恩度敏感细胞株的构建及其在恩度测活中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及恩度敏感细胞株的构建及其在恩度测活中的应用。


背景技术：

2.血管内皮抑制素（endostatin）是一种应用基因工程技术，将从小鼠内皮细胞系中分离得到的一种具有抑制血管内皮细胞作用的物质，用于治疗或复治的ⅲ/ⅳ期非小细胞肺癌患者，是癌症患者化疗的辅助药物。血管内皮抑制素为血管生成抑制类新生物制品，其作用机理是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移来达到抑制肿瘤新生血管的生成，阻断了肿瘤细胞的营养供给，从而达到抑制肿瘤增殖或转移目的。
3.endostatin活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保药物有效性的重要质控指标。目前未见有效的针对于endostatin活性测定的方法，本领域亟需一种能够稳定高效测定endostatin活性的方法。


技术实现要素：

4.为弥补现有技术的不足，本发明构建了一种endostatin敏感细胞株，建立一种更加敏感，稳定，高效的endostatin活性测定方法。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面提供了一种构建endostatin敏感细胞株的方法，所述方法包括敲低uts2。
6.进一步，包括通过rna干扰技术、同源重组技术、类转录激活效应子核酸酶技术、锌指核酸酶技术、crispr技术敲低uts2。
7.进一步，通过rna干扰技术敲低uts2。
8.进一步，rna干扰技术进行敲低的靶序列如seq id no.3-5所示。
9.进一步，rna干扰技术进行敲低的靶序列如seq id no. 5所示。
10.进一步，所述rna干扰技术包括sirna、shrna、mirna。
11.进一步，所述rna干扰技术为shrna。
12.进一步，所述endostatin敏感细胞株选自内皮细胞。
13.进一步，所述内皮细胞选自血管内皮细胞。
14.进一步，所述血管内皮细胞包括静脉内皮细胞、动脉内皮细胞。
15.进一步，所述血管内皮细胞选自静脉内皮细胞。
16.进一步，所述静脉内皮细胞包括脐静脉内皮细胞、脑静脉内皮细胞。
17.进一步，所述静脉内皮细胞选自脐静脉内皮细胞。
18.进一步，所述脐静脉内皮细胞包括人类脐静脉内皮细胞和非人类动物脐静脉内皮细胞。
19.进一步，所述脐静脉内皮细胞选自人脐静脉内皮细胞。
20.本发明的第二方面提供了一种endostatin敏感细胞株，所述endostatin敏感细胞株通过本发明第一方面所述的方法构建而成。
21.本发明的第三方面提供了一种检测endostatin活性的方法，所述方法包括使用本发明第二方面所述的endostatin敏感细胞株进行检测。
22.进一步，所述方法还包括将endostatin加入到endostatin敏感细胞株中孵育，通过比色法检测endostatin的活性。
23.进一步，所述比色法包括mtt法、xtt法、cck8法。
24.进一步，所述比色法为cck8法。
25.进一步，endostatin敏感细胞株的细胞密度为5000个细胞/ml-11000个细胞/ml。
26.进一步，endostatin敏感细胞株的细胞密度为9000个细胞/ml。
27.进一步，所述方法还包括调整endostatin的作用终浓度为0.1mg/ml。
28.本发明的第四方面提供了如下任一项应用：（1）uts2在构建endostatin敏感细胞株中的应用；（2）本发明第二方面所述的endostatin敏感细胞株在检测endostatin活性中的应用。
29.本发明的优点和有益效果：本发明提供的endostatin敏感细胞株及检测endostatin活性的方法补充了《中国药典》对此类重组蛋白类药物无活性测定方法的空白，扩展了此类重组的蛋白类药物活性测定的思路，不需要进行动物实验，操作简单，敏感度高，结果可靠，准确度高，变异小。
附图说明
30.图1是不同浓度的endostatin对敏感细胞的抑制结果图；图2是敏感细胞与原代细胞对比图；图3是不同细胞密度检测endostatin活性的结果图；图4是不同预稀释倍数检测endostatin活性的结果图。
具体实施方式
31.下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
32.本发明提供了一种构建endostatin敏感细胞株的方法，所述方法包括敲低uts2。
33.在本发明中，endostatin与血管内皮抑制素可互换使用，本发明所述的内皮抑制素可以指天然血管内皮抑制素，也可以指重组的血管内皮抑制素，也可以指血管内皮抑制素的功能性变体，例如工程化的功能性变体，它与天然血管内皮抑制素相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，并具有基本相同的生物学功能，例如抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的活性。“血管内皮抑制素”还可以指天然血管内皮抑制素或其功能性变体的衍生物或修饰产物，例如聚乙二醇修饰产物。
34.在本发明中，endostatin敏感细胞株选自内皮细胞。
35.所述内皮细胞包括但不限于血管内皮细胞、肾内皮细胞、肺内皮细胞。
end joining）修复dna，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除/敲低突变体。
49.锌指核酸酶（zfn），又名锌指蛋白核酸酶，由一个dna识别域和一个非特异性核酸内切南构成。dna识别域是由一系列cys2-his2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3-4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族，在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。单个锌指的alpha螺旋插入dna双螺旋的大沟，特异性识别dna序列上3个连续碱基，并与之结合。zfn是一个带定位系统的基因剪刀，锌指蛋白用于识别和结合特定的基因序列，foki核酸内切酶可以通过二聚体化特异性地切割目的基因，并且可以切割真核基因组的任意识别序列。
50.crispr是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋白质cas和crispr-rna（crrna）组成。目前该系统已发现有三种类型，其中第二类cas9系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。cas9靶向切割dna是通过两种小rna—crrna（crisprrna）和tracrrna（trans-activatingcrrna）与靶序列互补识别的原理实现的。现在已经将两种小rna融合成一条rna链，简称sgrna（singleguiderna），能够识别特定的基因序列，引导cas9蛋白进行切割。
51.rna干扰技术是将双链rna导入细胞引起特异基因rna降解的一种细胞反应过程，涉及多种蛋白质共同参与。双链rna进入细胞内后，会被核酶切割成只有21-23nt的小分子rna片段，即sirna，随后的sirna与细胞质内的rna诱导沉默复合体（risc）结合，并解旋成单链。其中的正义链会被降解，剩下的反义链会引导risc与相应互补的mrna结合，致使risc切断这段mrna并使其降解，以导致其无法翻译出蛋白质或调控基因表达。
52.在本发明的实施方案中，利用rna干扰技术敲低uts2。
53.rna干扰的类别包括但不限于sirna（short/small interfering rnas）、microrna（mirna，微小rna）、shrna（rna-short hairpin rnas）。
54.sirna指能够引导或介导rna干扰通路的包含约19至50个核苷酸（或核苷酸类似物）的核糖核酸（rna）或rna类似物。这些分子的长度可以不同，并且在其反义链中可以包含针对靶标信使rna（mrna）的不同程度的互补性。术语“sirna”包括两条单独的链的双链体（即双链rna）以及可以形成由双链体区域组成的发卡结构的单链。sirna的长度可以是约19至50个核苷酸、或者约25至50个核苷酸、或者约30至50个核苷酸、或者约35至50个核苷酸、或者约40至50个核苷酸。
55.microrna（mirna，微小rna）通常指单链分子，但是在特定实施方案中，其也可以涵盖与同一单链分子的另一区域或者与另一核酸部分（链长10％至50％互补）、基本（链长大于50％但小于100％互补）或完全互补的区域或其它链。因此，核酸可以涵盖这样的分子：其包含一条或多条互补链或自身互补链，或者分子所包含的特定序列的“互补物”。
56.shrna指能够进行rnai并含有随从链、环和引导链的单分子rna。随从链和引导链可以互相基本互补。术语“shrna”还可以包括含有除核糖核苷酸部分之外的部分的核酸，包括但不限于：修饰的核苷酸、修饰的核苷酸间的键、非核苷酸、脱氧核苷酸以及核苷酸的类似物。
57.在本发明的具体实施方案中，利用shrna抑制uts2的表达。
58.在本发明中，“靶序列”或“靶位点”指的是基因组核酸序列，其限定了在足以发生
结合的条件下可以与结合分子特异性地结合的核酸部分。
59.所述uts2的敲低靶序列如seq id no.3-5所示。
60.所述uts2的敲低靶序列如seq id no. 5所示。
61.本发明提供了一种检测endostatin活性的方法，所述方法包括使用上述endostatin敏感细胞株进行检测。
62.在本发明中，所述endostatin活性检测的方法包括但不限于染色计数法、克隆（集落）形成法、比色法。
63.在本发明的实施方案中，所述endostatin活性检测的方法为比色法。
64.所述比色法包括但不限于mtt法、xtt法、cck8法、alamar blue法、乳酸脱氢酶（ldh）释放法、srb法、atp含量测定法。
65.mtt法又称mtt比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（dmso）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
66.xtt是异种与mtt类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当xtt与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。
67.cck8法（cell counting kit-8）是一种基于wst-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。wst-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐），是一种类似于mtt的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxy pms）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
68.alamar blue的主要成分是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530-560nm，而散射峰为590nm。
69.srb是一种蛋白质结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比。
70.在本发明的具体实施方案中，使用cck8法检测endostatin细胞的活性。
71.具体方法包括：1）细胞培养：endostatin敏感细胞（即敏感huvec细胞）及原代huvec细胞添加胎牛血清、ecgs、p/o solution的ecm培养基于37℃、5%co2的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。
72.2）加药：endostatin以0.1mg/ml为初始浓度用缓冲液进行2倍系列稀释成8个浓度梯度，每个浓度梯度设置两个平行复孔。在96孔板内每孔加入40μl药物。
73.3）接种：细胞用0.25%的胰酶消化，1000rpm离心5分钟，弃上清，用培养基重悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为9000个/ml，在前面的96孔板中每孔加入
160μl细胞悬液，置37℃，5%co2培养箱中培养96小时。
74.4）检测：采用cck8测定，每孔加入22μl cck8，置37℃，5%co2培养箱中培养3小时后使用酶标仪于450nm波长下测定od值。
75.下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例
76.1．材料与方法1.1 实验材料huvec原代细胞：实验室留存；endostatin成品：中国食品药品检定研究院重组药物室留存；pcdh-flag质粒：军科院保存；sv40片段：中检院保存；hek293t细胞：军科院保存；pspax2，pmd2g：协和血液所赠送；crisprv2-a, crisprv2-b：购买于addgene；lipofectamine3000：购自invitrogenel3000015；polybrene：购自santa cruz；puromycin：购自solarbio；pleti-crisprv2：军科院留存；jlvu6-gfp-kan-puro：购自金思拓。
77.实验试剂pei转染试剂：50
×
tae缓冲液（生工，b548101，中国）、cell counting kit-8 （cck-8）（dojindo laboratories，ck04-1000t，japan）、台盼蓝染液（15250-061，gibco，usa）、pbs，ph 7.2（20012027，gibco，usa）、0.25%胰蛋白酶溶液（25200-056，gibco，usa）。
78.293t生长培养基：dmem（gibco，c11995500bt） 10%胎牛血清（gibco，#10099） 1%双抗（gibco，#15240）。
79.huvec生长培养基：ecm（sclencell，#1001） 5%胎牛血清（sclencell，#0025） 1�gs（sclencell，#1052） 1%p/osolution（sclencell，#0503） 1%双抗（gibco，#15240）。
80.96孔板：corning，3635。
81.cck8：dojindo，ck04。
82.实验仪器pcr仪（ptc-200，mj research，usa）；电泳仪（powerpac 300，bio-rad，usa）；凝胶成像仪（5200 multi，tanon，china）；96-well cell plate（3903，costar，usa）；高速离心机（5424，eppendorf，usa）；高速冷冻离心机（auegra x22，beckman，usa）；高速低温离心机（5417r，eppendorf，usa）；超净工作台（jjt-1300，北京月坛，中国）；数据分析软件；softmax pro软件；graphpad prism软件。
83.1.2 实验方法1.2.1构建永生化huvec细胞1）构建pcdh-flag-sv40质粒，引物如表1所示。
84.pcr扩增sv40片段并与载体连接，转化后涂板，挑菌落单克隆pcr鉴定并测序，筛选序列正确的菌液，进行质粒扩增。
85.2）构建表达sv40的huvec细胞
①
用293t细胞包装慢病毒（包装质粒：pspax2 2.25μl，pmd2g 0.75μl；目的质粒：p选自cdh-flag-sv40 3μl），将三种质粒加入到300μl dmem基础培养基中，混匀静置5min，将6μl 10
×
pei入到300μl dmem基础培养基中，混匀静置5min，将二者混匀静置25min，均匀滴入293t细胞中，10-12h后换8ml ecm培养基，换液后24hr收集上清放于4℃冰箱保存，再在细胞中加入8ml ecm培养基，24hr后收集上清，将此次上清与前一天上清混匀后，用0.45μm滤器过滤后分装，储存于-80℃冰箱。
86.②
慢病毒感染huvec细胞感染前一天将huvec传代使其感染病毒时密度在30%-40%，感染前30min，每皿huvec加入含10μg/ml polybrene的ecm培养基放到co2培养箱培养，30min后每皿huvec加入4ml慢病毒，感染后24hr更换新鲜ecm培养基，感染后细胞无抗性，且huvec细胞在无大t抗原即sv40的情况下10代之后会死亡，故将感染慢病毒后的huvec（命名为huvec-flag-sv40）传至10代，存活下来的即为稳定表达大t抗原的huvec细胞系，并用western blot检测是否表达sv40蛋白（看其是否表达flag）。
87.1.2.2 筛选敏感基因1）扩增慢病毒文库首先将293t细胞扩大培养，慢病毒包装crisprv2-a，crisprv2-b，转染293t细胞。
88.各自混匀5 min后，将b缓慢滴入a中，轻轻吹均匀，静置25 min，后滴入培养皿内，晃匀，放入37℃孵箱8 h后，弃掉含转染试剂的培养液换为新鲜培养，于换液后24 h和48 h分别收取含病毒培养液，将收取的病毒液混合后用0.45μm滤器过滤，分装，放在-80℃冰箱保存。
89.2）慢病毒感染huvec-flag-sv40，利用crispr文库筛选endostatin耐药基因
①
moi=0.4时所需病毒量为66.7μl。
90.②
当培养细胞总数》3.3
×
108时，取适量体积的细胞液进行接种，每个培养瓶初始接种3
×
106个细胞，一共接种75瓶，总细胞数约为2.25
×
108个细胞（2万个基因，每个基因6个靶点，250倍的覆盖率，共需要3份，同时moi=0.4）。（另外接种3瓶，其中2瓶不进行病毒感染作为对照组细胞，另一瓶用于计数确定此次实验moi是否为0.4）。
91.③
第二天待细胞贴壁后密度约为40%，将培养液吸去，每个培养瓶换入浓度为10μg/ ml含polybrene的ecm培养基10 ml，放入co2恒温培养箱结合30 min后，再向每瓶中加入10 ml ecm培养液和2 ml病毒液。
92.④
慢病毒感染24hr后撤去慢病毒，换成新鲜ecm培养基20ml，补加10ml含终浓度为2μg/ml puromycin 的ecm培养基。
93.⑤
当对照组未感染慢病毒用puromycin筛选全部死亡后，取对照组细胞和病毒感染过的细胞各一瓶，用计数枪进行计数，计算moi值。此时存活的细胞即为感染成功，带有文库sgrna的细胞。其余感染慢病毒的huvec-flag-sv40更换新鲜ecm培养基30ml。
94.⑥
将存活的细胞继续加含终浓度为2μg/ml puromycin 的ecm培养基抗性筛选3天，根据细胞计数结果将细胞分为3组，每组为6.0
×
107，即文库sgrna靶点覆盖500倍。其中作为day0细胞组并命名为huvec p0，作为sgrna测序基准线使用，1500 rpm离心5 min，弃上清液，用pbs重悬清洗两次，弃上清液，直接放入-80℃冰箱保存，将其余两组细胞接种在40个175 mm2培养瓶中，每组20瓶，分为加药筛选组和空白对照组，每个培养瓶初始接种细胞数为3
×
106。
95.⑦
选择endostatin终浓度为100μg/ml进行筛选，不加药组和加药组继续常规培养，等待加药组和对照组细胞增殖至≤1.2
×
108时进行传代，每组接种数量均为6.0
×
107，
并做记录对比两组细胞的增殖差异。两组细胞分别需要筛选8-10代，以确保潜在目的基因的稳定富集。
96.⑧
将两组细胞按照1500 rpm离心5 min，弃上清液，用pbs重悬清洗两次，弃上清液收集细胞，将收集完成的day0组、加endostatin组、空白对照组3组细胞以及a、b文库质粒各20μl标识清楚，干冰寄送上海寻百会生物科技有限公司进行全基因组测序后即可得到潜在目的基因。
97.3）根据测序结果，共选择了六个潜在基因，进行基因单独敲除后，根据cck8实验结果，最终确定敲除基因为uts2。
98.1.2.3构建对endostatin敏感的基因敲低质粒1）基因敲低靶序列（表3）2）将靶序列构建到jlvu6-gfp-kan-puro质粒上。
99.3）hek293t包装慢病毒（方法同上），将慢病毒用0.45μm滤器过滤后分装，储存于-80℃冰箱。
100.4）慢病毒感染huvec-flag-sv40（方法同上），将细胞命名为huvec-uts2 1# （seq id no.3）、huvec-uts2 2#（seq id no.4）、huvec-uts2 3#（seq id no.5）。
101.5）cck8检测uts2基因敲低后是否对endostatin敏感。
102.①
细胞培养将原代huvec细胞以及敏感huvec细胞用添加胎牛血清、ecgs、p/o solution的ecm培养基于37℃、5%co2的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。
103.②
加药endostatin成品的浓度是5mg/ml，以此为初始浓度用缓冲液进行2倍系列稀释成8个浓度梯度，每个浓度梯度设置两个平行复孔。在96孔板内每孔加入40μl药物。
104.③
接种细胞用0.25%的胰酶消化，1000rpm离心5分钟，弃上清，用培养基重悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，在前面的96孔板中每孔加入160μl细胞悬液，置37℃，5%co2培养箱中培养96小时。
105.④
检测采用cck8测定，每孔加入22μl cck8，置37℃，5%co2培养箱中培养3小时后使用酶标仪于450nm波长下测定od值。
106.1.2.4 endostatin敏感细胞活性测定方法建立
1.2.4.1预稀释倍数的确定根据前面的试验结果，细胞密度为800个/孔，成品浓度为5mg/ml，不稀释，药物作用时间为96h，cck8检测。
107.1.2.4.2比较不同细胞密度的线性反应根据前面的试验结果，endostatin预稀释浓度为1mg/ml，药物作用时间为96h，检测细胞密度分别为5000，7000，9000，11000，13000个/ml的剂量反应曲线。
108.1.2.4.3不同预稀释倍数的时间的线性反应根据前面的试验结果，细胞密度为9,000个/ml，调整endostatin作用终浓度为0.1 mg/l、0.3 mg/l、0.4 mg/l、0.5 mg/l，稀释倍数为2倍，检测不同起始浓度剂量反应曲线。
109.1.2.5方法学验证1.2.5.1准确性用新建方法对endostatin样品进行活性测定，制备质量浓度为预稀释液质量浓度（1 mg/ml）的75%、100%、125%和150%的溶液，每个剂量两个复孔，重复做三块板，连续重复四天。
110.1.2.5.2精密度用新建方法对endostatin样品进行活性测定，制备质量浓度为预稀释液质量浓度（1 mg/ml）的75%、100%、125%和150%的溶液，每个剂量两个复孔，重复做三块板，连续重复四天。
111.2．实验结果2.1 敏感细胞株cck8检测结果显示敲低uts2后永生化的huvec细胞对endostatin敏感敏感性较高（图1），其中，huvec-uts2-ko3#对endostatin的敏感性最好（图2）。
112.2.2 检测方法的建立分别对药物预稀释度，细胞铺板密度等参数进行了优化。通过比较ed
50
值和信噪比，初步确定了检测方案：细胞铺板密度为9,000个细胞/ml（图3），endostatin药物作用终浓度为0.1 mg/ml，2倍比稀释，药物刺激时间为96小时（图4）。
113.2.3 检测方法的建立2.3.1准确性如表4所示，75%、100%、125%和150%的溶液的回收率分别为（103.97
±
11.47）%，（99.84
±
8.70）%，（94.36
±
7.31）%，（103.97
±
12.30）%，rsd值均小于15%说明该方法具有良好的准确性。
114.2.3.2精密度如表5所示，重复做四天得到的平均相对生物学活性值之间的rsd值为2.12%-17.70%，说明精密度良好。
[0115]115.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。