基于青贮玉米特性的种质发掘与育种方法

1.本发明涉及作物育种与良种繁育技术领域，尤其涉及基于青贮玉米特性的种质发掘与育种方法。


背景技术：

2.随着畜牧业快速发展和饲料加工新技术应用，青贮玉米已成为全世界最重要的饲料来源之一，世界上畜牧业发达国家几乎都与发展青贮玉米密切相关，相对于国外畜牧业发达国家，我国对青贮玉米利用较少，目前，我国青贮玉米作为饲料比率不足1％，对青贮玉米育种研究也相对较少、起步较晚，20世纪60年代才开始有青贮玉米育种研究，整体来看，我国在青贮玉米遗传育种有关基础研究方面还比较落后，核心技术原创性不足，现代育种技术集成应用少，育种仍以常规技术为主，现代生物技术尚处于实验研发阶段，青贮玉米育种缺乏快速可靠的实验室分析测试技术，不能对应需求挖掘到合适的青贮玉米种质，不能很好的对玉米材料的营养品质进行选择鉴定，难以为青贮玉米新品种选育所利用。


技术实现要素：

3.针对上述不能对应需求挖掘到合适的青贮玉米种质，进而获得对青贮玉米新品种进行育种的问题，本发明提供基于青贮玉米特性的种质发掘与育种方法，通过创建青贮玉米种质资源发掘评价体系，对于满足需求的种质进行单倍体培育。
4.基于青贮玉米特性的种质发掘与育种方法，包括以下步骤：
5.s1、基于青贮玉米特征分别对待测试种质进行农艺性状、产量测定、持绿性、病虫害及品质测试，根据预设标准对测试结果进行筛选，获得标准种质；
6.s2、对所述标准种质进行单倍体育种，获得dh系繁殖体，并对dh系繁殖体进行dh系评价。
7.进一步的，所述步骤s1中，所述农艺性状测试包括：株高、穗位、株型、总株数、倒伏率、倒折率、倒伏倒折率之和及空秆率。
8.进一步的，所述步骤s1中，所述产量测试包括：亩产生物鲜重、亩产生物干重、全株鲜重、鲜果穗重及鲜果穗占比。
9.进一步的，所述步骤s1中，所述持绿性表示收获时全株叶片枯黄数，通过预设的阈值对全株叶片枯黄数进行分级划分。
10.进一步的，所述步骤s1中，所述病虫害测试包括：大斑病、小斑病、纹枯病、茎腐病、矮花叶病、灰斑病、粗缩病及丝黑穗病。
11.进一步的，所述步骤s1中，所述品质测试包括：粗蛋白含量、中性洗涤纤维含量、酸性洗涤纤维含量及淀粉含量。
12.进一步的，所述步骤s1中，所述品质测试采用近红外光谱分析，测试内容的含量基于各组分最佳波长进行选择，按照回归方程计算组分含量，回归方程为：
13.m＝c0 c1(dp)1 c2(dp)2 c3(dp)3
······
cn(dp)n14.其中，m为组分含量；ci为多元线性回归系数，i∈n

；(dp)
1-n
为各组分最佳波长的反射光密度值；d＝-lgp，p为反射比。
15.进一步的，所述步骤s2中包括：
16.s201、对所述标准种质及组配基础材料进行杂交诱导，获得拟单倍体；
17.s202、对所述拟单倍体进行单倍体加倍，获得dh系繁殖体；
18.s203、对所述dh系繁殖体进行dh系鉴定与筛选；
19.s204、基于步骤s203的筛选结果进行dh系测配与产量测试。
20.相比于现有技术，本发明的优点及有益效果在于：通过本发明的技术方案，对青贮玉米农艺性状指标、生物产量指标、病害抗性指标、青贮营养品质指标开展精准鉴定和选择，创建青贮玉米种质资源发掘评价体系；明确青贮玉米育种新材料所属类群及其利用方式，探索青贮玉米杂优模式，利用优异骨干系组配新组合，拓宽组配方式，加大组配量，培育生物产量高、营养价值高、抗逆性强、适应性广的青贮玉米新品种。
附图说明
21.图1为本发明的流程示意图；
22.图2为本发明中步骤s2的流程示意图。
具体实施方式
23.以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
24.在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
25.在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
26.在使用类似于“a、b和c等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有a、b和c中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有a、单独具有b、单独具有c、具有a和b、具有a和c、具有b和c、和/或具有a、b、c的系统等)。在使用类似于“a、b或c等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有a、b或c中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有a、单独具有b、单独具有c、具有a和b、具有a和c、具有b和c、和/或具有a、b、c的系统等)。
27.如图1所示，基于青贮玉米特性的种质发掘与育种方法，包括以下步骤：
28.s1、基于青贮玉米特征分别对待测试种质进行农艺性状、产量测定、持绿性、病虫害及品质测试，根据预设标准对测试结果进行筛选，获得标准种质；
29.s2、对标准种质进行单倍体育种，获得dh系繁殖体，并对dh系繁殖体进行dh系评价。
30.具体的，步骤s1中，农艺性状测试包括：株高、穗位、株型、总株数、倒伏率、倒折率、倒伏倒折率之和及空秆率。
31.株高：吐丝后10～30天，连续取小区内生育正常的10株，测量由地表到雄穗顶端的高度，求其平均值取整数，用cm表示。
32.穗位：测量株高的同时测量植株从地表到果穗柄着生节的高度，求其平均值取整数，用cm表示。
33.株型：吐丝后约30天(
±
10天)后目测，分平展、半紧凑、紧凑型记载。
34.总株数：小区总株数。
35.倒伏率(根倒)：倒伏倾斜度大于45度者作为倒伏标准。倒伏株数占小区株数的百分比。
36.倒折率(茎折)：抽穗后，果穗以下部位折断的植株占小区株数的百分比。
37.倒伏倒折率之和：倒伏率 倒折率。
38.空秆率：吐丝后约30天(
±
10天)调查不结果穗或果穗结实20粒以下的植株占全区株数的百分比。
39.具体的，步骤s1中，产量测试包括：亩产生物鲜重、亩产生物干重、全株鲜重、鲜果穗重及鲜果穗占比。
40.亩产生物鲜重：生物产量收获期为全株含水量60-70％时收获，在籽粒乳熟中期至蜡熟期之间(最佳期为籽粒1/2乳线)。在青贮玉米最佳收获期，每个小区收获中间3～4行，从地上部20cm处全株刈割。收获后立即称重，得到小区鲜重产量，折合成亩产，用kg表示。
41.干物质含量：从每个小区收获的植株中，随机选取10株，全株粉碎，混合均匀。随机取样1000g左右，装入布袋，称鲜重，用g表示，在烘箱里105℃杀青3小时，然后65℃条件下烘干至恒重，称干重，用g表示。计算干物质含量，用％表示。
42.亩产生物干重：亩产生物鲜重
×
干物质含量得到亩产生物干重，用kg表示。
43.全株鲜重：收获时，每小区随机选取10株称量生物鲜重，计算平均的单株鲜重，用kg表示。
44.鲜果穗重：将称量完10株全株鲜重植株的果穗(不带苞叶)摘下，称量果穗重，计算平均的单穗鲜重，用kg表示。
45.鲜果穗占比：鲜果穗重占全株鲜重的比值，用％表示。
46.具体的，步骤s1中，持绿性表示收获时全株叶片枯黄数，通过预设的阈值对全株叶片枯黄数进行分级划分。
47.在实际应用中，可以采用以下划分方式进行分级划分：
48.好：收获时全株叶片枯黄数不超过5片；
49.较好：收获时全株叶片枯黄数6片-8片；
50.一般：收获时全株叶片枯黄数9片-11片；
51.差：收获时全株叶片枯黄数大于11片。
52.具体的，步骤s1中，病虫害测试包括：大斑病、小斑病、纹枯病、茎腐病、矮花叶病、灰斑病、粗缩病及丝黑穗病。
53.本发明中，依据《玉米病虫害田间手册》进行病虫害测试，收获前田间调查大斑病、小斑病、纹枯病、茎腐病、矮花叶病、灰斑病、粗缩病、丝黑穗病等主要病害发病率情况。(本区主要病害：茎腐病—乳熟期调查发病株数，以％表示；丝黑穗病—乳熟期调查发病株数，以％表示；纹枯病—乳熟期调查发病株数，以％表示；大、小斑病—在乳熟期根据整株的发病情况，分级表示。)
54.抗病性接种鉴定单位由区试主管部门指定，病害种类由区试主管部门规定；虫害情况：田间调查记载玉米螟及蚜虫的危害情况。
55.具体的，步骤s1中，品质测试包括：粗蛋白含量、中性洗涤纤维含量、酸性洗涤纤维含量及淀粉含量。
56.本发明中对品质测试内容相关的检测指标及评级，依据《中华人民共和国国家标准-青贮玉米品质分级》进行分级评级。
57.具体的，步骤s1中，品质测试采用近红外光谱分析，测试内容的含量基于各组分最佳波长进行选择，按照回归方程计算组分含量，回归方程为：
58.m＝c0 c1(dp)1 c2(dp)2 c3(dp)3
······
cn(dp)n59.其中，m为组分含量；ci为多元线性回归系数，i∈n

；(dp)
1-n
为各组分最佳波长的反射光密度值；d＝-lgp，p为反射比。
60.近红外光谱的波长为780-2526nm，介于可见光和中红外光之间。通常又将近红外区分为近红外短波(780-1100nm)和近红外长波(1100-2526nm)两个区域。近红外光谱分析技术是依据被测样品中某一化学成分对近红外区光谱的吸收特性而进行的定量测定，所以应用近红外光谱进行检测的技术关键就是在两者之间建立一种定量的函数关系，依靠这种关系，就能从未知样品的光谱中求出样品的成分和含量。
61.实验仪器为瑞典波通公司生产的da7200型近红外光谱分析仪，可以实现样品原始光谱的搜集，建立校正模型所用软件为近红外光谱分析仪自带g-rams32pls iq软件(thermo galactic corp.)，利用该软件进行光谱预处理，回归分析等处理。
62.(1)测试仪器要求的实验环境条件、操作环境要求为：环境温度控制在22-23℃，环境湿度控制在50％—70％。
63.(2)测试仪器预热条件：开机后必须进行充分预热，一般要求在25℃预热至少30min。
64.(3)仪器工作参数为:波长范围950-1650nm,采样间隔2.0nm,扫描次数为100次/秒。
65.定量分析步骤：
66.近红外光谱的定量分析就是利用化学分析数据和近红外光谱数据来建立模型，确定模型参数，然后以这个模型去定量预测某些信息的方法。定量的具体分析步骤如下：
67.a、选取一组具有代表性的已知化学测定值的样品作为校正集，测量出其近红外光谱，建立化学测定值和光谱之间的定量数学模型(校正模型)：
68.b、取另一组已知化学测定值的样品作为预测集，扫描出其近红外光谱，将光谱值代入校正模型，得到样品的预测值，用预测值和化学测定值的相关系数和相对标准偏差来衡量所建立的模型的可靠程度；
69.c、若所建的校正模型稳定可靠，即可用此模型来对未知样品进行测定。
70.具体的，如图2所示，步骤s2中包括：
71.s201、对标准种质及组配基础材料进行杂交诱导，获得拟单倍体；
72.s202、对拟单倍体进行单倍体加倍，获得dh系繁殖体；
73.s203、对dh系繁殖体进行dh系鉴定与筛选；
74.s204、基于步骤s203的筛选结果进行dh系测配与产量测试。
75.玉米单倍体育种即dh(doubled haploid)技术能够快速提供来自供体亲本的稳定纯系。与传统育种方法相比较，单倍体技术是选育玉米自交系的一种最快、最简便、经济和直接的方法，可以生产100％纯合的优良自交系。现在的常规育种中要得到一个稳定的自交系至少要自交5～6代，而通过单倍体育种途径得到单倍体植株，完全可以在两个世代内得到一个纯合的自交系。单倍体植株不能形成有活力的配子，通过染色体加倍，可以形成纯合、性状稳定的二倍体植株，也称双单倍体株系。
76.相对于常规育种模式，单倍体育种技术可以大大缩短育种年限，提高育种效率，加快育种进程，降低育种成本，高效获得目标优良自交系。将传统的"连续自交"多步选系转变为"诱导和加倍单倍体"两步选系，2个世代即可获得dh纯系，大大加快了育种进程。
77.组配基础材料材料来源：
78.(1)母本：群体、杂交种等；
79.(2)父本：诱导系、诱导系间f1。
80.诱导模式：
81.传统方式—套袋、人工授粉；
82.制种式—父：母＝1:4，母本去雄，隔离区种植，开放授粉。
83.单倍体挑选：
84.人工识别。
85.单倍体加倍：
86.(1)自然加倍，地点：云南；
87.(2)化学加倍，秋水仙素苗期注射(0.05％-0.06％秋水仙素 0.5％dmso；注射剂量：0.5ml/株)。
88.dh系评价包括：dh系繁殖、dh系鉴定筛选、dh系测交和测试，dh系评价流程如表1所示：
89.表1
[0090][0091][0092]
根据苗期长势、株高、穗位、抗性、熟期、品质性状等表型鉴定指标进行评价，淘汰不符合育种目标的dh系，根据实践经验，初期鉴定淘汰大约xx％的dh系。
[0093]
待鉴选的dh系中选择长势整齐植株进行自交，在dh系生长到大喇叭口期时，对已经选定的dh系snp和ssr分子标记辅助选择，评估出dh系间遗传关系，并进行聚类分析。
[0094]
snp和ssr分子标记辅助选择与性状配合力联合鉴定分析对象是选定的dh系，snp和ssr分子标记辅助选择对其进行遗传多样性分析，可以明确不同材料分子遗传差异，通过对分子标记确定的遗传距离进行主成分分析或聚类分析划分不同类群，以更好利用杂种优势模式。配合力作为自交系的一种内在属性，是决定自交系所配杂交组合表现得一种潜在能力。遗传差异大的性状配合力强，杂种优势明显，从性状配合力也能看出二者是否为一个类群，配合力弱的一般可以划分为一个类群。
[0095]
其中，组配方法：新自交系/外引系
×
优良骨干系测配
[0096]
青贮玉米杂优模式：(1)reid群
×
热带种质群；
[0097]
(2)reid群
×
p群；
[0098]
(3)reid群
×
地方种质群；
[0099]
(4)lancaster群
×
p群。
[0100]
最终对杂交组合进行鉴定，进而对适合推广的区域、品种、培育方式进行调整。
[0101]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要
素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0102]
以上仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。