol/l)中来获得羟基官能化的
hmnp(hmnps-oh)。剧烈磁力搅拌12小时后，将所得hmnps-oh以10,000rpm离心10分钟，并用去离子水洗涤3次。通过将5mg hmnps-oh分散到5ml dmf中来制备hmnps-nh2。超声处理30分钟后，将50μlaptes加入悬浮液中。然后，将得到的悬浮液在油浴中于80℃剧烈搅拌24小时(600rpm)。最后，通过离心分离得到的hmnps-nh2，并用去离子水和dmf反复洗涤3个循环，以完全去除未反应的aptes。
[0170]
为了获得d-[leu31，pro34]pnpy-hmnps-bsa，首先通过超声将5mg hmnps-nh 2分散在500μlbsa和d-[leu31，pro34]pnpy水溶液(1mg ml-1
)中，然后在37℃下搅拌30分钟。用去离子水洗涤3次后，将所得hmnps-bsa以10,000rpm离心10分钟，然后重悬于pbs中以备后用。
[0171]
68
ga标记的d-[leu31，pro34]pnpy-hmnps-bsa的合成。对于
68
ga标记，250μlhmnps-bsa在0.1mol/l hepes缓冲液(ph 7.4，2mg ml-1)用500μl的
68
gacl 3(2-3mci)处理30分钟，温育在70℃下在500rpm的热混合器上。将所得的
68
ga标记的d-[leu31，pro34]pnpy-hmnps-bsa以10,000rpm离心5分钟，并用hepes缓冲液洗脱3次。
[0172]
实施例8纳米复合物d63～d92的制备
[0173]
本实施例中制备纳米复合物d63～d92，具体的操作与实施例7相同；其余条件参见表5。
[0174]
[0175]
[0176][0177]
实施例9样品d62～d92细胞抑制率测试实验方法与结果
[0178]
实验分为光动力治疗，具体方法为：
[0179]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0180]
2)将材料与细胞孵育1-12小时，用相应波段激发光进行光照后于培养箱中培养1-6小时；
[0181]
3)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0182]
4)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0183]
5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0184]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0185]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0186]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0187]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0188]
实验结果如表6所示。
[0189]
[0190][0191]
实施例10纳米复合物d93明胶包覆的fe3o4浸渍的go-d-[gln 34]-hpp的制备方法：
[0192]
使用改良的hummers方法合成氧化石墨烯(go)，然后进行超声处理。在冰水浴中，在浓h2so4存在下，将石墨薄片，硝酸钠和高锰酸钾0-5℃以2∶1∶6的比例混合。在剧烈搅拌下加入蒸馏水稀释反应混合物，然后加入过氧化氢(30％，v/v；)以终止反应。将所得混合物在约3000g下离心10分钟，并将沉淀用10％盐酸溶液洗涤以除去金属离子，然后用蒸馏水重复洗涤以得到ph为7的溶液。蒸馏水并超声处理2-4小时，以促进纳米颗粒的合成。
[0193]
为了将d-[gln34]-hpp结合到氧化石墨烯纳米颗粒上，使用上述碳二亚胺化学方法将go的羧基和d-[gln 34]-hpp的胺基共轭。在不断搅拌下，将go(1mg/ml)和d-[gln 34]-hpp(0.1mg/ml)与edc(6mg)和nhs(6mg)在mes缓冲液(0.1mol/l，ph 5.4)中混合在37℃持续8小时。首先将获得的产物以16,000g离心10分钟，以收集d-[gln 34]-hpp接枝的氧化石墨烯为沉淀，并用去离子水洗涤两次。最后，将再分散的溶液在去离子水中透析48小时。制备的d-[gln 34]-hpp-go颗粒储存在4℃。
[0194]
复合材料制备：明胶包覆的fe3o4浸渍的go-d-[gln 34]-hpp。首先，采用共沉淀法合成了铁氧化物(fe3o4)纳米颗粒，其中在碱性条件下(nh4oh/0.7mnaoh)将fecl3和feso4·7h2o(摩尔比为2∶1)混合。将产物离心并用去离子水洗涤两次以除去杂质。然后，将其干燥并储存。在第二步中，将5mg制备好的fe3o4添加到10ml明胶溶液(1.5mg/ml的水中)中，并将混合物超声处理2h。接下来，将其离心分离，并将上清液保存在37℃下。在最后一步中，制备5ml明胶-fe3o4将其滴加到5ml的1mg/ml的go-d-[gln 34]溶液中，并在室温下在搅拌条件下放置。温育12小时后，将混合物离心并洗涤两次。最后，将沉淀干燥并保存。
[0195]
实施例11纳米复合物d94～d123的制备
[0196]
本实施例中制备纳米复合物d94～d123，具体的操作与实施例10相同；其余条件参见表7。
[0197]
[0198]
[0199][0200]
实施例12样品d93～d123细胞抑制率测试实验方法与结果
[0201]
实验分为磁热治疗，具体方法为：
[0202]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0203]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0204]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0205]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0206]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0207]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0208]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0209]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0210]
实验结果如表8所示。
[0211][0212][0213]
5、磁热治疗联合光声成像
[0214]
实施例13纳米复合物d124 d-[cys6，pro34]-pcl-b-p(meo ma-co-oegma)制备方
法：
[0215]
mtrn的合成与制备。将开环聚合(rop)和原子转移自由基聚合(atrp)用于制备热敏性两亲嵌段共聚物pcl-b-p(meo2ma-co-oegma)。通过调节meo2ma和oegma的比例来精确控制共聚物的lcst。
[0216]
疏水性聚(ε-己内酯)(pcl)的合成：将己内酯(20.00g)，季戊四醇(0.2390g)和辛酸亚锡(175μl)应用于干燥的烧瓶中。将烧瓶抽真空后，用氩气吹扫。重复该过程3次后，在磁力搅拌器下使溶液在120℃下反应24小时。然后将产物溶于二氯甲烷。在冰冷的甲醇中沉淀3次后，将反应物在真空下干燥直至达到恒重。
[0217]
pcl-br大分子引发剂的合成：本案发明人称重0.866g pcl，并将其添加到干燥的烧瓶中。本案发明人加入二氯甲烷(50ml)并搅拌直至其溶解，然后在氩气气氛下向烧瓶中加入0.162ml三乙胺。将混合物在磁力搅拌器上冷却至0℃后，在20分钟内逐滴加入在20ml二氯甲烷中混合的2-溴丙酰溴(0.122ml)。将反应在氩气下于室温放置48小时。反应完成后，将产物溶于二氯甲烷。加入等体积的去离子水以萃取3次。通过旋转蒸发浓缩油相产物，并在冰-甲醇中沉淀3次。最后，将产物在真空下干燥直至达到恒重。
[0218]
d-[cys6，pro34]-pcl-b-p(meo ma-co-oegma)的合成：向干燥的烧瓶中加入0.911gpcl-br大分子引发剂，2.820gmeo2ma，1.732goegma和15ml溶剂四氢呋喃(thf)。将该系统抽真空，随后用氩气吹扫。本案发明人添加了0.075g的配体pmdeta和0.058g的催化剂cubr3。将反应在55℃下放置5小时。反应后将产物溶解在thf中，并通过中性氧化铝柱除去铜盐。将获得的产物在冰冷的正己烷中沉淀，并在真空下干燥直至达到恒重。通过液相热分解制备mnxzn1-xfe2o4。将mnxzn1-xfe2o4，干燥的两亲嵌段共聚物pcl-b-p(meo2ma-co-oegma)和d-[cys6，pro34]-dspe-peg溶解在thf中。mn0.6zn0.4fe2o4的进料比/两亲嵌段共聚物/d-[cys6，pro34]-dspe-peg控制为1∶1∶0.1的比例。在超声处理15分钟后，将溶液倒入透析袋(分子量：8,000-14,000)中，并且每6小时换水。透析24小时后，获得胶束的水溶液。
[0219]
实施例14纳米复合物d125～d154的制备
[0220]
本实施例中制备纳米复合物d125～d154，具体的操作与实施例13相同；其余条件参见表9。
[0221]
[0222][0223]
[0224]
实施例15样品d124～d154细胞抑制率测试实验方法与结果
[0225]
实验分为磁热治疗，具体方法为：
[0226]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0227]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0228]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0229]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0230]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0231]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0232]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0233]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0234]
实验结果如表10所示。
[0235]
[0236][0237]
6、磁热治疗联合核素成像
[0238]
实施例16纳米复合物d15589zr-mnp-peg-d-[phe6，pro34]pnpy制备方法：
[0239]
磁性纳米粒子(mnp)的合成。将zn和mn离子共掺杂到氧化铁纳米颗粒中，合成了(zn
0.4
mn
0.6
)fe2o4mnps：将zncl2(0.03g)，mncl2(0.04g)和[fe(acac)3](0.353g)溶解在一个50ml的三颈圆底烧瓶中，该烧瓶中含有在辛醚中的表面活性剂(油酸和油胺)。将反应混合物在300℃下加热1h，然后将其冷却至室温。加入乙醇使生成的黑色粉末沉淀，通过离心收集，最后分散在氯仿中。
[0240]
mnp-peg-d-[phe6，pro34]pnpy。dspe-peg 5k-cooh进行活化cooh，与d-[phe6，pro34]pnpy溶液搅拌16小时。将5ml mnps在氯仿中的溶液(约3mg/ml)添加到一个装有4.5ml dspe-peg-d-[phe6，pro34]pnpy 5k在氯仿中的溶液(20mg/ml)单颈圆底烧瓶中的氯仿中的溶液(20mg/ml)，然后搅拌5分钟。将混合物在旋转蒸发仪中在真空下于60℃孵育2小时，以蒸发溶剂。随后，将5ml水加入到烧瓶中，然后超声处理15分钟。通过以15000rpm离心10分钟收集得到的mnp-peg-d-[phe6，pro34]pnpy重新分散在水或pbs中。
[0241]
mnp-peg-d-[phe6，pro34]pnpy进行89zr标记。将100μl分散在hepes缓冲液中的mnp-peg与1mci(或37mbq)的89zr-草酸酯直接混合。用1m na2co3将最终的ph值调整为7-8。在75℃振摇2小时后，离心收集89zr-mnp-peg-d-[phe6，pro34]pnpy，最后将其分散在pbs中。
[0242]
实施例17纳米复合物d156～d185的制备
[0243]
本实施例中制备纳米复合物d156～d185，具体的操作与实施例16相同；其余条件参见表11。
[0244]
[0245]
[0246][0247]
实施例18样品d155～d185细胞抑制率测试实验方法与结果
[0248]
实验分为磁热治疗，具体方法为：
[0249]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0250]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0251]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0252]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0253]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0254]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0255]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0256]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0257]
实验结果如表12所示。
[0258]
[0259][0260]
7、声动力治疗联合荧光成像
[0261]
实施例19纳米复合物d186 d-pyy(3-36)-aphb纳米复合物制备方法：
[0262]
aphb的合成。将1，2-二氨基丙烷(10ml)和次乳清b(500mg)加入到二口烧瓶中，并在黑暗条件下于55℃搅拌10h。然后在减压下除去溶剂。将黑色粉末产物用二氯甲烷进行柱色谱处理，得到aphb。
[0263]
制备aphb np。dspe-peg-cooh进行活化cooh，与d-pyy(3-36)的溶液搅拌16小时，得到dspe-peg-d-pyy(3-36)。在冰浴中超声处理3分钟，将4ml pva水溶液(0.1％)加入2ml的chcl3溶液中，其中含有2mgaphb，14mg peg-plga(mw：1000-1000)，1mg dspe-peg-d-pyy(3-36)。将pva水溶液(40ml，0.5％)加入上述溶液中并搅拌3分钟，然后通过真空蒸馏以除去chcl3并获得aphb np。
[0264]
实施例20纳米复合物d187～d216的制备
[0265]
本实施例中制备纳米复合物d187～d216，具体的操作与实施例19相同；其余条件参见表13。
[0266]
[0267]
[0268]
[0269][0270]
实施例21样品d186～d216细胞抑制率测试实验方法与结果
[0271]
实验分为声动力治疗，具体方法为：
[0272]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0273]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0274]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0275]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0276]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0277]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0278]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0279]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0280]
实验结果如表14所示。
[0281][0282]
8、声动力治疗联合光声成像
[0283]
实施例22纳米复合物d217 d-hpp-peg-ce6@ir783纳米复合物的制备方法：
[0284]
d-hpp-peg-ce6@ir783纳米复合物的合成。dspe-peg-cooh进行活化cooh，与d-hpp的溶液搅拌16小时，得到dspe-peg-d-hpp通常，通过简便的自组装方法在水溶液中合成dspe-peg-d-hpp@ce6@ir783纳米药物，无需进一步表面修饰即可直接使用。简单地，在超声处理下，将0.2ml ce6 dmso溶液(包含4mg ml-1 ce6)滴加到0.6ml 1mg ml-1 ir783水溶液中。随后，通过离心(17000rpm，30分钟)收集形成的ce6@ir783纳米颗粒，并进一步用pbs洗涤两次。将获得的纳米颗粒重悬于1ml无菌pbs中，将其设置为1ml标准ce6@ir783 pbs溶液。将其保存在4℃以便进一步使用。
[0285]
实施例23纳米复合物d218～d246的制备
[0286]
本实施例中制备纳米复合物d218～d246，具体的操作与实施例22相同；其余条件参见表15。
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291][0292]
实施例24样品d217～d246细胞抑制率测试实验方法与结果
[0293]
实验分为声动力治疗，具体方法为：
[0294]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0295]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0296]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0297]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0298]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0299]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0300]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0301]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0302]
实验结果如表16所示。
[0303]
[0304][0305]
9、化疗联合荧光成像
[0306]
实施例25纳米复合物d247 d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)-ag2se qd制备方法：
[0307]
油溶性dt-ag2se量子点的合成。首先，通过将0.05mmol的agno3溶解在5ml的油胺和10ml的甲苯的混合物中并进一步加热以获得澄清溶液来制备银前体溶液。然后，将所制备的溶液加载到50ml高压釜中；然后加入5ml dt，然后加入10ml nahse溶液(0.01mmol)。之后，将混合物加热至180℃并在该温度下保持1小时。反应完成后，将混合物冷却至室温(rt)，通过离心(15000rpm，10分钟)，用过量的乙醇获得尺寸为4.3nm且发射集中在1330nm的产物。
[0308]
羧基官能化ag2se量子点(peg-ag2se)的合成。将30mg dspe-peg-cooh添加到15ml含dt-ag2se qds(10mg)的氯仿溶液中。通过真空旋转蒸发除去氯仿，然后将pbs加入烧瓶中。超声处理30分钟后，通过非共价疏水-疏水相互作用将dspe-peg-cooh封端，然后将dt-ag2se成功转移到水中。
[0309]
d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)结合(d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)-ag2se)。通过使用标准edc/nhs反应，将d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)共价缀合到羧基官能化的ag2se量子点上。简而言之，将0.1mmol edc和0.1mmol nhs添加到10ml制备的ag2se qd中。然后将混合物在室温搅拌10分钟以活化ag2se qd的羧基。然后，将d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)添加到上述溶液中，并将混合物在室温下搅拌24小时。通过超滤去除过量的edc和nhs，然后获得d-[pro30，tyr31，trp32]npy(25-36)-ag2se qd。
[0310]
实施例26纳米复合物d248～d277的制备
[0311]
本实施例中制备纳米复合物d248～d277，具体的操作与实施例25相同；其余条件
参见表17。
[0312]
[0313]
[0314][0315]
实施例27样品d247～d277细胞抑制率测试实验方法与结果
[0316]
实验为化疗，具体方法为：
[0317]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0318]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0319]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0320]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0321]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0322]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0323]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0324]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0325]
实验结果如表18所示。
[0326]
[0327][0328]
10、化疗联合光声成像
[0329]
实施例28纳米复合物d278 d-[gln34]-hpp-cus-paaman-peg制备方法：
[0330]
cus-cooh nps的合成。将溴化铜(cubr2；10ml，1.41mg/ml)和柠檬酸钠(10ml，1.0mg/ml)水溶液添加到去离子(di)水(30ml)中。在添加na2s(50μl，60.54mg/250μl)溶液之前，将混合物在室温下搅拌30分钟。之后，将溶液再搅拌5分钟，并转移至90℃水浴中。将反应保持15分钟，然后用冰冷却。获得绿色的cus-cooh np溶液。
[0331]
合成马来酰亚胺官能化的cus nps(即cus-mal nps)。将n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(1.2mg)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1.3mg)和n-羟基琥珀酰亚胺(1.5mg)添加到cus-cooh np溶液(5ml，1mg/ml)。反应进行48小时，并通过用去离子水透析48小时除去杂质。将终产物在冻干下干燥。
[0332]
mal-peg-(4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸)(即mal-peg-cppa)可逆加成断裂链转移(raft)大分子引发剂的合成。将mal-peg-nh2(10mg)和cppa-nhs(2mg)raft试剂溶解在二甲基甲酰胺(dmf，3ml)中。反应在室温下在黑暗中进行过夜，然后将溶液滴加到冷的乙醚中以得到粗产物。通过重复三次的沉淀过程纯化所得产物(即，mal-peg-cppa)。最终聚合物在真空下干燥。按照相似的方法使用mpeg-nh2代替制备mpeg-cppa。
[0333]
mal-peg-聚(丙烯酰胺-丙烯腈)(即mal-peg-paaman)的合成。将mal-peg-cppa(20mg)，aam(22.1mg)，an(10.2mg)和aibn(0.321mg)溶解在dmf(0.3ml)中。通过标准的冷冻-泵-融化循环过程完全脱气后，将小瓶在真空下密封，然后放入80℃的油浴中以开始聚合过程。24小时后，将所得溶液滴加到冷的乙醚中以获得粗产物，将其通过重复三次的沉淀过程进一步纯化。最终聚合物在真空下干燥。按照相似的方法使用mpeg-cppa作为大分子引发剂制备mpeg-paaman。
[0334]
d-[gln 34]-hpp-peg-paaman的合成。将mal-peg-paaman(20mg)，d-[gln 34]-hpp(0.2mg)和tecp(0.1mg)溶解在dmf(3ml)中。反应在室温下进行24小时。通过用去离子水透析48小时除去杂质。将最终的聚合物冷冻干燥。
[0335]
d-[gln 34]-hpp-peg-paaman-sh的合成。将d-[gln 34]-hpp-peg-paaman(20mg)和己胺(2.3mg)溶于dmf(5ml)。溶液的粉红色快速褪色，在室温下持续12小时。将所得溶液用去离子水渗析48小时以除去杂质。将终产物在冻干下干燥。
[0336]
d-[gln 34]-hpp-cus-paaman-peg的合成。cus-paaman-peg-ge11，cus-mal nps(5mg)，d-[gln34]-hpp-paaman-sh(6.2mg)和mpeg在tcep(2.1mg)存在下，将-paaman-sh(53.1mg)溶于dmso(5ml)中。反应进行48小时，并通过针对dmf的透析24小时和去离子水的透析24小时除去杂质。将终产物在冻干下干燥。
[0337]
基于af的cus胶束的合成。为了制备加载有af的靶向cus基胶束，将af(15mg)和cus-paaman-peg-ge11/och3(60mg)溶解在dmso(3ml)中。将去离子水(9ml)滴加到溶液中。再搅拌2小时后，将溶液用去离子水透析48小时。冻干后获得最终产物。
[0338]
实施例29纳米复合物d279～d308的制备
[0339]
本实施例中制备纳米复合物d279～d308，具体的操作与实施例28相同；其余条件参见表19。
[0340]
[0341]
[0342]
[0343][0344]
实施例30样品d278～d308细胞抑制率测试实验方法与结果
[0345]
实验为化疗，具体方法为：
[0346]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0347]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0348]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0349]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0350]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0351]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0352]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0353]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0354]
实验结果如表20所示。
[0355]
[0356][0357]
11、化疗联合核素成像
[0358]
实施例31纳米复合物d309 131
i-has-d-pnpy-ptx制备方法：
[0359]
131
1标记has。通过标准的氯胺-t氧化法将hsa标记为放射性核素
131
1。简而言之，将200μci的
131
i和10μl的氯胺t(10mg ml-1)添加到hsa溶液(2mg ml-1，1ml)中。然后使混合物在ph 7.5的磷酸盐缓冲液(50mm)中在室温下反应20分钟。通过amicon过滤器(mwco＝10kda)离心过滤除去过量的
131
i和氯胺t，并用pbs洗涤几次，直到过滤溶液中没有可分离的放射性。
[0360]
131
i-has-d-pnpy-ptx纳米粒子的合成。向10毫升未加或未加
131
i标记的hsa(2mg ml-1)和130μl预先溶于乙醇(20mg ml-1)的ptx中，以摩尔比0.1∶1∶10(d-pnpy：hsa：ptx)搅拌过夜。在室温下制备
131
i-has-d-pnpy-ptx纳米粒子。将样品以14800rpm离心10分钟以去除过量的ptx。
[0361]
实施例32纳米复合物d310～d339的制备
[0362]
本实施例中制备纳米复合物d310～d339，具体的操作与实施例31相同；其余条件参见表21。
[0363]
[0364]
[0365][0366]
实施例33样品d309～d339细胞抑制率测试实验方法与结果
[0367]
实验分为化疗，具体方法为：
[0368]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0369]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0370]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0371]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0372]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0373]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0374]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0375]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0376]
实验结果如表22所示。
[0377]
[0378][0379]
12、核素治疗联合荧光成像
[0380]
实施例34纳米复合物d340 131
i标记d-[phe7，pro34]-pda制备方法：
[0381]
d-[phe7，pro34]-pda纳米粒子的合成与功能化。将180mg的多巴胺盐酸盐溶解在90ml的蒸馏水中，然后在50℃的磁性染色下将760μl的氢氧化钠(naoh，1mol/l)添加到该溶液中。聚合5小时后，通过以14,000rpm离心收集黑色颗粒状纳米颗粒，并用两次蒸馏水洗涤数次。将如此制成pda纳米颗粒共价地与羧基封端的peg(mpeg-cooh)。将五毫升(1mg/ml)pda纳米颗粒与50mg peg-cooh混合将其溶于2ml ph10.0的蒸馏水中，并进行磁力搅拌30分钟。将混合物在室温下搅拌8小时，然后通过过滤纯化，以通过10kda分子量截留(mwco)amicon过滤器除去过量的peg。通过使用标准edc/nhs反应，将d-[phe7，pro34]共价缀合到羧基官能化的pda纳米颗粒上。简而言之，将0.1mmol edc和0.1mmol nhs添加到上述制备的pda纳米颗粒中。然后将混合物在室温搅拌10分钟以活化pda纳米颗粒的羧基。然后，将d-[phe7，pro34]添加到上述溶液中，并将混合物在室温下搅拌24小时。
[0382]
131
i标记d-[phe7，pro34]-pda。将150μci的
131
i和1ml的pda-peg纳米颗粒(0.5mg/ml)同时加入到eppendorf(ep)管中，该管已预先涂有碘(0.5mg/ml)。混合物在25℃下反应20分钟。通过amicon滤器(mwco＝10kda)离心除去过量的131i，并洗涤直至无可分离的放射性。
[0383]
实施例35纳米复合物d341～d370的制备
[0384]
本实施例中制备纳米复合物d341～d370，具体的操作与实施例34相同；其余条件参见表23。
[0385]
[0386]
[0387][0388]
实施例36样品d340～d370细胞抑制率测试实验方法与结果
[0389]
实验分为核素治疗，具体方法为：
[0390]
1)在96孔板接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板房在培养箱中预培养24小时；
[0391]
2)向每孔加入10μl的cck-8溶液；
[0392]
3)将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
[0393]
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0394]
抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％
[0395]
其中，as：实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物浓度)；
[0396]
ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液、不含药物)；
[0397]
ab：空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液、不含细胞、药物)。
[0398]
实验结果如表24所示。
[0399]
[0400][0401]
实验例37血清稳定性，氨肽酶m稳定性，肝脏溶酶体匀浆稳定性测试实验方法与结果
[0402]
1)血清稳定性考察：d型配体与其相应的l型配体用pbs配成1mg/ml溶液，取0.1ml加入0.9ml的25％大鼠血清中，37℃孵育，分别于0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h取出100μl反应液，加入乙腈(含0.1％tfa)沉淀血清蛋白，4℃静置20min，12000r/min离心10min，取上清液20μl进行hplc定性及定量分析。
[0403]
2)氨肽酶m稳定性考察：选取血清中主要降解多肽的氨肽酶m考察两种构型多肽的酶稳定性。将两种不同构型的多肽溶于50mmol/l的tris-hc1缓冲液(ph7.4)，与0.01mg/ml的氨肽酶m于37℃孵育，分别于0、0.5、1、2和4h取样100μl，加入20μl冰醋酸终止反应后，取样20μl进行hplc分析。
[0404]
3)肝脏溶酶体匀浆稳定性考察：取大鼠肝脏提取肝脏溶酶体并用bsa试剂盒定量蛋白含量，将100μl 1mg/ml肝脏溶酶体匀浆和100μl 1mg/ml的多肽溶液加入800μl 0.2m ph为5.0的醋酸钠缓冲液中(肝溶酶体匀浆∶多肽溶液＝1∶1，w/w)。37℃孵育2min和15min后，取反应液100μl，加入20μl 15％的三氯乙酸(tca)终止反应，12000r/min离心10min后，取上清20μl进行hplc分析。
[0405]
实验结果如表25所示。
[0406]
[0407][0408]
本实施例中d型多肽配体d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)与其对应配体l型：[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)细胞靶向示意图请参阅图2a和图2b所示。
[0409]
实施例38
[0410]
本实施例与实施例1的不同之处在于：将d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)与cooh-peg2000-dspe按照质量比1∶30进行混合，在4℃反应72小时，形成复合物。
[0411]
成像功能物质采用金纳米簇，将上述形成的复合物与金纳米簇(金纳米簇与纳米载体的质量比为1∶30)进行混合，并在4℃反应72小时，之后加入治疗功能物质卟啉及其衍生物(卟啉及其衍生物与纳米载体的质量比为1∶30)，再在4℃反应72小时，获得靶向纳米复合物。
[0412]
实施例39
[0413]
本实施例与实施例1的不同之处在于：将d-[asn28，pro30，trp32]npy(25-36)与cooh-peg2000-dspe按照质量比1∶1进行混合，在26℃反应5min，形成复合物。
[0414]
成像功能物质采用金纳米簇，将上述形成的复合物与金纳米簇(金纳米簇与纳米载体的质量比为1∶1)进行混合，并在300℃反应5min，之后加入治疗功能物质卟啉及其衍生物(卟啉及其衍生物与纳米载体的质量比为1∶1，再在300℃反应5min，获得靶向纳米复合物。
[0415]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定
情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。