前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用

前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用
技术领域
1.本发明涉及冠脉粥样硬化心脏病诊断技术领域，尤其涉及一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用。


背景技术：

2.心血管疾病(cardiovasculardisease，cvd)是全球公认的导致人群死亡的主要原因之一，也是人类社会经济发展的主要障碍。根据《中国心血管健康与疾病报告2019概要》指出，目前我国心血管疾病患病率仍处于持续上升阶段，其病死率仍居首位，占居民死亡构成比的40％以上，并且逐渐出现了“农村高于城镇”的趋势。并且随着经济的发展和社会生活水平质量的逐步提高，其发病率、死亡率都显著升高，甚至存在发病年龄提前等趋势，更需要引起社会的广泛重视。由于目前我国患心脑血管疾病人群趋于年轻化，给社会及家庭带来严重负担，因此早期诊断及正确的临床干预便显得十分重要。冠心病(coronary heart disease，chd)作为cvd当中最为常见的一类疾病，其主要病理基础为动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)，是一种以内皮细胞活化、单核细胞聚集和血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，vsmcs)增殖为特征的动脉壁慢性炎症性疾病，而动脉粥样硬化斑块的形成或性质的改变，在冠心病的发生发展中起着核心作用。在此基础上易引发病变斑块不稳定，继而斑块破裂，血管痉挛并伴发血小板黏附、聚集和继发性血栓形成，导致急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，acs)的发生。目前临床上诊断chd的“金标准”仍然是冠状动脉造影(coronary angiography，cag)。但由于其为有创性检查，并且缺乏及时性，尤其不适用于我国医疗资源比较匮乏的农村及偏远地区。因此，寻找合适的血清标志物来快速评估冠脉狭窄和心肌缺血的严重程度，对于减少我国农村及落后偏远地区急性不良心血管事件的发生，改善患者预后等方面尤为重要。
3.既往研究表明，脂代谢紊乱尤其是低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，ldl-c)水平的升高是导致动脉粥样硬化斑块形成的基础，及时降解或清除沉积在血管壁上的ldl-c能够显著降低斑块的不稳定性，从而减少急性心血管事件发生的风险。一项纳入了26个随机试验评估他汀类药物对胆固醇及主要心血管事件影响的前瞻性系统性分析指出，ldl-c每降1mmol/l，可使心血管事件发生风险下降22％。美国脂质协会(national lipid association，nla)也指出[8]，ldl-c是唯一能独立导致动脉粥样硬化性心血管病(atheroscleroticcardiovascular disease，ascvd)的脂蛋白，降低ldl-c与降低ascvd的风险呈正相关。低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)和极低密度脂蛋白(verylow-densitylipoprotein，vldl)的过度积累会激活血管内皮细胞并触发炎症性细胞因子的分泌，从而导致单核细胞募集并分化为巨噬细胞。积累的脂质和脂蛋白被巨噬细胞吞噬，并以脂质小滴(lipiddroplets，lds)形式存在于巨噬细胞中使其进一步转化为泡沫细胞。在此基础上进一步激活炎症反应和增加动脉粥样硬化斑块破裂的风险。随着对ldl-c认识的深入，ldl-c水平越低，冠心病风险越低的概念越来越受到研究学者与
临床医生的认可。在当前人类研发的所有能够调节ldl-c水平的药物中，他汀类药物无疑是其中的佼佼者。大量涉及脂类代谢的临床结果表明，积极或强化的他汀治疗可明显改善cad的预后、降低死亡率。然而，他汀类药物仍面临着诸多挑战，如他汀对ldl-c降低存在局限性，即增大他汀类药物剂量所带来的ldl-c水平下降并不呈现剂量效应关系，而似乎总是6％，这一现象被称为“6％规律”。再者，强化他汀治疗后出现的心血管“剩余风险”等现象仍有待进一步研究。综上所述，由于脂质代谢异常和ascvd存在着千丝万缕的联系，而粥样斑块的改变，易引起的冠脉狭窄势必导致心肌缺血，所以某些参与血脂调控的标志物在诊断心肌缺血以及冠脉损伤等方面有独到的优势，对于减轻患者经济负担提升预后生活水平等方面具有重要意义。
[0004]
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexintype9，pcsk9)是近些年来新发现的一种与脂代谢调节密切相关的丝氨酸蛋白酶，它是前蛋白转化酶家族的第9个成员。人类pcsk9基因位于染色体1p32.3位点，共包含3617个碱基，编码692个氨基酸，主要包括4个结构域，分别为信号肽(1-30)、前片段(31-152)、催化结构域(153-451)及羧基末端结构域(526-692)。pcsk9在多个组织中均表达，尤其在肝脏、肾脏、小肠和胰腺中表达较为丰富。研究表明，pcsk9主要通过诱导低密度脂蛋白受体(ldl-r)在溶酶体降解而减少ldl-r对血浆ldl-c的摄取。正常生理情况下，血浆中的ldl-c被细胞表面的ldl-r识别后转运至溶酶体内被降解，而ldl-r则重新回到细胞表面继续循环利用，pcsk9则通过降解ldl-r导致细胞对ldl-c的清除减少。研究表明，pcsk9受多种转录因子的调控，其中固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein，srebp2)是pcsk9最主要的转录激活因子。当细胞内胆固醇水平降低时，刺激srebp裂解激活蛋白结构域构象发生改变而释放活化的srebp2，从而使pcsk9的转录水平升高。他汀类降脂药物通过抑制细胞胆固醇的合成，促进了srebp2的表达，因此他汀类药物通过上调ldl-r的表达而降低ldl-c在血浆中的含量，但同时也促进了pcsk9的分泌。这一现象明显减弱了他汀的降血脂效果，目前已有临床研究证实了这一观点。这可能是影响他汀类药物降脂效果的原因之一。研究还发现，pcsk9水平除与脂代谢异常相关外，pcsk9基因功能多态性与心血管疾病密切相关。pcsk9基因获得型(gain of-function，gof)突变可增加pcsk9上调ldl-c的能力，增加了心脑血管事件的发生风险，目前已知的主要突变表现形式有r306s、d374y、e670g、l82x、f216l、s127r、n157k等；而pcsk9基因缺失型(loseof-function，lof)突变则是与血浆低胆固醇水平相关，其对ldl-r的降解能力减弱，明显降低了ldl-c水平及心血管病患病风险，lof突变体类型主要有r46l、n157k、y142x和c679x等。研究显示，如r46l缺失型突变患者发生心血管事件的风险显著降低86％；y142x/c679x型突变患者胆固醇水平降低28％,其在15年内患心血管疾病的概率明显减少了88％。不得不说，由pcsk9介导ldl-r降解通路的发现，为心血管领域的研究提供了新的思路。家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，fh)是一种常染色体显性遗传疾病，也是单基因高胆固醇血症最常见、最严重的一种形式。一般人群中的患病率为2
‰‑5‰
。fh患者的主要临床特点为ldl-c水平明显升高、皮肤或肌腱黄瘤、脂性角膜炎及早发冠心病。在fh患者中，虽然他汀类药物仍然是治疗的一线药物，但高剂量他汀类药物对血脂水平控制不佳的现象却时有发生，其不良反应随着剂量的增加也明显增多。新型强效降脂药物pcsk9抑制剂的研制及临床研究结果表明,pcsk9抑制剂/单抗对于fh患者效果良好，为fh患者的治疗提供了新选择，也是对以
他汀类药物为主流的降脂治疗模式下的一种潜在补充。
[0005]
脂蛋白(a)作为一种富含胆固醇的低密度脂蛋白颗粒，在致动脉粥样硬化过程中起着极其重要的作用。在过去的几年中，人们在认识到lp(a)升高与心血管疾病(cvd)的因果关系方面取得了重大进展，lp(a)被认为是心血管疾病的独立危险因素。挪威的博士kare berg于1963年首次检测出了人体血清中的lp(a)。它由一个ldl-c的胆固醇核心、载脂蛋白(apo)b100，与载脂蛋白apo a共价融合而形成升高的lp(a)与心血管风险的增加是独立相关的。apo(a)与纤溶酶原(纤溶酶原是纤溶系统中的一种蛋白)非常相似。apo(a)由一个非活性蛋白酶或丝氨酸蛋白酶组成，其氨基酸序列与纤溶酶原的氨基酸序列重合率达94％。此外，还有2个由高度糖基化的三维重链结构构成的结构域，称为kringles。apo(a)的kringle结构域中，有一个与纤溶酶原的kringlev(kv)结构域相似，只有9％的氨基酸被取代。另一种是kringle iv(kiv)，它只在纤溶酶原结构中出现一次，在apo(a)中有10种不同的类型(kiv类型1到10)。只有kiv型2在apo(a)序列中重复出现，与纤溶酶原中约84％的kiv氨基酸序列重合。因此，kv是单个拷贝，而kiv在apo(a)结构中重复10到40次。kiv重复的次数由基因决定，从12次到51次不等，产生34种不同的apo(a)亚型。异构体是决定lp(a)血浆浓度的因素，因为它是lp(a)合成的限制因素。较小的蛋白质比分子量较大的蛋白质分泌效率更高。2型重复kiv较少的亚型，即apo(a)序列较小，倾向于决定较高的lp(a)浓度，并增加动脉粥样硬化血栓形成活性。因此，apo(a)亚型的分子量与lp(a)的血浆浓度呈较强的负相关关系。然而，治疗升高的lp(a)的选择是有限的。值得关注的是，pcsk9抑制剂在显著降低lp(a)和ldl-c方面显示出良好的效果，现已在国外上市的两种pcsk9制剂分别是evolocumab和alirocumab，血浆浓度可降低至～25％到30％。2019年发表在atherosclerosis的alirocumab三期临床试验表明alirocumab可降低62％ldl-水平，同时能够降低lp(a)和主要不良心血管事件(mace)的风险，也是未来可能替代烟酸作为一线降低lp(a)的新药。
[0006]
综上所述，pcsk9联合lp(a)胶体金快速检测试剂盒对于冠脉粥样硬化心脏病患者早期诊断、早期干预、预后评估尤其是术后再发血栓风险以及减轻患者经济负担等方面都具有重大意义。
[0007]
现有的技术方案：
[0008]
pcsk9：针对pcsk9的检测目前已知的有数家公司公司提供的elisa试剂盒，或者是直接通过制备pcsk9的特异性抗体通过蛋白免疫印记等方式来检测。
[0009]
lp(a)：定量lp(a)最常用的方法是利用单克隆抗apo(a)抗体测定apo(a)浓度。目前，酶免疫分析法(elisa)、乳胶免疫测定法、免疫浊度测定法等检测方法更为常用。apo(a)分子量的巨大变化使得个体间质量与摩尔浓度之比不同。目前计算lp(a)的多少，是通过借用针对apo a的特异性抗体来精确计算的，以lp(a)质量来表示结果，以mg/dl、mg/l、nmol/l为单位。一个apo a的大小由kiv-2亚型结构域的拷贝多少确定。因为由于此亚型分子数量处于高度的变异状态，所以这种新型免疫光合反应分子检验测量方法的测定精度和测量准确性主要还是依靠校准仪中对于apo-a的测量尺寸。在我们人群里，携带2个不同规模的apo a异构体所需要占到的比例超过个体的80％，父亲和母亲各提供一个。每种异构体的apo a的净量决定了个体的lp(a)水平。目前国内外标定的lp(a)升高切点尚不一致，可能与检测方法、地区、种族的lp(a)水平存在差异相关，这需要进一步研究探讨。
[0010]
现有的缺点：
[0011]
1.即便可以通过elisa试剂盒或者蛋白免疫印记等方法检测pcsk9含量，不过上述检测方法检测时间较长动辄数小时，对于需要快速诊断及治疗的心肌缺血并不适合。
[0012]
2.lp(a)受遗传因素影响较大，不同地区不同人种之间差异较大，对于单个种群或者地区的lp(a)水平的参考范围仍需界定。
[0013]
3.lp(a)酶免疫分析法(elisa)、乳胶免疫测定法、免疫浊度测定法等检测方法和pcsk9类似均无法快速得到结果，不利于临床早期诊断干预。
[0014]
因此，有必要提供一种新的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用解决上述技术问题。


技术实现要素：

[0015]
本发明解决的技术问题是提供一种减轻患者经济负担、快速区分冠脉粥样硬化高危人群，及时干预预防治疗后血栓形成，提高患者预后生活质量的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用。
[0016]
为解决上述技术问题，本发明提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用包括：以下步骤：
[0017]
s1：设计并构建表达人pcsk9和lp(a)蛋白的质粒，并用大肠杆菌rosetta2菌株表达；
[0018]
s2：通过蛋白纯化的方法得到人pcsk9和lp(a)蛋白，并进行脱盐冻干；
[0019]
s3：使用pbs将pcsk9和lp(a)蛋白融解，加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化；
[0020]
s4：用乳化好的蛋白溶液注射到小鼠腹腔，得到含有抗体的腹水；
[0021]
s5：收集腹水，使用蛋白g微珠层析柱进行抗体纯化，得到小鼠抗pcsk9抗体和小鼠抗lp(a)抗体；
[0022]
s6：胶体金溶液的ph值调节至9.0，按照不出现聚集现象的原则选择抗体浓度，对抗体进行胶体金标记；
[0023]
s7：在反应垫上分别固定鼠抗人pcsk9抗体、鼠抗人lp(a)抗体和羊抗鼠igg抗体，在结合垫上加入胶体金标记鼠抗人pcsk9抗体和胶体金标记鼠抗人lp(a)抗体；
[0024]
s8：通过调节反应垫上固定的抗体含量，和/或结合垫中金标抗lp(a)抗体的含量，将lp(a)蛋白的检出限调整为30mg/dl。
[0025]
优选的，检测时采用检测卡进行检测，所述检测卡包括塑料外壳和试纸条：试纸条结合垫中有胶体金标记抗pcsk9抗体和胶体金标记抗lp(a)抗体，反应垫上固定抗pcsk9抗体、抗lp(a)抗体和抗鼠igg抗体；检测时，在样品垫中滴加待检血液和样品稀释液；血液中的pcsk9和lp(a)随着液体向上与对应胶体金抗体结合，并持续向上移动，与对应抗体结合；当抗体移动至固定的抗体区域时，pcsk9与金标抗体的结合物与抗pcsk9抗体结合时，显示出红色条带；lp(a)与金标抗体的结合物与抗lp(a)抗体结合时，显示出红色条带；未结合对应蛋白的金标抗体与抗鼠igg抗体结合，显示出红色条带，为质控条带，则判定为pcsk9阳性，lp(a)阳性；若pcsk9和lp(a)区域均未显现条带，质控区域显现红色条带，则判定为pcsk9阴性，lp(a)阴性；若pcsk9显现条带，lp(a)未显现条带，质控区域显现红色条带，则判定为pcsk9阳性，lp(a)阴性；若pcsk9未显现条带，lp(a)显现条带，质控区域显现红色条带，
则判定为pcsk9阴性，lp(a)阳性；若质控条带未显现，则本次检测无效。
[0026]
与相关技术相比较，本发明提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用具有如下有益效果：
[0027]
本发明提供一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用成本较低，成本较低，如果能采用自动化批量检测成本会进一步降低；胶体金检测速度极快，一般十分钟左右就可以判断，早期诊断价值巨大尤其是早期以不稳定心绞痛为表现的患者，而其他方法可能在出现明显改变时心肌缺血已经较为严重乃至于发展到心肌梗死的程度，对于早期干预有重大意义，这反过来也进一步降低了患者与医院的负担；通过制备识别可识别lp(a)的特异性抗体，免疫反应性为apo(a)亚型及异构体不敏感，并结合lp(a)≥30mg/dl作为检出线，快速识别并筛查高危心血管风险因素，早期干预可能由此引发的血栓及预后不良心血管事件。
附图说明
[0028]
图1为本发明提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用的检测卡检测时和检测后的示意图。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
[0030]
请结合参阅图1，图1为本发明提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用的检测卡检测时和检测后的示意图。前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用包括以下步骤：设计并构建表达人pcsk9和lp(a)蛋白的质粒，并用大肠杆菌rosetta2菌株表达。通过蛋白纯化的方法得到人pcsk9和lp(a)蛋白，并进行脱盐冻干。使用pbs将pcsk9和lp(a)蛋白融解，加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化。用乳化好的蛋白溶液注射到小鼠腹腔，得到含有抗体的腹水。收集腹水，使用蛋白g微珠层析柱进行抗体纯化，得到小鼠抗pcsk9抗体和小鼠抗lp(a)抗体。
[0031]
胶体金溶液的ph值调节至9.0，按照不出现聚集现象的原则选择抗体浓度，对抗体进行胶体金标记。
[0032]
在反应垫上分别固定鼠抗人pcsk9抗体、鼠抗人lp(a)抗体和羊抗鼠igg抗体，在结合垫上加入胶体金标记鼠抗人pcsk9抗体和胶体金标记鼠抗人lp(a)抗体。
[0033]
通过调节反应垫上固定的抗体含量，和/或结合垫中金标抗lp(a)抗体的含量，将lp(a)蛋白的检出限调整为30mg/dl。
[0034]
检测卡由塑料外壳和试纸条构成。试纸条结合垫中有胶体金标记抗pcsk9抗体和胶体金标记抗lp(a)抗体，反应垫上固定抗pcsk9抗体、抗lp(a)抗体和抗鼠igg抗体(图a)。检测时，在样品垫中滴加待检血液和样品稀释液(图b)。血液中的pcsk9和lp(a)随着液体向上与对应胶体金抗体结合，并持续向上移动，与对应抗体结合(图c)。当抗体移动至固定的抗体区域时，pcsk9与金标抗体的结合物与抗pcsk9抗体结合时，显示出红色条带；lp(a)与金标抗体的结合物与抗lp(a)抗体结合时，显示出红色条带；未结合对应蛋白的金标抗体与抗鼠igg抗体结合，显示出红色条带，为质控条带(图d)，则判定为pcsk9阳性，lp(a)阳性。若
pcsk9和lp(a)区域均未显现条带，质控区域显现红色条带(图e)，则判定为pcsk9阴性，lp(a)阴性。若pcsk9显现条带，lp(a)未显现条带，质控区域显现红色条带(图f)，则判定为pcsk9阳性，lp(a)阴性。若pcsk9未显现条带，lp(a)显现条带，质控区域显现红色条带(图g)，则判定为pcsk9阴性，lp(a)阳性。若质控条带未显现，则本次检测无效。
[0035]
针对pcsk9联合lp(a)胶体金快速检测试剂盒，在心肌缺血发生早期通过快速检测pcsk9便能及时发现并诊断，通过早期及时干预避免进一步恶化为心肌梗死等严重后果，减轻患者经济负担，也为介入等操作后发生的iri提供有效的预测，为心肌缺血患者的诊断预后等方面提供一定的参考。同时设定lp(a)≥30mg/dl作为检测灵敏度，快速区分冠脉粥样硬化高危人群，及时干预预防治疗后血栓形成，提高患者预后生活质量。
[0036]
pcsk9作为新的评估心肌缺血早期诊断以及进展评估的指标，属于新发现的用途。
[0037]
通过特定方法制备的可以识别lp(a)≥30mg/dl的抗体，做到快速筛选冠脉粥样硬化高危人群。
[0038]
通过制备特异性识别pcsk9的抗体快速诊断评估心肌缺血还有冠脉损伤程度。
[0039]
通过制备将上述两者结合的快速诊断试剂盒，可以快速评估存在动脉粥样硬化高危人群的心肌缺血以及冠脉损伤程度，早期干预减少血栓形成以及相关的预后不良心血管事件，所以快速联合使用具有重要临床意义。
[0040]
与相关技术相比较，本发明提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用具有如下有益效果：
[0041]
本发明提供一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用，成本较低，如果能采用自动化批量检测成本会进一步降低；胶体金检测速度极快，一般十分钟左右就可以判断，早期诊断价值巨大尤其是早期以不稳定心绞痛为表现的患者，而其他方法可能在出现明显改变时心肌缺血已经较为严重乃至于发展到心肌梗死的程度，对于早期干预有重大意义，这反过来也进一步降低了患者与医院的负担；通过制备识别可识别lp(a)的特异性抗体，免疫反应性为apo(a)亚型及异构体不敏感，并结合lp(a)≥30mg/dl作为检出线，快速识别并筛查高危心血管风险因素，早期干预可能由此引发的血栓及预后不良心血管事件。
[0042]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。