一种β-葡聚糖胸腺五肽偶联物、制备方法及其在免疫调节和抗肿瘤药物、保健品的应用

一种
β-葡聚糖胸腺五肽偶联物、制备方法及其在免疫调节和抗肿瘤药物、保健品的应用
技术领域
1.本发明属于化学合成医药技术领域，具体涉及一种β-葡聚糖胸腺五肽偶联物、制备方法及其在调节免疫系统和抗肿瘤药物、保健品的应用。


背景技术：

2.β-葡聚糖是一类由葡萄糖残基通过β-糖苷键以不同连接方式组成的多糖，在自然界中广泛存在。天然来源的β-1,3-主链且具有/β-1,6-分支度葡聚糖主要存在于各种真菌、细菌与海藻中，且不同结构的β-葡聚糖有不同的生物活性。β-葡聚糖被广泛报道可以通过激活巨噬细胞、树突细胞等发挥免疫调节、抗炎、抗病毒及抗肿瘤等作用。
3.胸腺五肽(thymopentin,tp5)，是从胸腺激素中分离出来的多肽化合物胸腺生成素ⅱ的活性片段，其能促进胸腺和外周t淋巴细胞的分化和发育，具有与胸腺生成素ii相同的全部生理功能，对机体的免疫功能具有双向调节作用，是临床上重要的免疫平衡调节剂。胸腺五肽由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸和酪氨酸五种氨基酸组成，其氨基酸序列为arg-lys-asp-val-tyr。
4.胸腺五肽是一种肽类药物，适应症是针对原发性或继发性t细胞缺陷病人治疗。由于其易被胃酸降解，且在人体血液中很快被蛋白酶和氨肽酶降解，血浆半衰期仅约30秒。胸腺五肽由于其分子量较小，易被肾小球过滤清除，排入尿液。目前胸腺五肽在临床上注射用药剂量大，频率高，治疗周期长，使病人难以忍受，依从性差。因此，开发可延长胸腺五肽药物半衰期或提高血浆稳定性的衍生物具有重要的研究意义。
5.针对胸腺五肽半衰期短等问题，国内外主要通过开发长效胸腺五肽类似物来延长其半衰期以增加体内留存时间，或者通过剂型改造优化等方式达到长效制剂作用。此外，有研究表明也可通过对胸腺五肽结构进行功能化衍生修饰来提高血浆稳定性。
6.现有技术存在的技术问题为：目前没有研发出β-葡聚糖胸腺五肽偶联物并在在调节免疫系统和抗肿瘤药物、保健品的应用以及特殊医学用途配方食品应用的先例。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：(1)首次制备出β-葡聚糖胸腺五肽偶联物，制备方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点，可大规模产业化。(2)本发明一方面通过对胸腺五肽进行β-葡聚糖修饰，使其分子量增加，增加体内保留时间，降低血浆中酶降解清除率；另一方面通过对β
‑ꢀ
葡聚糖进行胸腺五肽修饰，可以协同发挥二者免疫调节作用，起到“1 1》2”的效果。基于本发明的制备方法得到的β-葡聚糖胸腺五肽偶联物具有显著免疫调节及抗肿瘤作用，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用胸腺五肽以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物显著。本发明可以用于制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物、制备
方法及其在调节免疫系统和抗肿瘤药物、保健品的应用。
9.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
10.一种β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物，所述β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物的结构如下：
[0011][0012]
其中所述糖肽偶联物结构式中n＝1～100，m＝1～30。
[0013]
β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物是通过β-葡聚糖还原端半缩醛基团与免疫调节药物胸腺五肽的氨基共价偶联得到糖肽偶联物(bg-tp)，β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物的具体制备方法如下：
[0014]
步骤1：将β-葡聚糖(bg,1e.q.)与胸腺五肽(tp5,10e.q.)溶解于二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂(83:17，v/v)中，氮气保护下，于60℃水浴中反应1小时；
[0015]
步骤2：氰基硼氢化钠(nabh3cn,25e.q.)溶于水中，加入上述反应溶液，继续反应24小时；再次加入氰基硼氢化钠(nabh3cn,25e.q.)固体粉末，继续反应24小时；
[0016]
步骤3：反应结束后，加入16％氯化钠(nacl)溶液，混匀，加入4～5倍体积无水乙醇醇沉，离心10分钟，沉淀再次加氯化钠溶液至刚好溶解，继续醇沉，反复3次后收集沉淀，透析48小时后经减压浓缩后经冷冻干燥即可得β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联的糖肽偶联物(bg-tp)。
[0017]
优选地，β-葡聚糖分子量为0.1kda～300kda，单糖组成以葡萄糖为主，其含量在95％以上，连接方式为主链由葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接而成，同时在主链上具有β-1,6分支，分支度为1％～30％。
[0018]
优选地，所选肽为胸腺五肽(thymopentin，tp5)和含有胸腺五肽活性片段 (rkdvy)的其他肽类药物类似物。
[0019]
优选地，所述二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂，二甲亚砜和乙酸二者体积比例为83:17(v/v)。
[0020]
优选地，β葡聚糖与胸腺五肽当量比为1:10；所述β葡聚糖与氰基硼氢化钠 (nabh3cn)当量比为1:50，所加入的氰基硼氢化钠为水溶液；在醇沉和透析过程中用到氯化钠溶液的浓度为4～32％。
[0021]
β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物制备路线图如下：
[0022][0023]
进一步，β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物在调节免疫系统和抗肿瘤的药物、保健品以及特殊医学用途配方食品的用途。所述药物、保健品以及特殊医学用途配方食品呈注射剂、粉针剂、口服液、片剂、胶囊、软胶囊以及散剂形式。
[0024]
进一步，β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物恢复免疫系统的用途，具体表现为对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型骨髓抑制状态具有显著改善作用，促进腹腔巨噬细胞吞噬能力，提高脾脏中淋巴细胞总数及cd4 /cd8 t比值恢复免疫系统的能力，以及促进小鼠血清中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子以及igg和siga等抗体分泌能力；所述β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物免疫调节的用途，具体为对 raw264.7巨噬细胞的无细胞毒性，可显著促进其吞噬能力以及细胞因子释放的能力，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用胸腺五肽以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物显著。
[0025]
进一步，所述β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物抗肿瘤的用途，具体为对4t1及 b16f10肿瘤模型小鼠具有抑制肿瘤生长作用，能促进小鼠血清中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子分泌能力。
[0026]
为了验证β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物的技术效果，发明人做了如下实验：
[0027]
技术效果一：β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物具有免疫调节作用，表现出对 raw264.7巨噬细胞的无细胞毒性，可显著促进其吞噬能力以及细胞因子释放的能力。为糖肽偶联物bg-tp开发为免疫增强剂、保健品以及特殊医学用途配方食品等提供依据。实验验证步骤如下：
[0028]
步骤一：将培养一定数量的raw264.7巨噬细胞用pbs重悬之后，按5
×
10
5 /孔数量接种于96孔板中，加入不同浓度的糖肽偶联物刺激24小时；通过cck8 法检测细胞增殖活力，中性红吞噬法检测吞噬能力，以及通过elisa试剂盒检测细胞上清液中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子分泌情况。结果表明糖肽偶联物bg-tp在所选浓度范围内无细胞毒性，细胞增殖活力都在80％以上，并且能够随剂量依赖性显著促进raw264.7巨噬细胞分泌il-1β等细胞因子，效果较单独使用β-葡聚糖(bg)、单独使用胸腺五肽(tp)以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物(bg tp)显著。
[0029]
技术效果二：β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物具有恢复免疫系统能力，表现出对免疫低下模型小鼠骨髓抑制状态具有显著改善作用，促进腹腔巨噬细胞吞噬能力，促进小鼠血清中细胞因子及抗体分泌以及维持免疫稳态能力。为开发为免疫增强剂、保健品以及特殊医学用途配方食品等提供依据。实验验证步骤如下：
[0030]
步骤三：7周龄bal/c小鼠，适应环境饲养2周后，将β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物(bg-tp)按4mg/kg、每3天给药一次的剂量，通过尾静脉给药方式给药，共计给药第9次。
[0031]
步骤四：将环磷酰胺按80mg/kg、连续给药3天的剂量，通过腹腔注射方式造免疫低下小鼠模型，3天后每天尾尖取血进行血常规分析监测其白细胞数，评价模型小鼠骨髓抑制
状态。结果显示，经环磷酰胺诱导后，其白细胞计数显著降低，糖肽偶联物bg-tp可提高白细胞计数，缓解环磷酰胺诱导的骨髓抑制。
[0032]
步骤五：处死小鼠，从小鼠腹腔中抽取腹腔巨噬细胞，评价不同给药组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；取新鲜脾脏组织，利用流式细胞术检测其脾脏中淋巴细胞总数及cd4 /cd8 t比值。结果显示，经环磷酰胺诱导后，模型小鼠脾脏中 cd4

t细胞数降低、cd8

t细胞数升高，造成cd4

/cd8

比值下降，糖肽偶联物bg-tp可显著改善并恢复cd4

/cd8

比值趋于正常值，表明其具有恢复免疫系统功能，维持免疫稳态能力
[0033]
步骤六：通过elisa试剂盒检测小鼠血清中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子以及igg和siga等抗体分泌情况。结果显示，经环磷酰胺诱导后，模型小鼠血清中tnf-α和ifn-γ等细胞因子以及igg和siga等抗体分泌显著降低，糖肽偶联物bg-tp可显著改善并恢复至正常水平，表明其具有显著恢复免疫调节功能作用。
[0034]
技术效果三：β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物(bg-tp)具有抗肿瘤作用，对4t1 及b16f10肿瘤模型小鼠具有抑制肿瘤生长作用，可促进小鼠血清中tnf-α、 il-1β和ifn-γ等细胞因子分泌，具有免疫抗肿瘤作用。为糖肽偶联物bg-tp开发为免疫增强剂、抗肿瘤药物以及特殊医学用途配方食品等提供依据。实验验证步骤如下：
[0035]
步骤七：7周龄c57小鼠，适应环境饲养2周后，通过尾静脉给药方式，按 4mg/kg、每3天给药一次的剂量，给予小鼠前述β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物 (bg-tp)。
[0036]
步骤八：第7次给药后，将培养一定数量的b16f10和4t1细胞用pbs重悬之后，细胞计数5～45
×
105/ml，以每只小鼠100微升剂量皮下接种到c57小鼠右肢腋下。每天监测肿瘤体积生长情况，待肿瘤体积长到1500mm3时停止实验。结果表明，β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物(bg-tp)对4t1和b16f10肿瘤模型小鼠的肿瘤生长具有显著抑制作用。
[0037]
步骤九：处死小鼠，取肿瘤组织及其他相关脏器，通过elisa试剂盒检测小鼠血清中tnf-α、il-1β等细胞因子和igg抗体分泌情况。结果显示，b16f10 肿瘤模型小鼠血清中tnf-α、il-1β等细胞因子和igg抗体分泌显著降低，糖肽偶联物bg-tp可显著改善并恢复至正常水平，表明其具有显著恢复免疫调节功能发挥抗肿瘤效果的作用。
[0038]
本发明的有益技术效果：(1)本发明一方面通过对胸腺五肽进行β-葡聚糖修饰，增加体内保留时间，降低血浆中酶降解清除率；另一方面通过对β-葡聚糖进行胸腺五肽修饰，可以协同发挥二者免疫调节作用，起到“1 1》2”的效果。(2) 本发明的方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点，适用于不同单糖种类、不同分子量及不同结构特征的糖类化合物与不同功能及药效的肽类药物共价偶联物的合成。(3)基于本发明制备方法得到的β-葡聚糖胸腺五肽偶联物具有显著免疫调节及抗肿瘤作用，且效果明显优于单独使用β
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葡聚糖、单独使用胸腺五肽以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物。(4)本发明得到的β-葡聚糖胸腺五肽偶联物可以用于制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品。
附图说明
[0039]
图1为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)合成路线图；
[0040]
图2为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)核磁氢谱图；
[0041]
图3为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)红外波谱图；
[0042]
图4为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)紫外全波长扫描图；
[0043]
图5为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)高分辨质谱图；
[0044]
图6为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)对raw264.7细胞免疫调节作用图；
[0045]
图7为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)对免疫低下小鼠免疫恢复能力图；
[0046]
图8为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)对4t1肿瘤模型抑制作用图。
[0047]
图9为β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)对b16f10肿瘤模型抑制作用图。
具体实施方式
[0048]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0049]
实施例1
[0050]
β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)的制备方法如下(如图1所示)：
[0051]
步骤一：将β-葡聚糖bg(100mg,0.02mm,1e.q.)与胸腺五肽tp5(136mg, 0.2mm,10e.q.)溶解于4ml二甲亚砜/乙酸混合反应溶剂(83:17，v/v)中，氮气保护下，于60℃水浴中反应1小时；
[0052]
步骤二：将氰基硼氢化钠(31.4mg,0.5mm,25e.q.)溶于水中，加入上述反应溶液，继续反应24小时；再次加入氰基硼氢化钠(31.4mg,0.5mm,25e.q.) 固体粉末，继续反应24小时。
[0053]
步骤三、反应结束后，加入2ml 16％氯化钠溶液，混匀，加入4～5倍体积无水乙醇醇沉，离心10分钟，沉淀再次加氯化钠溶液至刚好溶解，继续醇沉，反复3次后收集沉淀，透析48小时后经减压浓缩后经冷冻干燥即可得β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联的糖肽偶联物(bg-tp)。
[0054]
实施例2
[0055]
β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)的的结构表征步骤如下：
[0056]
(1)核磁氢谱表征：取5mg糖肽偶联物(bg-tp)，加入500μl重水，冻干，重复进行3次重水交换，加入500μl重水并转移到核磁管中，以氘代丙酮为内标，在25℃进行核磁共振谱分析。结果如图2所示，在6.75和7.05及0.75 ppm处出现胸腺五肽特征信号，表明糖肽偶联物(bg-tp)是由β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联而成。
[0057]
(2)红外波谱表征：取适量糖肽偶联物(bg-tp)通过kbr压片法进行红外波谱表征。结果如图3所示，在1500处出现胸腺五肽特征信号，表明糖肽偶联物(bg-tp)是由β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联而成。
[0058]
(3)紫外全波长扫描表征：取适量糖肽偶联物(bg-tp)通过200-600nm 紫外全波长扫描，结果如图4所示，在225和280nm处出现胸腺五肽特征信号，表明糖肽偶联物(bg-tp)是由β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联而成。
[0059]
(4)高分辨质谱表征：取适量糖肽偶联物(bg-tp)进行高分辨质谱表征，结果如图5所示，图中984.71～2281.46范围内出现z＝3的1579.24及1633.25等碎片离子，皆为不同聚合度的β-葡聚糖与胸腺五肽共价偶联的离子碎片。
[0060]
实施例3
[0061]
β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物(bg-tp)具有免疫调节作用，表现出对 raw264.7巨噬细胞的无细胞毒性，可显著促进其吞噬能力以及细胞因子释放的能力。为糖肽偶联物bg-tp开发为免疫增强剂、保健品以及特殊医学用途配方食品等提供依据。具体验证实验为：
[0062]
将培养一定数量的raw264.7巨噬细胞用pbs重悬之后，按5
×
105/孔数量接种于96孔板中，加入终浓度为2μm、6μm、18μm、54μm、162μm的β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)刺激24小时；通过cck8法检测细胞增殖活力，中性红吞噬法检测吞噬能力，以及通过elisa试剂盒检测细胞上清液中tnf-α、 il-1β和ifn-γ等细胞因子分泌情况。结果如图6所示，糖肽偶联物bg-tp在所选浓度范围内无细胞毒性，细胞增殖活力都在80％以上，并且能够随剂量依赖性显著促进raw264.7巨噬细胞分泌il-1β等细胞因子，效果较单独使用β-葡聚糖 (bg)、单独使用胸腺五肽(tp)以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物(bg tp) 显著。
[0063]
实施例4
[0064]
β-葡聚糖与胸腺五肽偶联物(bg-tp)具有恢复免疫系统能力，表现出对免疫低下模型小鼠骨髓抑制状态具有显著改善作用，促进腹腔巨噬细胞吞噬能力，以及促进小鼠血清中细胞因子及抗体分泌能力以及维持免疫稳态能力。为开发为免疫增强剂、保健品以及特殊医学用途配方食品等提供依据。。具体验证实验为：
[0065]
将7周龄bal/c小鼠饲养2周后，将糖肽偶联物(bg-tp)分别按4mg/kg 和16mg/kg，每3天给药一次的剂量，通过尾静脉给药方式给药。将环磷酰胺按 80mg/kg、连续给药3天的剂量，通过腹腔注射方式造免疫低下小鼠模型，3天后每天尾尖取血进行血常规分析监测其白细胞数，评价模型小鼠骨髓抑制状态。处死小鼠，从小鼠腹腔中抽取腹腔巨噬细胞，评价不同给药组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；取新鲜脾脏组织，利用流式细胞术检测其脾脏中淋巴细胞总数及 cd4 /cd8 t比值。通过elisa试剂盒检测小鼠血清中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子以及igg和siga等抗体分泌情况。结果如图7所示，经环磷酰胺诱导后，模型小鼠外周血中白细胞计数显著降低；脾脏中cd4

t细胞数降低、cd8
t细胞数升高，造成cd4

/cd8

比值下降；血清中tnf-α和ifn-γ等细胞因子以及igg和siga等抗体分泌显著降低。糖肽偶联物bg-tp可提高白细胞计数，缓解环磷酰胺诱导的骨髓抑；制显著改善并恢复cd4

/cd8

比值趋于正常值，恢复免疫系统免疫调节功能，维持免疫稳态。
[0066]
实施例5
[0067]
β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)具有抗肿瘤作用，对肿瘤模型小鼠具有抑制肿瘤生长作用，可促进小鼠血清中细胞因子分泌能力，具有免疫抗肿瘤作用。为糖肽偶联物bg-tp开发为免疫增强剂、抗肿瘤药物以及特殊医学用途配方食品等提供依据。具体验证实验为：
[0068]
将7周龄c57小鼠饲养2周后，通过尾静脉给药方式，按4mg/kg、每3天给药一次的剂量，给予小鼠前述糖肽偶联物(bg-tp)。第7次给药后，将培养一定数量的b16f10和4t1细胞用pbs重悬之后，细胞计数5～45
×
105/ml，以每只小鼠100微升剂量皮下接种到c57小鼠右肢腋下。每天监测肿瘤体积生长情况，待肿瘤体积长到1500mm3时停止实验。处死小鼠，取肿瘤组织及其他相关脏器，通过elisa试剂盒检测小鼠血清中tnf-α、il-1β和ifn-γ等细胞因子分泌情况。结果如图8和图9所示，β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)对4t1和 b16f10肿瘤模型小鼠的肿瘤生长具有显著抑制作用。对于肿瘤模型小鼠血清中 tnf-α、il-1β等细胞因
子和igg抗体分泌显著降低，糖肽偶联物bg-tp可显著改善并恢复至正常水平，表明其具有显著恢复免疫调节功能发挥抗肿瘤效果的作用。
[0069]
综上所述，本发明所述β-葡聚糖胸腺五肽偶联物(bg-tp)是通过β-葡聚糖还原端半缩醛基团与胸腺五肽的氨基共价偶联得到。本发明所述糖肽偶联物，一方面通过对胸腺五肽进行β-葡聚糖修饰，使其分子量增加，增加体内保留时间，降低血浆中酶降解清除率；另一方面通过对β-葡聚糖进行胸腺五肽修饰，可以协同发挥二者免疫调节作用，起到“1 1》2”的效果。本发明的方法具有反应效率高、产物结构特征明确、反应位点专一及无副产物等特点，适用于不同单糖种类、不同分子量及不同结构特征的糖类化合物与不同功能及药效的肽类药物共价偶联物的合成。基于该策略得到的糖肽偶联物具有显著免疫调节及抗肿瘤作用，且效果较单独使用β-葡聚糖、单独使用胸腺五肽以及β-葡聚糖与胸腺五肽的混合物显著。该糖肽偶联物对raw264.7巨噬细胞的无细胞毒性且可显著促进其吞噬能力；对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型骨髓抑制状态有较强的恢复能力；对 4t1及b16f10肿瘤模型小鼠具有抑制肿瘤生长作用。该糖肽偶联物可以用于制备免疫增强剂、抗肿瘤药物、保健品以及特殊医学用途配方食品。
[0070]
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。