2-十二烯二酸促进蒙氏假单胞菌生长和定殖的应用

1.本发明涉及农业领域，具体涉及三七根系分泌物2-十二烯二酸在促进三七根际有益蒙氏假单胞菌生长和定殖方面的应用。


背景技术：

2.云南是中药材三七的主产区，三七喜阴暖、潮湿的生长环境，连作障碍是限制三七产业健康发展的关键因素，严重影响了三七的产量和品质。目前用于缓解三七连作障碍的主要手段包括土壤熏蒸、作物轮作和生物防治等。土壤熏蒸往往使用一些高毒的化学熏蒸剂，其对环境的危害限制了其在实际生产中的应用；而作物轮作周期长，且适宜的用于缓解三七连作障碍的作物目前还未见在生产中的应用。利用有益微生物来缓解三七连作障碍具有低毒、无污染、环境友好等优点，是三七绿色生态防控的有效途径，但是微生物在三七根际的有效定殖限制了其在生产中应用。
3.蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41是申请人前期分离自三七根际土壤，既能降解三七生长过程中分泌到根际土壤中的自毒皂苷，又能明显拮抗根腐病菌的有益微生物，能明显缓解三七的连作障碍(cn201910935485.6)。但是如何增强蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41在三七根际的定殖仍然是该菌株能否应用于三七根腐病防治的问题之一。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种三七根系分泌物2-十二烯二酸在促进三七根际有益蒙氏假单胞菌生长和定殖方面的应用。
5.2-十二烯二酸是一种从菜豆中分离出来的单不饱和二元羧酸。白色至米色结晶粉末，常温差压下稳定，溶于水，溶于乙醇、甲醇、石油醚、氯仿。可引起膜磷脂过氧化的减少，是治疗许多与胶原蛋白生物合成障碍和氧化应激有关的皮肤疾病的潜在药物试剂。2-十二烯二酸也可从三七根系分泌物中找到。
6.本发明发现三七根系分泌物中的2-十二烯二酸在促进有益微生物蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41定殖、生长方面的应用潜力，其具有促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41的生长，促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41生物膜的形成，以及促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41在三七根际的定殖几方面的作用。
7.在第一个方面，本发明提供了一种2-十二烯二酸在促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)生长和定殖方面的应用。
8.在一个优选的实施方案中，所述应用包括对蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)使用2-十二烯二酸进行处理。
9.在一个优选的实施方案中，处理蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)的2-十二烯二酸以溶液形式施用，其浓度为1～2000μg/ml。
10.优选的，所述浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。所述浓度优选为1～1000μg/ml，进一步优选为1～100μg/ml，更优选为5～50μg/ml。
11.在一个优选的实施方案中，所述处理包括使得蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)与2-十二烯二酸接触一段时间。优选的，所述接触包括采用2-十二烯二酸培养蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)，或者将2-十二烯二酸与蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)一起加入到欲定殖的环境中，如土壤，特别是三七根际土。优选的，所述时间大于12h，更优选大于24h。
12.在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
13.在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
14.因此，优选的，所述应用包括将蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)、2-十二烯二酸一起添加到三七根际土，从而促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)在三七根际土中的定殖和生长。
15.在第二个方面，本发明提供了一种促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)生长和定殖的方法，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)使用2-十二烯二酸进行处理。
16.在一个优选的实施方案中，处理蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)的2-十二烯二酸以溶液形式施用，其浓度为1～2000μg/ml。
17.优选的，所述浓度为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。所述浓度优选为1～1000μg/ml，进一步优选为1～10μg/ml。
18.在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
19.在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
20.因此，优选的，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)、2-十二烯二酸一起添加到三七根际土，从而促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)在三七根际土中的生长和定殖。
21.本发明中，2-十二烯二酸在应用时，可与辅料制成水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等溶液剂型。其中，2-十二烯二酸的浓度为1～2000μg/ml，具体为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。所述浓度优选为1～1000μg/ml，进一步优选为1～10μg/ml。
22.在第三个方面，本发明提供了一种包含2-十二烯二酸的溶液制剂，其中2-十二烯二酸的浓度为1～2000μg/ml，具体为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。所述浓度优选为1～1000μg/ml，进一步优选为1～10μg/ml。
23.所述制剂的剂型包括水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等。
24.在第四个方面，本发明提供了2-十二烯二酸在制备促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)的生长和定殖的制剂中的应用。
25.在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
26.在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
27.在一个优选的实施方案中，所述制剂为溶液制剂，其中2-十二烯二酸的浓度为1～2000μg/ml，具体为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml。所述浓度优选为1～1000μg/ml，进一步优选为1～10μg/ml。
28.所述制剂的剂型包括水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等。
29.本发明中，所述蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)包括蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41，其保藏信息如下：保藏编号为cgmcc no.18491；分类命名为：蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2019年9月16日。
30.有益效果：
31.本发明提供了三七根系分泌物2-十二烯二酸在促进三七根际有益蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)生长和定殖方面的应用。本发明通过使用2-十二烯二酸作为蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41的外源添加物，评价2-十二烯二酸在蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41生长和定殖过程中的作用，有利于解析三七根系分泌物中2-十二烯二酸在促进有益微生物蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41生长和定殖中发挥的功能。趋化试验中，蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41对1～1000μg/ml浓度的2-十二烯二酸具有显著的趋化效应，促生试验中，10～1000μg/ml浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41的生长，1～1000μg/ml浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41生物膜的形成，定殖试验中，10μg/ml浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41在三七根际的定殖。因此在有益微生物蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41的使用中，使用10μg/ml浓度的2-十二烯二酸既能够促进蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41的生长、生物膜形成，也能够促进其在三七根际的定殖。
附图说明
32.图1：蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)pm-41对2-十二烯二酸的趋化效应测定(不同小写字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著)；
33.图2：2-十二烯二酸对蒙氏假单胞菌pm-41生长的效应测定；
34.图3：2-十二烯二酸对蒙氏假单胞菌pm-41生物膜形成的影响测定(不同小写字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著)；
35.图4：2-十二烯二酸对蒙氏假单胞菌pm-41在土壤中定殖能力的影响测定(*表示经t检验法检验与对照相比在p《0.05水平差异显著)。
具体实施方式
36.在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
37.应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。
38.实施例1：蒙氏假单胞菌pm-41对2-十二烯二酸的趋化效应
39.取100μl的菌液到900μl lb液体培养基中培养菌株2天，使其细菌浓度od
590
值达到0.6，准备无菌黄枪头，1ml注射器，lb平板培养基。用无菌水将2-十二烯二酸配制成不同浓度溶液(1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml)，超净工作台无菌条件下，用移液枪移取100μl菌液于黄枪头中，注射器中吸取100μl的2-十二烯二酸溶液，然后将注射器针头插入黄枪头中，平放在工作台上静置40min后，将注射器里液体转至无菌干净2ml小管里，用无菌水进行稀释10倍，100倍，1000倍，后取100μl进行涂板，28℃培养1天后观察并计数其菌落数。
40.图1的试验结果表明，菌株pm-41对浓度为1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml的2-十二烯二酸存在显著的趋化效应。说明菌株pm-41对2-十二烯二酸具有明显的趋化效果。
41.实施例2：2-十二烯二酸促进蒙氏假单胞菌pm-41生长和生物膜形成
42.取100μl的菌液到900μl lb液体培养基中，28℃过夜培养，使其细菌菌浓度od
590
值达到0.4，取20μl菌液添加到96孔板180μl的不同浓度(1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml)2-十二烯二酸1/10lb溶液中，28℃静置培养52h，在培养期间测量菌株od
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值，绘制生长曲线；并在培养52h后，用结晶紫法测定菌株在不同浓度代谢物下生物膜的形成情况。
43.图2试验结果表明，培养48h后，10-1000μg/ml 2-十二烯二酸能明显促进菌株生长。图3试验结果表明，培养52h后，1，50，100，1000μg/ml2-十二烯二酸均能促进菌株生物膜形成，其中1000μg/ml浓度具有显著的促进作用。
44.实施例3：2-十二烯二酸促进蒙氏假单胞菌pm-41在根际土中的定殖
45.筛选氯霉素和利福平抗性标记的蒙氏假单胞菌pm-41，培养2d后使其菌浓度od
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值达到0.6。每个组培瓶中装入三七根际土，添加17ml溶液(5ml菌液 7ml浓度为10μg/ml的2-十二烯二酸溶液 5ml水/抗生素)，搅拌均匀后盖上盖子培养10d。在培养期间的第5天取5g土加入50ml灭菌水，在摇床上摇培30min，稀释10倍，100倍，1000倍后用移液枪吸取100μl并在添加了抗生素的tsa培养基上涂板，28℃下过夜培养后，记录菌落形成数量，评价蒙氏假单胞菌pm-41在土壤中的定殖效果。
46.图4试验结果表明，与空白对照相比，有2-十二烯二酸存在的条件下，接种后3、5、10d后蒙氏假单胞菌pm-41在土壤中的定殖菌落数均明显增加，表明10μg/ml 2-十二烯二酸的协同添加有利于促进蒙氏假单胞菌在三七根际的定殖。
47.以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。