一种检测羟考酮纳洛酮缓释片中杂质含量的方法与流程

1.本发明涉及羟考酮纳洛酮缓释片杂质含量的检测方法，具体涉及采用液质联用方法检测羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮含量的方法。


背景技术：

2.羟考酮是一种由生物碱蒂巴因中提取的半合成阿片类药物，其结构类似可待因，通过激动中枢神经系统的阿片μ及κ受体而产生镇痛、镇静作用，用于缓解持续的中度到重度疼痛。羟考酮的镇痛效能和时间与吗啡类似，但生物利用度是吗啡生物利用度的3～4倍，其主要原因为羟考酮在分子结构上－ch3取代吗啡分子结构的－oh，降低患者口服药物首过效应，提升脂溶性，因此羟考酮透过血－脑脊液屏障及跨膜效果均高于吗啡3倍。盐酸羟考酮缓释片属于口服阿片类镇痛剂，1996年在美国上市出售，该药物集控释和即释于一体，患者服用后，38%药物能够快速得到释放，1h内起到镇痛作用，且药效持久，可持续12h。
3.阿片类药物通过占领脑和脊椎内的阿片受体来减少疼痛，同时也结合肠道内的周围阿片受体，干扰并延缓胃肠道运动性的肌肉收缩能力，并且还增加肠道水分的吸收、干燥肠道内容物，进一步阻碍食物在消化道内的运输，从而造成便秘。因此，服用阿片类药物的患者往往需要同时服用阿片类药物拮抗剂，如纳洛酮。
4.纳洛酮本身无内在活性，但能竞争性拮抗各类阿片受体，对μ受体有很强的亲和力。静脉给药时，纳洛酮可逆转阿片类药物导致的呼吸抑制；口服时，纳洛酮生物利用度非常低，仅作用于胃肠道的周围阿片受体，可防止阿片类药物与这些受体结合起到治疗便秘的作用，同时还不会影响阿片类药物的镇痛效果。羟考酮纳洛酮缓释制剂已在欧美上市，其缓解疼痛效果与单一羟考酮缓释制剂相近，但可显著降低阿片类药物引起的便秘。
5.基因毒性杂质在较低含量就有可能引起dna 的损伤进而可能引发癌变，对患者的用药安全产生严重危害，所以药物中基因毒性杂质的控制和监测成为药物开发和生产的一个关键问题。7,8-二脱氢纳洛酮（7,8-didehydronaloxone）为纳洛酮的基因毒性杂质。欧洲药典要求控制其含量在75ppm以下。
6.7,8-二脱氢纳洛酮欧洲药典公开了采用hplc方法检测纳洛酮原料药中7,8-二脱氢纳洛酮的含量。但是目前尚无报道制剂中，尤其是羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮含量检测方法。由于羟考酮纳洛酮缓释片中含有多种活性成分和多种辅料，并且7,8-二脱氢纳洛酮杂质含量很低，常规方法难以准确地检测该复方缓释制剂中7,8-二脱氢纳洛酮的含量。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种检测羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮含量的方法，专属性好、准确度高、灵敏度高，可有效监控羟考酮纳洛酮缓释片的质量，提高药物安全性。
8.本发明采用的技术方案如下。
9.本发明采用超高效液相色谱与质谱联用技术，超高效液相色谱采用乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相；色谱柱为c18 waters acquity csh c18。
10.在本发明的一个方面中，所述流动相采用梯度洗脱，梯度条件如下：也即是采用以下梯度洗脱程序：初始梯度：流动相a : 流动相b为98:2；0min至4min，流动相a : 流动相b由98:2渐变为75:25；4.0min至6.5min，流动相a : 流动相b由75:25渐变为30:70；6.5min至8.0min，流动相a : 流动相b维持30:70比例；8.0min至8.1min，流动相a : 流动相b由30:70渐变为98:2；8.1min至12.0min，流动相a : 流动相b维持98:2；共计运行12.0min。
11.在本发明的一个方面中，所述流动相a为0.77g/l乙酸铵水溶液（ph为5.0）。
12.在本发明的一个方面中，所述流动相流速为0.45-0.55 ml/min，优选为0.50 ml/min。
13.在本发明的一个方面中，色谱柱的柱温为45-55 ℃，优选为50 ℃。
14.在本发明的一个方面中，所述质谱条件包括：电喷雾离子化离子源；离子喷射电压：5500v；温度550℃；源内气体1（gs1，n2）压力55psi；源内气体2（gs2，n2）压力：55psi；气帘气体（cur，n2）压力：40psi；去簇电压（dp）：85v，95v；碰撞能量（ce）：20ev，32ev；扫描方式：多重反应监测（mrm）。
15.在本发明的一个方面中，所述质谱条件中定量离子为326.1/308.2 m/z；定性离子为326.1/266.6 m/z。
16.在本发明的一个方面中，提供了一种检测羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮含量的方法，采用超高效液相色谱与质谱联用技术，超高效液相色谱采用乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相；色谱柱waters acquity csh c18，流动相的梯度条件如下：
在本发明的一个方面中，所述检测方法，包括如下步骤：（1）制备多个含有不同7,8-二脱氢纳洛酮浓度的标准曲线溶液，分别注入超高效液相色谱-质谱仪，测定后，以定量离子的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线；（2）将含有羟考酮纳洛酮缓释片的供试品溶液注入超高效液相色谱-质谱仪，所得定量离子的峰面积带入标准曲线，计算7,8-二脱氢纳洛酮的含量。
17.在本发明的一个方面中，所述标准曲线溶液和供试品溶液以40%的甲醇水溶液作为溶剂进行制备。
18.在本发明的一个方面中，所述检测方法，包括以下溶液的配制：（1）空白辅料溶液：取羟考酮纳洛酮缓释片对应的辅料，加入40%甲醇水溶解，即得；（2）标准曲线溶液：取7,8-二脱氢纳洛酮标准品和空白辅料溶液，用40%甲醇水溶液稀释至不同浓度，即得；（3）供试品溶液：取羟考酮纳洛酮缓释片，加入40%甲醇水溶液，使缓释片完全崩解，即得；其中，标准曲线溶液和供试品溶液中各辅料浓度相同。
19.在本发明的一个方面中，提供一种羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮含量的检测方法，采用超高效液相色谱与质谱联用技术进行检测，所述羟考酮纳洛酮缓释片含有羟考酮或其盐、纳洛酮或其盐，和药学上可接受的辅料；所述辅料选自聚乙酸乙烯酯/聚乙烯吡咯烷酮混合物、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、二氧化硅和硬脂酸镁中的一种或多种；超高效液相色谱采用乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相；色谱柱waters acquity csh c18，流动相的梯度条件如下：
在本发明的一个方面中，所述检测方法包括以下步骤：（1）配制溶液：空白辅料溶液：取羟考酮纳洛酮缓释片对应的辅料，加入40%甲醇水溶解，即得；标准曲线溶液：取7,8-二脱氢纳洛酮标准品和空白辅料溶液，用40%甲醇水溶液稀释至不同浓度，即得；供试品溶液：取羟考酮纳洛酮缓释片，加入40%甲醇水溶液，使缓释片完全崩解，即得；其中，标准曲线溶液和供试品溶液中各辅料浓度相同；（2）将不同浓度的标准曲线溶液，分别注入超高效液相色谱-质谱仪，测定后，以定量离子的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线；（3）将含有羟考酮纳洛酮缓释片的供试品溶液注入超高效液相色谱-质谱仪，所得定量离子的峰面积带入标准曲线，计算7,8-二脱氢纳洛酮的含量；所述超高效液相的色谱柱为c18色谱柱，优选为waters acquity csh c18；流动相为乙酸铵水溶液-乙腈；所述质谱条件包括：电喷雾离子化离子源；离子喷射电压：5500v；温度550℃；源内气体1（gs1，n2）压力55psi；源内气体2（gs2，n2）压力：55psi；气帘气体（cur，n2）压力：40psi；去簇电压（dp）：85v，95v；碰撞能量（ce）：20ev，32ev；扫描方式：多重反应监测（mrm）；定量离子为326.1/308.2 m/z；定性离子为326.1/266.6 m/z。
20.进一步地，所述色谱柱的柱温优选为45-55 ℃；流动相流速优选为0.45-0.55 ml/min，流动相a为0.77g/l乙酸铵水溶液（ph为5.0）；流动相采用梯度洗脱，梯度条件如下：
在本发明的一个方面中，所述羟考酮纳洛酮缓释片包含羟考酮或其盐、纳洛酮或其盐和药物上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包含聚乙酸乙烯酯/聚乙烯吡咯烷酮混合物、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、二氧化硅和硬脂酸镁中的一种或多种。
21.在本发明的一个方面中，所述羟考酮的盐为盐酸羟考酮；纳洛酮的盐为盐酸纳洛酮或其水合物，所述水合物优选为盐酸纳洛酮二水合物或二盐酸纳洛酮水合物。
22.在本发明的一个方面中，所述羟考酮纳洛酮缓释片中药物上可接受的辅料的重量含量为70-96%，优选为75-85%。
23.本发明所述的聚乙酸乙烯酯/聚乙烯吡咯烷酮混合物可以选自kollidon
®
sr为商标名出售的产品。
24.本发明所述羟考酮纳洛酮缓释片中各组分的含量，本领域技术人员可根据临床需求进行相应调整；其制备方法可采用常规方法，优选采用cn102266302b（其全部内容通过引用的方式合并入本技术）实施例5公开的处方和制备方法。对于不同组分含量和不同制备方法制备得到的羟考酮纳洛酮缓释片，本发明提供的检测方法均能用于检测7,8-二脱氢纳洛酮的含量。
25.本发明相对于现有技术的有益效果如下：1.检测方法具有优异的专属性，可避免制剂中其他成分的干扰，提高分离度；2.检测方法准确性高，能准确检测羟考酮纳洛酮缓释片中7,8-二脱氢纳洛酮的含量；3.检测方法灵敏度高，定量限可达1.2ng/ml，检测限可达0.6ng/ml，能够对羟考酮纳洛酮缓释片中痕量的7,8-二脱氢纳洛酮进行检测。
附图说明
26.图1为实施例1色谱柱1所得供试品溶液的色谱图。
27.图2为实施例1色谱柱2所得供试品溶液的色谱图。
28.图3为实施例1色谱柱3所得供试品溶液的色谱图。
29.图4为实施例1色谱柱4所得供试品溶液的色谱图。
30.图5为实施例1色谱柱5所得供试品溶液的色谱图。
31.图6为实施例2梯度2所得供试品溶液的色谱图。
32.图7为实施例2梯度3所得供试品溶液的色谱图。
33.图8为实施例3标准曲线图，其中横坐标为对照品溶液加入体积（微升），纵坐标为峰面积。
34.图9为实施例7.1空白辅料溶液的色谱图。
35.图10为实施例7.1标准曲线溶液6的色谱图。
具体实施方式
36.实施例1色谱柱的研究1.1试验材料和试验仪器：1.1.1试验材料：羟考酮/纳洛酮缓释片：按照cn102266302b的实施例5制备
乙腈/甲醇：merck乙酸铵/冰醋酸：国药集团化学试剂有限公司7,8-二脱氢纳洛酮对照品：edqm羟丙甲纤维素606：信越化学工业株式会社微晶纤维素ph102：dupont nutrition usa.inc.聚醋酸乙烯酯聚维酮混合物：basf.se硬脂酸镁：peter greven gmbh&co.kg二氧化硅：grace gmb&co.kg1.1.2 试验仪器：超高效液相色谱-质谱联用仪：waters acquity uplc/ab sciex qtrap 65001.2 溶液的配制1.2.1 空白辅料溶液的制备称取羟丙甲纤维素606约8.80mg、微晶纤维素ph102约604.32mg、聚醋酸乙烯酯聚维酮混合物约604.32mg、硬脂酸镁约7.28mg、二氧化硅约2.94mg置同一50ml量瓶中，加甲醇20ml，电磁搅拌2h，再加水定容至刻度，摇匀即得。
37.1.2.2 空白溶液的制备精密量取空白辅料溶液400μl、40%甲醇水溶液1600μl混匀即得。
38.1.2.3对照品溶液的制备精密称取7,8-二脱氢纳洛酮标准品约12.0mg置200ml量瓶中，加甲醇80ml溶解，再用水稀释至刻度并摇匀，精密量取上述溶液1ml置500ml量瓶中，加40%甲醇水溶液稀释至刻度并摇匀。
39.1.2.4 供试品溶液的制备（1）样品溶液的制备取羟考酮纳洛酮缓释片8片置于50ml量瓶中，加入相当于总体积40%的甲醇，电磁搅拌至少2h使药片完全崩解，再水稀释至刻度，搅拌30min，可见悬浮粒子出现，离心取上清液。
40.（2）供试品溶液的制备精密量取样品溶液400μl、40%甲醇水溶液1600μl混匀即得。
41.1.3 色谱条件和质谱条件1.3.1色谱条件流动相a：0.77g/l乙酸铵水溶液（用冰醋酸调节ph=5.00）；流动相b：乙腈；流速：0.5ml/min；柱温：50℃；进样体积：10μl。
42.色谱柱：见表1 表1 色谱柱型号
梯度洗脱：见表2表2 流动相梯度1.3.2 质谱条件离子源：电喷雾离子化（esi）；离子喷射电压：5500v；温度：550℃；源内气体1（gs1，n2）压力：55psi；源内气体2（gs2，n2）压力：55psi；气帘气体（cur，n2）压力：40psi；扫描方式：多重反应监测（mrm）；去簇电压（dp）：85v，95v；碰撞能量（ce）：20ev，32ev。
43.7,8-二脱氢纳洛酮定量离子反应（m/z）：326.1/308.2；7,8-二脱氢纳洛酮定性离子反应（m/z）：326.1/266.6。
44.1.4 试验方法和试验结果取对照品溶液、供试品溶液分别进样，供试品溶液的色谱图见图1-图5。
45.结果显示：使用色谱柱1和色谱柱2时，供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮未达到基线分离（见图1和图2）；使用色谱柱3时，供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮柱效较高，虽基本达到基线分离，但受基线影响较大，对色谱峰积分会造成影响，同时出峰时间较长（见图3）；使用色谱柱4时，供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮受基线影响严重，对色谱峰积分造成干扰，同时出峰时间较长（见图4）；使用色谱柱5时，供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮基本达到基线分离，整体基线较为平稳，且保留时间较短（见图5）。因此，选择色谱柱5做进一步研究。
46.实施例2 洗脱梯度的研究流动相的梯度洗脱条件如表3所示，色谱柱为waters acquity csh c18 2.1mm
×
150mm，1.7um，其他试验条件和方法与实施例1相同。供试品溶液的色谱图见图5-图7。
47.表3 流动相梯度
结果显示，采用梯度1时，7,8-二脱氢纳洛酮与相邻色谱峰无法实现完全分离（见图5）；采用梯度2时，7,8-二脱氢纳洛酮基本实现基线分离状态，但7,8-二脱氢纳洛酮理论塔板数较低（见图6）；采用梯度3时，7,8-二脱氢纳洛酮呈现良好的基线分离状态，整体色谱图基线更为平稳且理论塔板数较高（见图7），符合对7,8-二脱氢纳洛酮进行定量分析的要求。
48.实施例3 样品检测标准曲线溶液1~6的制备：分别按照表4体积精密量取空白辅料溶液、对照品溶液、40%的甲醇水溶液，混匀即得标准曲线溶液1~6。
49.表4 标准曲线溶液1~6的组成色谱柱为waters acquity csh c18 2.1mm
×
150mm，1.7um，流动相梯度选择实施例2的梯度3，其他试验条件与实施例1相同。
50.取空白溶液、标准曲线溶液（1-6）、供试品溶液（平行制备两份）进样；以标准曲线溶液的峰面积为纵坐标、标准曲线的x（μl）为横坐标制作标准曲线；依据标准曲线法以峰面积计算样品中7,8-二脱氢纳洛酮含量。
51.计算方法如下：标准曲线线性回归方程为：y=ax b
wd：对照品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮称样量，mg；sd：供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮峰面积。
52.试验结果见表5和图8。
53.表5 标准曲线溶液和供试品溶液试验结果实施例4 流动相不同流速的研究4.1 流动相流速为0.5ml/min加标供试品溶液的制备：精密量取实施例1的样品溶液400μl、对照品溶液100μl、40%的甲醇水溶液1500μl混匀即得。其他试验条件、试验方法与实施例3相同，检测加标供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮含量，试验结果见表6。
54.表6 标准曲线溶液和供试品溶液试验结果4.2 流动相流速为0.45ml/min或0.55ml/min将实施例4.1中流动相的流速调整为0.45ml/min或0.55ml/min，其他条件与实施例4.1相同，测试加标供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮含量。与表6的检测结果进行对比，试验结果见表7。
55.试验结果显示：流动相的流速为0.45-0.55ml/min，检测结果变化很小。
56.表7不同流速的试验结果 实施例5流动相不同ph的研究将实施例4.1色谱条件中流动相a的ph分别调整为4.80、5.20，其他条件与实施例4.1相同，测试加标供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮含量。并与实施例4.1的检测结果进行对比，试验结果见表8。
57.试验结果显示：流动相a的ph为4.80-5.20时，检测结果变化很小。
58.表8流动相不同ph的试验结果
实施例6 色谱柱柱温的研究将实施例4.1色谱条件中色谱柱的柱温分别调整为45℃、55℃，其他条件与实施例4.1相同，测试加标供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮含量。并与实施例4.1的检测结果进行对比，试验结果见表9。
59.试验结果显示：色谱柱的柱温为45-55℃，检测结果变化很小。
60.表9 不同柱温的试验结果
实施例7 方法学验证7.1 专属性试验按照实施例3的色谱条件和质谱条件，分别测试空白辅料溶液、标准曲线溶液6，试验结果见图9-10。
61.试验结果显示，7,8-二脱氢纳洛酮保留时间为4.78 min，空白辅料溶液在7,8-二脱氢纳洛酮保留时间处无干扰，标准曲线溶液6中7,8-二脱氢纳洛酮保留时间附近无相邻峰；由此可见，本发明所提供的检测方法具有很好的专属性。
62.7.2 检测限试验采用信噪比法，对实施例3中的标准曲线溶液，调整加入对照品溶液的体积x，使该浓度下待测物的检测信噪比（s/n）≥ 3。
63.试验结果：检测限浓度为0.0006μg/ml，两次测定结果见表10。
64.表10 检测限试验结果7.3 定量限试验
采用信噪比法，对实施例3中的标准曲线溶液，调整加入对照品溶液的体积x，使该浓度下待测物的检测信噪比（s/n）≥ 10，且6次测定结果的峰面积rsd≤10.0%。
65.试验结果：定量限浓度为0.0012μg/ml，6次测定结果见表11。
66.表11 定量限试验结果7.4 线性范围（1）可接受标准线性相关系数，r≥0.990；标准曲线溶液中7,8-二脱氢纳洛酮准确度应在85%~115%之间；截距的绝对值≤100%限度响应值的25%；剩余标准差≤100%限度响应值的10.0%。
67.（2）试验方法和结果标准曲线溶液1~7的制备：分别按照表12体积精密量取空白辅料溶液、对照品溶液、40%的甲醇水溶液，混匀即得标准曲线溶液1~7。
68.表12 标准曲线溶液1~7的组成在实施例3的色谱和质谱条件下，试验结果见表13。
69.表13 线性范围试验结果
试验结果显示，在0.0012μg/ml-0.0480μg/ml浓度范围内，7,8-二脱氢纳洛酮浓度与相应峰面积呈线性相关。
70.7.5 准确度试验精密量取实施例1的样品溶液400μl、对照品溶液20 μl、100 μl或200μl，分别用40%的甲醇水溶液稀释至1600 μl，混匀后分别得到低、中、高三个浓度的加标供试品溶液，每个浓度平行制备3份。
71.采用实施例3的色谱条件和质谱条件进行检测。
72.按照以下方式计算回收率，试验结果见表14：标准曲线线性回归方程为：y=ax bwd：对照品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮称样量，mg； sd：供试品溶液中7,8-二脱氢纳洛酮峰面积。
73.表14 准确度试验结果
表中已有量*的数据是实施例3的检测结果。