基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法

基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的引物组和方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的引物组和方法。


背景技术：

2.mon810品系转基因玉米可用于饲料食品的加工原料，其外源基因来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种hd-1菌种(bacillus thuringiensis subsp.kurstaki hd-1)的cry1ab基因，经基因修饰后接入质粒载体pv-zmbk07中，通过基因枪法实现遗传转化。mon810转化事件的插入序列包含camv 35s启动子(299bp)、经修饰的抗虫基因cry1ab部分编码区域(2448bp)、玉米热激蛋白基因hsp70的内含子(804bp)。mon810表达的杀虫蛋白是苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)的杀虫晶体蛋白cry1ab，是所有抗虫蛋白中应用最广泛的一种，对欧洲玉米螟、西南玉米螟和亚洲玉米螟等鳞翅目害虫都具有良好抗性，对人类、哺乳动物和其它有益昆虫没有影响。cry1ab蛋白的杀虫机制是：该蛋白被昆虫摄入后，在碱性肠道中被活化，专一性与中肠上皮细胞受体结合，形成离子通道或孔洞，引起渗透压失衡，导致昆虫死亡。由于mon810品系在防治玉米螟方面的效果较好，自商业化至今，其种植范围越来越广，但是其食用安全和环境安全问题也越来越受到重视，因此对转基因mon810品系的分析检测至关重要。
3.目前针对mon810品系检测的国家标准是定性pcr法，出入境检测检疫行业标准是采用lamp方法进行检测。这些方法从提取基因组到后续的扩增检测所需的时间都较长，且需要一些专业的仪器设备。
4.同时，传统的提取玉米基因组的方法是ctab法，耗时大约3h。目前利用市面上的各种试剂盒提取玉米dna也大约需要1-2h，在提取玉米基因组阶段所耗费的时间也比较长。
5.重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是在多酶体系下进行的一种恒温体外扩增技术。rpa反应一般在20min左右即可完成，且灵敏度高，特异性强，所需仪器设备简单便携，尤其是2014年rpa商业化试剂盒问世，使得rpa操作更加简便，可满足现场检测的需求。但是由于rpa反应体系组分较复杂，可能会对凝胶成像结果造成一定的影响。


技术实现要素：

6.(一)要解决的技术问题
7.为了开发一种快速、便携、灵敏且特异性强的检测转基因玉米mon810的方法，本发明提供了一种基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的引物组和方法。
8.(二)技术方案
9.本发明首先提供一种基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的引物组，其包括以下引物组中的一组或多组：
10.引物组i：
11.正向引物序列为：5
’‑
tacaacgccaagcacgagac-3’(seq id no.9)；
12.反向引物序列为：5
’‑
atctgctgcaggtggtcttac-3’(seq id no.10)；
13.引物组ii：
14.正向引物序列为：5
’‑
gctcaaggcttacactcgct-3’(seq id no.5)；
15.反向引物序列为：5
’‑
aaaggacctgactgctcgc-3’(seq id no.6)；
16.引物组iii：
17.正向引物序列为：5
’‑
agctcaaggcttacactcgc-3’(seq id no.7)；
18.反向引物序列为：5
’‑
tgactgctcgcaagcaaattc-3’(seq id no.8)。
19.本发明经过大量的优化和筛查后发现，上述引物即使在所提基因组的产量和纯度有所损失的情况下，也能通过rpa反应很好地实现对目标基因的扩增，进而有利于减少实际检测时的提取工序和提取时间，提升对转基因玉米mon810的检测效率。
20.作为优选，当所述正向引物的5’端修饰有isp18，在isp18的另一端连接有序列为ttttttttttttttt(seq id no.13)的核酸分子；所述反向引物的5’端修饰有fitc时，更有利于后续侧流层析技术中的检测效果。
21.具体的，以引物组i为例，其修饰后的正向引物的序列如下：
[0022]5’‑
ttttttttttttttt/isp18/tacaacgccaagcacgagac-3’；
[0023]
修饰后的反向引物的序列如下：
[0024]5’‑
/fitc/-atctgctgcaggtggtcttac-3’。
[0025]
进一步的，本发明还提供一种基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的试剂盒，其包括所述的引物组。
[0026]
进一步的，本发明还提供所述的引物组或所述的试剂盒在检测转基因玉米mon810中的应用。
[0027]
进一步的，本发明提供一种基于rpa-侧流层析技术检测转基因玉米mon810的方法，其包括以下步骤：
[0028]
1)提取待测玉米的dna；
[0029]
2)以所提dna为模板，使用所述的引物组进行rpa扩增；
[0030]
3)通过侧流层析技术对rpa扩增产物进行检测。
[0031]
作为优选，在步骤1)中，利用wizard magnetic dna purification system for food试剂盒中的试剂提取待测玉米的dna，具体包括：
[0032]
以100mg待测玉米的粉末为计算基准(在实际操作时可等比例放大或缩小)，将其与490-510μl lysis buffer a和4-6μlrnasea混合，大力晃动8-15s；而后加入240-260μl lysis buffer b并大力晃动8-15s，在室温放置0.8-1.2min后，加入740-760μl precipitation solution，大力晃动8-15s后，过滤除杂；
[0033]
在除杂后的液体中加入45-55μlpmp，并大力晃动4-6s，而后加入790-810μl异丙醇，将试样倒置10
–
15次后，用磁铁聚集磁珠，弃去上清液，在磁珠中加入240-260μl lysis buffer b，倒置2-3次，用磁铁聚集磁珠，弃去上清液，并用乙醇溶液清洗磁珠；
[0034]
在清洗后的磁珠中加入90-110μl无核酸酶水，并倒置4
–
6次，而后在37-42℃下孵育0.8-1.2min后，用磁铁聚集磁珠，收集上清液，即为待测玉米的dna。
[0035]
通过上述方式，只需要5min即可完成对待测玉米的dna的提取，同时所提基因组的产量和纯度不影响后续的rpa扩增，且上述过程不需要大型仪器设备，操作简便。
[0036]
进一步的，本发明对影响转基因玉米mon810检测效果的其他因素进行了探究与优化，得到如下的优选方案。
[0037]
作为优选，在步骤2)的所述rpa扩增中，反应温度为37-42℃。
[0038]
作为优选，反应时间为15-30min。
[0039]
作为本发明的一种实施方式，rpa扩增体系包括：冻干酶粉、primer free rehydration buffer、正、反向引物、模板dna、醋酸镁、h2o。扩增体系如下所示：
[0040][0041][0042]
作为优选，在步骤3)的侧流层析技术中，样品垫上的lfb缓冲液中含有：
[0043]
4x ssc、2％bsa、0.05％tween20、0.002％triton x-100、10mm tris-hac和5mm kac。
[0044]
作为优选，在步骤3)的侧流层析技术中，结合垫上的aunps-anti-fitc溶液的添加量为2.5-3.5μl；
[0045]
作为优选，在步骤3)的侧流层析技术中，样品垫上的rpa产物的添加量为4-6μl；
[0046]
作为优选，在步骤3)的侧流层析技术中，样品垫上的lfb缓冲液的添加量为150-200μl。
[0047]
通过对侧流层析技术中的lfb(侧流层析传感器)体系进行上述优化后，其结果不仅不受rpa复杂体系的干扰，而且结果直观且分析时间更短，只需要不到3min即可完成。
[0048]
作为本发明的一种实施方式，lfb体系包括：结合垫上的aunps-anti-fitc溶液、样品垫上的rpa产物和lfb缓冲液、组分为链霉亲和素-生物素-polya的检测线(t线)，组分为羊抗鼠抗体的质控线(c线)、吸收垫以及pvc背板。
[0049]
本领域人员可根据常识对上述方案进行组合，并设置rpa-侧流层析技术中的其他操作及参数，以得到本发明中检测方法的较优实施例。
[0050]
进一步的，本发明提供一种实现所述方法的装置，其包括：
[0051]
(1)带有卡槽的水槽；
[0052]
(2)带有活塞的样品管；
[0053]
其中，所述卡槽用于固定所述样品管，所述水槽用于提供水浴，所述活塞可将样品管分为上下两个空间，并用于控制上下两个空间的分隔和连通。
[0054]
在一个具体的实施方式中使用上述装置时，可将rpa反应液加入到所述装置的样
品管中，然后放置在37-42℃的水槽中反应15-30min。反应结束后，加入lfb缓冲液，而后打开装置的活塞使试纸条掉落，2-4min后完成试纸条的显色，读取检测结果。
[0055]
(三)有益效果
[0056]
(1)本发明所提供的引物组具有良好的特异性，即使在所提基因组的产量和纯度有所损失的情况下，也能通过rpa反应很好地实现对目标基因的扩增，进而有利于减少实际检测时的提取工序和提取时间，提升对转基因玉米mon810的检测效率。
[0057]
(2)本发明极大地缩短了检测转基因玉米mon810时所需的时间，其中基因组dna的提取时间仅需5min左右，整个检测过程仅需不到25min即可完成，非常快速，且不需要大型仪器设备，操作简便，有利于在实际检测中进行推广应用。
[0058]
(3)本发明方法的灵敏度较高，可检测mon810含量在0.1wt％以上的转基因玉米，符合国家标准的要求。
[0059]
(4)本发明提供了一种用于rpa和lfb反应的3d集成装置，实现了mon810品系的快速、简便、防污染的现场检测。
附图说明
[0060]
图1为本发明实施例的原理示意图；其中，a图为整个检测流程示意图，b图和c图分别代表rpa和lfb的工作原理。
[0061]
图2为本发明的dna快速提取方法与现有技术提取方法的比较结果；其中，a图为四种方法的操作和时间差异，b图、c图、d图和e图分别为四种基因组提取方法所提基因组dna、pcr结果、rpa结果和lfb结果之间的差异。
[0062]
图3为本发明的dna快速提取方法与现有技术提取方法的产量(a图)和纯度(b图)差异。
[0063]
图4为不同rpa体系的扩增结果差异；其中，a图、b图和c图分别为不同引物、不同反应时间、不同反应温度的扩增结果差异。
[0064]
图5为不同lfb体系的检测效果差异；其中，a图、b图、c图和d图分别为不同aunps-anti-fitc溶液的添加量、不同rpa产物的添加量、不同lfb缓冲液的添加量、不同lfb缓冲液的检测效果差异；在各图中，上方为lfb图像，下方为用image j定量结果。
[0065]
图6为本发明的灵敏度测试结果，其中，上方为lfb图像，下方为用image j定量结果。
[0066]
图7为本发明的特异性验证结果。
具体实施方式
[0067]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0068]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0069]
实施例1
[0070]
1.实验材料
[0071]
wizard magnetic dna purification system for food试剂盒购自美国promega
公司，天根植物基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，twistdx twistamp basic kit购自英国twistdx公司，ctab、异丙醇、乙酸钾、乙醇、苯酚、氯仿、10x pcr buffer、dntp(2.5mm)、rtaq酶(5u/ml)、haucl4、柠檬酸三钠、bsa、tween20、triton x-100等试剂购自sigma公司，链霉亲和素、anti-fitc、羊抗鼠抗体等购自abcam公司。吸水垫(cfsp001700、玻璃纤维样品垫(cfsp001700)、硝酸纤维素膜(135s)、结合垫(gfcp000800)、背板(hf000mc100)购自millipore公司。
[0072]
引物名称及序列如下：
[0073]
rpa-f：
[0074]5’‑
ttttttttttttttt/isp18/tacaacgccaagcacgagac-3’；
[0075]
rpa-r：
[0076]5’‑
/fitc/-atctgctgcaggtggtcttac-3’。
[0077]
2.转基因玉米mon810基因组的提取
[0078]
利用wizard magnetic dna purification system for food试剂盒中的试剂。称取100mg研磨好的转基因玉米mon810粉末(100％)，加入到2ml离心管中。加入500μl lysis buffer a和5μl rnasea，用手大力晃动10s，混合均匀。加入250μl lysis buffer b，将混合液用手大力摇晃10s至完全混合，室温放置1min。加入750μlprecipitation solution，大力晃动10s。准备一个新的2ml离心管，在离心管口铺一层孔径约1mm的纱布，然后将上述溶液通过纱布转移至离心管中。剧烈混合pmp 5s，取50μl重悬的pmp加到上述溶液中，大力晃动5s。加入800μl异丙醇，将试样倒置10
–
15次混合，然后将离心管放置在磁铁上，磁珠会迅速聚集，弃去上清液。在磁珠中加入250μl lysis buffer b，倒置2-3次混合，放置在磁铁上快速分离，弃去上清液。用1ml 70％乙醇清洗磁珠三次。加入100μl无核酸酶水，倒置5次混匀，然后在37℃水浴(后续rpa温度)中孵育1min，放置在磁铁上迅速分离，将上清液转移至新的离心管中，即为所提dna。
[0079]
3.rpa反应
[0080]
使用twistdx twistamp basic kit进行rpa扩增，rpa反应体系包括29.5μl primer free rehydration buffer，12.2μl ddh2o，2.4μleach primers(10μm)，1μl模板dna，将该混合液加入到含有0.2ml冻干酶粉的反应管中，再向反应管中加入2.5μl 280mm醋酸镁溶液，立即混匀后置于37℃中孵育15min。此处值得注意的是加入醋酸镁时rpa反应会立即进行，因此优选将醋酸镁加在管壁，以保证涡旋混匀后反应同时发生。
[0081]
4.aunps和aunps-anti-fitc的合成
[0082]
首先合成aunps，将圆底烧瓶泡在酸液中过夜，自来水、超纯水清洗干净，装入超纯水至圆底烧瓶瓶颈处，煮至沸腾。先加入190ml超纯水，再加入2ml haucl4(1wt％)溶液，煮至沸腾后加入8ml柠檬酸三钠溶液(1wt％)，10-15分钟后停止加热，冷却至室温，溶液先变为黑棕色，最后变为酒红色，分装。
[0083]
取1ml制备好的aunps，加入1μg anti-fitc，在旋转摇床上摇晃30-60min。再加入20μl bsa(10wt％)，继续摇晃5min。加入100μl nacl(10wt％)摇晃2h。最后在11000g离心20min，弃掉上清液所得沉淀即为aunps-anti-fitc。
[0084]
5.侧流层析传感器的制备
[0085]
侧流层析传感器由五部分组成：样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫和pvc背
板。将玻璃纤维膜用切纸器切成17mm x 30cm规格作为样品垫、将玻璃纤维膜切成8mm x 30cm规格作为结合垫，将吸水纸切成17mm x 30cm规格作为吸收垫。然后，将样品垫和结合垫浸于垫处理液(含0.23％triton x-100，0.05m tris-hcl和0.15mnacl，ph 8.0)中30min，继而置于37℃的烘箱中干燥2h后存放于干燥环境中。将10μl链霉亲和素(1mg/ml)和10μl生物素修饰的poly a混合孵育1h，然后将其用试纸条划线仪以1μl/cm的速度喷涂在硝酸纤维素膜(25mm x 30cm)上形成检测线。然后，将羊抗鼠抗体(1mg/ml)也用试纸条划线仪喷涂在硝酸纤维素膜的相应位置上形成质控线。将检测线与质控线喷涂完毕的硝酸纤维素膜于37℃的烘箱中干燥1h，之后将其储存于4℃的冰箱中。最终，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫均按照一定的叠加顺序组装于一个pvc背板(60mm x 30cm)上，每部分之间留出2mm的重叠宽度来保证溶液能够在层析试纸上流通顺畅。最后，用可编程切条器将组装好的侧流层析传感器切成3mm宽度的成品。
[0086]
6. 3d集成装置的设计
[0087]
rpa体系和lfb体系是在本发明设计的简易的3d集成设备中完成的。该3d集成设备包括：(1)带有卡槽的水槽，(2)带有活塞的样品管。其中卡槽用于固定样品管，水槽用于37℃水浴，活塞用于控制lfb的发生。将rpa反应液加入到该设备的pcr样品管中，然后放置在37℃的水槽中反应15min。反应结束后，加入lfb反应缓冲液，然后打开装置的活塞使试纸条掉落，3min后完成试纸条的显色，读取检测结果。
[0088]
7.转基因玉米mon810的检测
[0089]
在lfb的结合垫上滴加2.5μl aunps-anti-fitc.将4μlevent-specific rpa product与150μl lfb缓冲液(4x ssc 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100 10mm tris-hac 5mm kac)混合，将混合液滴加在lfb的样品垫上并通过毛细管力向上迁移。经过3min后可观察到t线和c线的红色条带。可使用image j软件对t线的颜色深浅进行定量检测。每个样品做3个平行，计算3次检测的平均值。
[0090]
上述实施例的原理如图1所示，本发明的整个检测流程分为三个部分(图1中a图)，首先是基因组dna的提取，利用本发明提供的加速提取方法，只需要5min即可完成，而且不需要大型仪器设备，操作很简便。将提取得到的dna用于rpa扩增，rpa和lfb部分都是在本发明设计的简易的3d集成装置中完成的。将rpa反应液加入到该设备的pcr管中，然后放置在37℃的水槽中反应15min。反应结束后，加入lfb缓冲液，然后打开装置的活塞使试纸条掉落，3min后完成试纸条的显色，读取检测结果。整个检测过程只需不到25min。
[0091]
图1中b图和c图分别代表rpa和lfb的工作原理。由于rpa的正向引物含有polyt尾巴，反向引物有fitc修饰，所以当有靶标存在时，扩增得到的rpa产物一端含有polyt尾巴，另一端标记fitc。该rpa产物在结合垫上可与aunps-anti-fitc相互作用，形成rpa产物-aunps-anti-fitc复合物。该复合物与检测线上的polya通过沃森-克里克互补配对，使得t线显示aunps的红色。同时体系中的aunps-anti-fitc可与质控线上的羊抗鼠抗体结合，使得c线也显示红色。c线上的红线指示该传感器正常工作。当没有靶标存在时，rpa反应不能进行，就没有产物使得t线显色，只有c线显示红色。
[0092]
试验例
[0093]
1.基因组dna快速提取方法的验证
[0094]
本发明同时比较了传统的ctab法、市售的天根生化有限公司植物基因组dna提取
试剂盒说明方法、市售的wizard magnetic dna purification system for food试剂盒说明方法，以及本发明提供的快速提取方法，通过简图(图2中a图)示意了这四种方法的操作和时间差异。通过琼脂糖凝胶电泳表征了这四种基因组提取方法所提基因组dna(图2中b图)、pcr结果(图2中c图)、rpa结果(图2中d图)和lfb结果(图2中e图)之间的差异，同时比较了这四种方法所得基因组的产量和纯度(图3)差异。结果表明本发明缩短了提取时间，仅需5min，牺牲了所提基因组的产量和纯度，但是不影响后续pcr、rpa扩增和lfb的结果。
[0095]
2.关于rpa反应体系
[0096]
rpa扩增体系包括：冻干酶粉、primer free rehydration buffer、正、反向引物、模板dna、醋酸镁、h2o。扩增体系如表1所示。
[0097]
表1 rpa扩增体系
[0098][0099][0100]
(1)关于rpa扩增体系的最佳引物序列，所设计的部分引物序列如表2所示，结果如图4中a图所示，可以证实本发明中引物组(包括引物组c、d、e)的效果优势，其中引物组e的效果最优，结合后续lfb反应效果，故设计最终引物序列为：
[0101]
rpa-f引物：ttttttttttttttt(seq id no.13)/isp18/tacaacgccaagcacgagac(seq id no.9)；
[0102]
rpa-r引物：/fitc/-atctgctgcaggtggtcttac(seq id no.10)；
[0103]
表2 rpa体系引物优化序列
[0104][0105][0106]
(2)关于rpa反应时间，分别选择5min，10min，15min，20min，30min，结果如图4中b图所示，表明最佳反应时间为15min。
[0107]
(3)关于rpa反应温度，分别选择25℃，30℃，37℃，42℃，47℃，结果如图4中c图所示，表明最佳反应温度为37℃。
[0108]
3.关于lfb体系
[0109]
lfb体系包括：结合垫上的aunps-anti-fitc溶液、样品垫上的rpa产物和lfb缓冲液、组分为链霉亲和素-生物素-polya的检测线(t线)，组分为羊抗鼠抗体的质控线(c线)、吸收垫以及pvc背板。
[0110]
(1)关于结合垫上的aunps-anti-fitc溶液的添加量，分别选择1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl。结果如图5中a图所示，图上方为lfb图像，下方为用image j定量结果，表明aunps-anti-fitc溶液的最佳添加量为2.5μl。
[0111]
(2)关于样品垫上的rpa产物的添加量，分别选择1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl。结果如图5中b图所示，图上方为lfb图像，下方为用image j定量结果，表明rpa产物的最佳添加量为4μl。
[0112]
(3)关于样品垫上的lfb缓冲液的添加量，分别选择50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl。结果如图5中c图所示，图上方为lfb图像，下方为用image j定量结果，表明lfb缓冲液的最佳添加量为150μl。
[0113]
(4)关于样品垫上的lfb缓冲液的类型，分别选择
[0114]
a：1x pbs 2％bsa 0.05％tween20；
[0115]
b：1x pbs 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100；
[0116]
c：1x pbs 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100 10mm tris-hac 5mm kac；
[0117]
d：4x ssc 2％bsa 0.05％tween20；
[0118]
e：4x ssc 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100；
[0119]
f：4x ssc 2％bsa 0.002％triton x-100 10mm tris-hac 5mm kac；
[0120]
g:4x ssc 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100 10mm tris-hac 5mm kac。
[0121]
结果如图5中d图所示，图上方为lfb图像，下方为用image j定量结果，表明lfb缓冲液的最佳类型为：4x ssc 2％bsa 0.05％tween20 0.002％triton x-100 10mm tris-hac 5mm kac。
[0122]
4.灵敏度测试
[0123]
选择含有mon810质量分数分别为100wt％、50wt％、25wt％、10wt％、1wt％、0.1wt％的玉米样品，通过实验所得最优反应体系和反应条件进行测定，结果如图6所示，可测得mon810质量分数为0.1wt％的样品，符合国家规定标准。
[0124]
5.特异性验证
[0125]
选择8种转基因作物，分别为：转基因玉米mon810(a)、转基因玉米ga21(b)、转基因玉米bt11(c)、转基因玉米mir640(d)、转基因大豆mon87769(e)、转基因大豆mon87705(f)、转基因水稻10％tt51(g)、转基因油菜籽rf3(h)。通过实验所得最优反应体系和反应条件进行测定，结果如图7所示，只有mon810的t线和c线都显示红色，其他转基因作物均只有c线显示红色，表明本发明所构建的检测方法具有良好的特异性。
[0126]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。