分析物检测的制作方法

分析物检测
1.本技术要求2020年3月19日递交的美国临时专利申请序列号62/991,947的优先权，其通过参考以其全部结合至本文中。
2.关于联邦资助研究或开发的声明本发明在美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的ca204560和ca229023下于政府支持下完成。政府对本发明享有一定权利。
3.领域本文提供涉及分析物检测的技术，并且特别但不排他地，涉及用于使用基于检测探针瞬时结合的技术来检测诸如核酸、蛋白、小分子、代谢物和其他分子等分析物的方法、系统、组合物和试剂盒。
4.背景检测和量化复杂混合物中的低浓度分析物在生物研究和临床诊断中具有许多应用。许多重要的生物分析物为疾病和其他生物状态的生物标志物。例如，在血液、尿液、唾液和其他体液中少部分携带致癌突变的循环核酸的检测已与某些类型癌症的发生率相关联。另外，诸如前列腺特异性抗原(psa)和白细胞介素等蛋白分析物也具有当前或潜在的临床和研究意义。因此，分析物的存在和/或水平提供生物系统中有关健康和药物加工的信息。因此，需要用于检测和/或量化样品中分析物的技术。
5.概述因此，本文提供用于改进使用如在美国专利号10,093,967，美国专利申请序列号16/154,045、16/076,853、5/914,729、16/219,070和国际专利申请号pct/us19/43022中描述的用平衡泊松采样的单分子识别(simreps)的分析物(例如生物分子(例如核酸(例如dna、rna、甲基化和其他修饰的或非天然存在的核碱基)、多肽(例如肽、蛋白、糖蛋白)、碳水化合物、脂质、翻译后修饰、氨基酸、代谢物、小分子等)检测的技术，所述专利及专利申请的每一个均通过参考结合至本文中。在一些实施方案中，该技术涉及使用纳米颗粒捕获分析物(例如生物标志物)以供通过simreps进行后续分析。在一些实施方案中，该技术涉及simreps，其使用以两种或更多种不同荧光团标记的两种或更多种瞬时结合查询探针，并检测多个探针与分析物的重复结合和/或两种或更多种不同荧光团之间的瞬时f
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rster共振能量转移。在一些实施方案中，该技术涉及通过修改反应条件以提高查询探针和分析物的缔合和解离速度来提高simreps数据收集速率。在一些实施方案中，该技术涉及使用微流体装置来提高分析物捕获效率和检测查询探针与分析物的相互作用。在一些实施方案中，该技术涉及将分析物与捕获探针交联，以防止分析物在测量之前或期间从表面解离。在一些实施方案中，这些技术中的两种或更多种被组合使用(例如使用以下的两种或更多种：1) 纳米颗粒，2) 两种或更多种查询探针，3) 修改反应条件以增加查询探针的缔合/解离，4) 微流体装置，和/或5) 将分析物与捕获探针交联)。在一些实施方案中，分析物在表面浓集的然后是分析物的表面捕获(例如分析物在表面的固定)。在一些实施方案中，分析物在表面浓集和任选的分析物在表面捕获的然后是通过simreps分析分析物。
6.该技术提供了超越现有技术的优势，包括但不限于提高simreps数据收集的速度
(例如缩短获得结果的时间)、提高simreps灵敏度和/或提高simreps特异性。
7.该技术不限于被检测的分析物。例如，实施方案提供对分析物的检测，所述分析物为核酸、多肽、碳水化合物、多糖、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂、小分子、代谢物、辅因子。
8.在一些实施方案中，查询和/或捕获探针为核酸或多肽(例如抗体、抗体片段、线性抗体、单链抗体或其他抗原结合的抗体衍生物；酶；特异性识别分析物的结合蛋白)。在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，查询探针包含碳水化合物结合蛋白，比如凝集素或碳水化合物结合抗体。在一些实施方案中，在碳水化合物单体之间特定糖苷键或糖苷键组的存在产生可区别的查询探针结合模式。在一些实施方案中，捕获探针为单克隆抗体；和在一些实施方案中，查询探针为小鼠或兔单克隆抗体。
9.在一些实施方案中，表征分析物包含指示样品中分析物的存在、不存在、浓度或数量。在一些实施方案中，分析物包含多肽。在一些实施方案中，方法指示多肽上翻译后修饰的存在或不存在。在一些实施方案中，翻译后修饰介导查询探针与多肽的瞬时缔合。在一些实施方案中，化学亲和标签介导翻译后修饰和查询探针之间的瞬时缔合。在一些实施方案中，化学亲和标签为核酸。在一些实施方案中，分析物为核酸。在一些实施方案中，查询探针与分析物的瞬时缔合明显地受到分析物的共价修饰的影响。在一些实施方案中，查询探针为核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，查询探针为dna结合蛋白、rna结合蛋白或dna结合的核糖核蛋白复合物。
10.在一些实施方案中，分析物在表面固定之前于存在载体的情况下经受热变性。在一些实施方案中，分析物在表面固定之前于存在载体的情况下经受化学变性，例如分析物用诸如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高ph、低ph或十二烷基硫酸钠(sds)等变性剂进行变性。
11.进一步的实施方案提供用于量化样品中的分析物的系统。例如，在一些实施方案中，系统包含将分析物稳定地固定于表面的功能性；以低亲和力结合于分析物的自由扩散性查询探针；和记录分析物的查询探针事件和查询探针事件的空间位置的检测系统。在一些实施方案中，系统进一步包含分析程序，以根据与所述分析物的重复结合和解离事件的空间位置和时机来鉴定分析物的单个分子拷贝。在一些实施方案中，查询探针为核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在系统的一些实施方案中，查询探针和/或捕获探针为dna结合蛋白、rna结合蛋白或dna结合的核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，查询和/或捕获探针为核酸或多肽(例如抗体、抗体片段、线性抗体、单链抗体或其他抗原结合的抗体衍生物；酶；特异性识别分析物的结合蛋白)。在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，查询探针包含碳水化合物结合蛋白，比如凝集素或碳水化合物结合抗体。在一些实施方案中，在碳水化合物单体之间特定糖苷键或糖苷键组的存在产生可区别的查询探针结合模式。在一些实施方案中，捕获探针为兔单克隆抗体；并且在一些实施方案中，查询探针为小鼠单克隆抗体。
12.在一些系统实施方案中，分析物通过稳定地结合分析物的表面结合的捕获探针稳定地固定于表面上。在一些实施方案中，捕获探针为高亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，通过将分析物与表面和/或与表面结合的捕获探针交联的共价键，将分析物稳定地固定于表面上。在一些实施方案中，分析物在表面固定之前于存在载体的情况下经受热变性。在一些实施方案中，分析物在表面固定之前于存在载体的情况下经受化学
变性，例如分析物用诸如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高ph、低ph或十二烷基硫酸钠(sds)等变性剂进行变性。
13.在一些实施方案中，该技术提供用于检测蛋白分析物的系统。例如，在一些实施方案中，该系统包含稳定地结合蛋白分析物的捕获探针；和与蛋白分析物瞬时结合的查询探针。在一些实施方案中，捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，查询探针包含抗体。在一些实施方案中，查询探针包含抗原结合抗体片段、单价fab、纳米抗体、单链可变片段抗体、适体或低亲和力抗体。在一些实施方案中，查询探针包含标记。在一些实施方案中，查询探针包含荧光标记。在一些实施方案中，捕获探针固定于基质上。在一些实施方案中，基质为基本上平坦的表面。在一些实施方案中，基质为可扩散颗粒。在一些实施方案中，系统进一步包含检测组件，以检测查询探针与蛋白分析物的瞬时结合。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为接收和分析描述查询探针与蛋白分析物的缔合以及查询探针与蛋白分析物的解离的动力学数据的计算机。
14.在一些实施方案中，系统包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含稳定地结合分析物的捕获探针；以及与分析物瞬时结合的查询探针。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为在表面收集纳米颗粒的收集组件。在一些实施方案中，纳米颗粒具有5-200纳米(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200 nm)的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒为磁性的、顺磁性的、极性的、荷电的，或者具有与包含纳米颗粒的介质不同的密度。在一些实施方案中，收集组件在纳米颗粒上产生磁力、电力或惯性力。
15.在一些实施方案中，系统包含稳定地结合分析物的捕获探针；包含第一标记并瞬时结合分析物的第一查询探针；和包含第二标记并瞬时结合分析物的第二查询探针。在一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含瞬时结合分析物的相同探针部分。在一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含瞬时结合分析物的不同探针部分。在一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含f
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rster共振能量转移对。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一查询探针和第二查询探针与分析物的共定位瞬时结合的检测组件。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一标记和第二标记之间的瞬时f
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rster共振能量转移的检测组件。
16.在一些实施方案中，系统包含组合物，其包含稳定地结合分析物的捕获探针；和与分析物瞬时结合的查询探针；和被配置为将组合物保持在30-50℃下的温度控制组件。在一些实施方案中，温度为30℃、33℃或37℃。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测查询探针与分析物的瞬时结合的检测组件。
17.在一些实施方案中，系统包含组合物，其包含稳定地结合分析物的捕获探针；与分析物瞬时结合的查询探针；和多于100 mm的离子浓度。在一些实施方案中，离子为一价阳离子。在一些实施方案中，离子为钠离子。在一些实施方案中，离子浓度为至少500 mm。
18.在一些实施方案中，系统包含稳定地结合分析物的捕获探针；与分析物瞬时结合的查询探针；和微流体装置。在一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测查询探针与分析物的瞬时结合的检测组件。
19.在一些实施方案中，系统包含与表面共价连接的分析物；以及与分析物瞬时结合的查询探针。在一些实施方案中，分析物与捕获探针共价连接并且所述捕获探针与所述表
面共价连接。在一些实施方案中，分析物通过与n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、卤代乙酰基、马来酰亚胺或碳二亚胺或其衍生物的反应产物与所述捕获探针交联。在一些实施方案中，分析物通过经uv辐照产生的反应产物与捕获探针交联。
20.在一些实施方案中，该技术涉及用于使用如本文所述的系统来检测分析物的方法。例如，在一些实施方案中，方法包括提供如本文所述的系统；和检测分析物的存在和/或量化分析物。在一些实施方案中，分析物为疾病的生物标志物。在一些实施方案中，分析物为癌症的生物标志物。
21.在一些实施方案中，该技术涉及用于检测和/或量化样品中的分析物的方法。例如，在一些实施方案中，方法包括从受试者获得样品；提供如本文所述的系统；以及检测和/或量化所述样品中的分析物，其中所述分析物为疾病的生物标志物。在一些实施方案中，方法包括提供如本文所述的系统；以及检测和/或量化所述样品中的分析物，其中所述分析物为癌症的生物标志物。在一些实施方案中，样品为生物流体。在一些实施方案中，样品包含和/或制备自血液、尿液、粘液、唾液、精液或组织。在一些实施方案中，检测和/或量化样品中的分析物指示受试者患有所述疾病。在一些实施方案中，分析物包含蛋白、核酸或代谢物。在一些实施方案中，方法进一步包括提供描述所述样品中所述分析物的存在和/或数量的结果。在一些实施方案中，方法进一步包括提供阳性对照和/或阴性对照。在一些实施方案中，方法进一步包括提供标准曲线。
22.在一些实施方案中，该技术涉及使用如本文所述的系统来检测和/或量化样品中的分析物。
23.如本文讨论的，该技术的一些实施方案涉及微流体装置(例如包括微流体装置和/或包括使用微流体装置以检测分析物的方法和系统)。特别地，一些实施方案涉及用于检测分析物的系统。例如，在一些实施方案中，系统包含稳定地结合分析物的捕获探针；与分析物瞬时结合的查询探针；以及包含基质和其中固定捕获探针的捕获区域的微流体装置。在涉及微流体装置的一些实施方案中，捕获探针包含抗体。在涉及微流体装置的一些实施方案中，查询探针包含抗体。在涉及微流体装置的一些实施方案中，查询探针包含抗原结合的抗体片段、单价fab、纳米抗体、单链可变片段抗体、适体或低亲和力抗体。在涉及微流体装置的一些实施方案中，查询探针包含标记。在涉及微流体装置的一些实施方案中，查询探针包含荧光标记。
24.在涉及微流体装置的一些实施方案中，微流体装置的基质为基本上平坦的表面。
25.在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统进一步包含检测组件，以检测查询探针与分析物的瞬时结合。
26.在与微流体装置相关的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为接收和分析描述查询探针与蛋白分析物的缔合以及查询探针与蛋白分析物的解离的动力学数据的计算机。
27.在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物在微流体装置的捕获区域中混合。在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物通过主动和/或被动混合系统(例如微型搅拌器、声波、微泡、周期性流体脉动、热混合、电动混合、微流体装置通道和/或捕获区域中的脊、微流体装置通道和/或捕获区域中的人字形结构及其组合)来混合。
28.在涉及微流体装置的一些实施方案中，通过将分析物与表面和/或与表面结合的
捕获探针交联的共价键，将分析物固定于基质表面上。在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物与捕获探针共价连接并且所述捕获探针与所述表面共价连接。在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物通过与n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、卤代乙酰基、马来酰亚胺或碳二亚胺或其衍生物的反应产物与所述捕获探针交联。在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物通过经uv辐照产生的反应产物与所述捕获探针交联。
29.在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统包含两种或更多种与分析物瞬时结合的查询探针，每种查询探针包含区分每种查询探针与分析物的结合的不同可检测标记。在涉及微流体装置的一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含瞬时结合分析物的不同探针部分。在涉及微流体装置的一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含f
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rster共振能量转移对。
30.在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一查询探针和第二查询探针与分析物的共定位瞬时结合的检测组件。在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一标记和第二标记之间的瞬时f
ö
rster共振能量转移的检测组件。
31.在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为将微流体装置保持在约25-约50℃下的温度控制组件。
32.在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物在含有约100 mm-约1000 mm的离子浓度的溶液中被引入到所述微流体装置中。在涉及微流体装置的一些实施方案中，离子为一价阳离子。在涉及微流体装置的一些实施方案中，离子为钠离子。在涉及微流体装置的一些实施方案中，离子浓度为至少500 mm。
33.在涉及微流体装置的一些实施方案中，系统进一步包含一种或多种浓集分析物的组件，例如提供电泳堆叠、电泳聚焦、流约束、分析物样品的循环再加载和/或所述分析物的温度梯度聚焦的组件。
34.在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物为蛋白。
35.在涉及微流体装置的一些实施方案中，本文提供的技术涉及使用包含如本文所述的微流体装置的系统来检测和/或量化样品中的分析物。
36.在相关实施方案中，该技术提供方法，其包括提供包含如本文所述的微流体装置的系统；和检测和/或量化所述样品中的分析物。在涉及微流体装置的一些实施方案中，方法进一步包括在样品引入之后任选的洗涤步骤。在涉及微流体装置的一些实施方案中，样品为生物流体，例如包含和/或制备自血液、尿液、粘液、唾液、精液或组织的样品。在涉及微流体装置的一些实施方案中，检测和/或量化所述样品中的分析物指示受试者患有所述疾病。在涉及微流体装置的一些实施方案中，分析物包含蛋白、核酸或代谢物。在涉及微流体装置的一些实施方案中，方法进一步包括提供描述所述样品中所述分析物的存在和/或数量的结果。在涉及微流体装置的一些实施方案中，方法进一步包括提供阳性对照和/或阴性对照。在涉及微流体装置的一些实施方案中，方法进一步包括提供标准曲线。
37.如本文讨论的，该技术的一些实施方案涉及纳米颗粒(例如包括纳米颗粒和/或包括使用纳米颗粒以检测分析物的方法和系统)。特别地，一些实施方案涉及用于检测分析物的系统。例如，在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统包含稳定地结合分析物的捕获探针所附接的纳米颗粒；与分析物瞬时结合的查询探针；和捕获区域。
38.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为在捕获区域收集纳米颗粒的收集组件。
39.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，纳米颗粒具有5-200纳米的直径。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，纳米颗粒为磁性的、顺磁性的、极性的、荷电的，或者具有与包含纳米颗粒的介质不同的密度。
40.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，收集组件在纳米颗粒上产生磁力、电力或惯性力。
41.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，捕获探针包含抗体。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，查询探针包含抗体。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，查询探针包含抗原结合的抗体片段、单价fab、纳米抗体、单链可变片段抗体、适体或低亲和力抗体。在一些实施方案中，查询探针包含标记。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，查询探针包含荧光标记。
42.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含检测组件，以检测查询探针与分析物的瞬时结合。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为接收和分析描述查询探针与蛋白分析物的缔合以及查询探针与蛋白分析物的解离的动力学数据的计算机。
43.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，通过将分析物与表面和/或与表面结合的捕获探针交联的共价键，将分析物固定于基质表面上。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物与捕获探针共价连接并且所述捕获探针与所述表面共价连接。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物通过与n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、卤代乙酰基、马来酰亚胺或碳二亚胺或其衍生物的反应产物与所述捕获探针交联。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物通过经uv辐照产生的反应产物与所述捕获探针交联。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统包含两种或更多种与分析物瞬时结合的查询探针，每个查询探针包含区分每个查询探针与分析物的结合的不同可检测标记。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含瞬时结合分析物的不同探针部分。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，第一查询探针和第二查询探针包含f
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rster共振能量转移对。
44.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一查询探针和第二查询探针与分析物的共定位瞬时结合的检测组件。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为检测第一标记和第二标记之间的瞬时f
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rster共振能量转移的检测组件。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含被配置为将微流体装置保持在约25-约50℃下的温度控制组件。
45.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物在含有约100 mm-约1000 mm的离子浓度的溶液中被引入到所述微流体装置中。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，离子为一价阳离子。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，离子为钠离子。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，离子浓度为至少500 mm。
46.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，系统进一步包含一种或多种浓集分析物的组件，例如以提供电泳堆叠、电泳聚焦、流约束、分析物样品的循环再加载和/或所述分析物的温度梯度聚焦。
47.在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物为蛋白。
48.在一些实施方案中，该技术涉及使用包含如本文所述的纳米颗粒的系统来检测
和/或量化样品中的分析物。
49.在相关实施方案中，该技术提供使用包含如本文所述的纳米颗粒的系统的方法。例如，在一些实施方案中，方法包括提供系统，其包含如本文所述的纳米颗粒；和检测和/或量化所述样品中的分析物。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，方法进一步包括在样品引入之后任选的洗涤步骤。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，样品为生物流体。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，样品包含和/或制备自血液、尿液、粘液、唾液、精液或组织。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，检测和/或量化所述样品中的分析物指示受试者患有所述疾病。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，分析物包含蛋白、核酸或代谢物。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，方法进一步包括提供描述所述样品中所述分析物的存在和/或数量的结果。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，方法进一步包括提供阳性对照和/或阴性对照。在涉及纳米颗粒的一些实施方案中，方法进一步包括提供标准曲线。
50.基于本文包含的讲授，另外的实施方案对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
51.附图简述关于以下附图，本技术的这些和其他特征、方面和优势将更好地得到理解：图1为simreps技术的示意图。将分析物固定于表面(例如通过使用捕获探针)并使得该分析物与存在于相邻溶液中可检测地结合的查询探针相互作用。在存在捕获的分析物的情况下，分析物的每个拷贝均会产生查询探针结合和解离的特征模式，其构成动力学指纹(顶部)。在不存在分析物的情况下，可能会发生查询探针与表面或与除分析物以外的表面固定分子的非特异性结合，但这些表现出可区别于分析物的动力学指纹的查询探针的结合和解离模式，例如通过具有每单位时间不同的平均结合和解离循环数或者通过具有在结合或未结合状态下不同的平均(或中值，或最大，或最小)停留时间。区分特异性结合的动力学指纹和非特异性模式的能力随着观察到的结合事件数量的增加而增加，因为动力学指纹的平均特性随着每个分析物分子观察到更多的结合事件而越来越好地确定。
52.图2a为显示通过simreps检测蛋白分析物(目标抗原)的示意图。查询探针(动力学指纹探针)与表面捕获的抗原的重复结合产生重复结合模式，后者表现出不同于探针与表面或其他基质污染物的非特异性相互作用的动力学。荧光标记的查询探针的重复结合可例如通过全内反射荧光(tirf)显微术可视化。
53.图2b (左)显示显微镜视野的代表性部分的影片单帧，显示其中在如图2a中描述的simreps蛋白检测测定中单个荧光探针结合在成像表面处或附近的位置处的明亮斑点。图2b (右)显示影片帧中指示的斑点的时间依赖性模式图。时间依赖性模式包括高荧光和低荧光周期，其指示同一位置查询探针的结合和解离(或光漂白)。显示在特定目标范围内具有统计特性的重复结合和解离的强度相对于时间的轨迹被确定为产生自与目标抗原的相互作用，导致目标抗原的检测。
54.图3a为代表性强度相对于时间的轨迹的数据图，显示检测探针与表面固定的目标抗原vegf-a的单个拷贝重复相互作用的证据。
55.图3b显示在存在目标抗原vegf-a的情况下，在单个视野内观察到的所有强度相对于时间的轨迹的n
b d (每个轨迹观察到的结合和解离事件的数量)、τ
on,中值
(查询探针结合的状态中的中值寿命)和τ
off,中值
(查询探针未结合状态中的中值寿命)的两个散点图。虚线指
示接受轨迹作为单个vegf-a分子的证据的阈值(最小值或最大值)。由“ ”指示的点代表未通过对强度、信噪比和动力学的过滤的轨迹，并且不被认为是检测vegf-a的充分证据。由圆圈指示的点代表通过过滤并被接受为单个vegf-a分子存在的证据的轨迹。
56.图3c显示在不存在vegf-a的情况下n
b d
、τ
on,中值
和τ
off,中值
的两个散点图。没有轨迹通过过滤，指示不存在表面结合的目标抗原。
57.图4a、图4b和图4c显示在22℃ (图4a)、33℃ (图4b)和37℃ (图4c)下通过相同查询探针检测白细胞介素-6 (il-6)的代表性强度相对于时间的轨迹(上)、n
b d
相对于τ
on,中值
的图(左下)和τ
结合
的直方图(每个查询探针与目标抗原的结合事件的表观寿命) (右下)。平均结合状态寿命(《τ
结合
》)随着温度升高而降低到少于10分之一(例如从22℃下27秒到33℃下6秒到37℃下2.3秒)，提供在相同时间量中观察到更多的结合和解离事件(或等效地，在更短时间段内观察到相同数量的结合事件)。
58.图5a、图5b和图5c显示对于被用于通过simreps动力学指纹检测纤溶酶原激活抑制剂-1 (pai-1)的查询探针，增加成像缓冲液中的钠离子浓度可抑制背景结合并加速与目标抗原的解离。图5a显示在包含20 mm钠离子的低盐pbs中对于空白(左)和对于包含pai-1目标抗原的测试组合物(右)的simreps测定的结果。图5b显示在包含137 mm钠离子的pbs中对于空白(左)和对于包含pai-1目标抗原的测试组合物(右)的simreps测定的结果。图5c显示在包含约637 mm钠离子的pbs 500 mm nacl中对于空白(左)和对于包含pai-1目标抗原的测试组合物(右)的simreps测定的结果。n
b d
相对于τ
on,中值
的图显示，随着钠离子浓度从20 mm (图5a)增加至137 mm (图5b)再至约637 mm (图5c)，空白测量中的n
b d
值平均变得更小，指示查询探针的背景结合更少(图5a (左)、图5b (左)和图5c (左))。同时，随着钠离子浓度的增加，查询探针的中值结合状态寿命(τ
on,中值
)减少，并且在存在目标抗原pai-1的情况下观察到的平均n
b d
值增加。较低的非特异性结合和较快的与抗原解离的组合导致在较高盐浓度下更易于区分的特异性和非特异性结合的动力学。
59.图6显示一系列标准曲线，指示使用以荧光标记的查询探针进行simreps动力学指纹的4种抗原的定量检测。基质为动物血清(对pai-1和il-6为马血清；对vegf-a和il-34为鸡血清)。表观检测限对于pai-1为770 am，对于il-6为770 am，对于vegf-a为3.6 fm，和对于il-34为6.5 fm，所述检测限被计算为高于空白平均值3个标准差。误差条表示3次测量的一个标准差。由于每个样品孔内的整个捕获表面包含相当于约1000个视野(fov)的区域，标准曲线的斜率指示在100微升样品中每飞摩尔抗原在成像表面上捕获250-1300个之间的分子，对应于0.4-2.2%的捕获效率。
60.图7a为显示免洗方案的示意图。该方案被用于simreps，并提供血清中il-6的定量检测。在该方案中，将含有il-6的血清样品与包含查询探针的成像溶液合并，并然后将其添加到预涂有捕获抗体的盖玻片上。在合适的温育期(例如30分钟)之后，将样品通过tirf显微术成像以量化il-6。
61.图7b为来自用免洗方案的il-6的动力学指纹的数据图，以提供标准曲线。
62.图7c为通过simreps (无洗涤方案，对所有样品稀释100倍)和elisa (可变稀释系数，4或64倍，取决于分析物浓度)在34个患者来源(人类)的血清样品中测量的il-6的相关图。两种方法之间的相关系数为0.999，尽管事实上simreps方案避免样品引入后的洗涤步骤并且使用更加稀释高达25倍的样品。
63.应当理解，附图不一定按比例绘制，附图中的对象也不一定按相互关系的比例绘制。附图是预期为本文公开的装置、系统和方法的各种实施方案带来清楚和理解的描述。在可能的情况下，贯穿附图将使用相同的参考数字来指涉相同或类似的部分。此外，应当意识到附图并不预期以任何方式限制本讲授的范围。
64.详述在一些实施方案中，本文提供的技术涉及用与一种或多种查询探针的瞬时(例如动力学)而不是稳定(平衡、热力学)相互作用来检测生物分子分析物。将分析物用捕获探针固定于表面上，然后用瞬时结合的查询探针检测。与现有技术相反，本文描述的技术通过分析探针-靶标相互作用的动力学行为，以任意精确度在密切相关的分析物(例如磷酸化和非磷酸化的蛋白靶标)之间进行区分。参见图1。
65.在各种实施方案中，测定条件受到控制，使得使查询探针与分析物的相互作用成为瞬时的。例如，在一些实施方案中，该技术包括以下一项或多项，以提供其中发生探针和分析物的瞬时相互作用的条件：(1) 设计查询探针，使得其与靶标弱相互作用(例如在纳摩尔亲和力范围内)；(2) 控制温度，使得查询探针与分析物弱相互作用；(3) 控制溶液条件，例如离子强度、离子组成、添加离液剂、添加竞争探针等，使得查询探针与分析物弱相互作用。
66.在一些实施方案中，该技术包括使用例如光子力和/或超声能量。例如，在一些实施方案中光子力促进在特定位置中材料(尤其是较大颗粒)的浓集。在一些实施方案中，超声促进混合，例如以调节动力学缔合，例如通过增加混合速率超过简单扩散。
67.在一些实施方案中，查询探针与分析物的结合通过全内反射荧光显微术或有单分子灵敏度能力的另外技术来测量。
68.在各种实施方案的该详细描述中，出于解释的目的，阐述许多具体细节以提供所公开的实施方案的彻底理解。然而，本领域的技术人员应当意识到，可在有或没有这些具体细节的情况下实践这些各种实施方案。在其他情况下，以框图形式显示结构和装置。此外，本领域的技术人员可易于意识到，其中呈现和实施方法的具体次序为说明性的，并且考虑次序可以变化且仍然保留在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。
69.在本技术中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页，均明确地通过参考以其全部结合用于任何目的。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本文描述的各种实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当在结合的参考文献中的术语的定义看起来不同于本讲授中提供的定义时，以本讲授中提供的定义为准。本文中使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为以任何方式限制描述的主题。
70.定义为促进对本技术的理解，以下定义许多术语和短语。另外的定义贯穿详述进行了阐述。
71.贯穿该说明书和权利要求，以下术语采用本文中明确相关的含义，除非上下文另外清楚地规定。如本文使用的，短语“在一个实施方案中”不一定是指相同的实施方案，尽管可能如此。此外，如本文使用的，短语“在另一个实施方案中”不一定是指不同的实施方案，尽管可能如此。因此，如下所述，可容易地组合本发明的各种实施方案而不背离本发明的范
围或精神。
72.另外，如本文使用的，术语“或”为包含性的“或”算符，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另外清楚地规定。术语“基于”不是排除性的，并且允许基于未描述的另外因素，除非上下文另外清楚地规定。另外，贯穿该说明书，“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”的含义包括复数指涉。“在
……
中”的含义包括“在
……
中”和“在
……
上”。
73.如本文使用的，术语“约(about)”、“大约(approximately)”、“大幅地”和“显著地”为本领域普通技术人员所理解的，并且将在某种程度上基于其中使用它们的上下文而变化。如果这些术语的使用对于本领域的普通技术人员而言鉴于其中使用它们的上下文为不清楚的，则“约”和“大约”意指正负小于或等于特定术语的10%，并且“大幅地”和“显著地”意指正负大于特定术语的10%。
74.如本文使用的，范围的公开包括整个范围内的所有值和进一步划分的范围的公开，包括对范围给出的端点和子范围。
75.如本文使用的，后缀“无
…
(-free)”是指省略了附加“无
…”
的词语的基本词根的特征的技术实施方案。也就是说，如本文使用的，术语“无x”意指“没有x”，其中x为“无x”技术中省略的技术特征。例如，“无钙”组合物不包含钙，“无混合”方法不包括混合步骤等。
76.尽管术语“第一”、“第二”、“第三”等在本文中可被用于描述各种步骤、元件、组合物、组件、区域、层和/或部分，但这些步骤、元件、组合物、组件、区域、层和/或部分不应被这些术语限制，除非另外指明。这些术语被用于区分一个步骤、元件、组合物、组件、区域、层和/或部分与另一个步骤、元件、组合物、组件、区域、层和/或部分。诸如“第一”、“第二”等术语以及其他数字术语在被用于本文中时并不意指次序或顺序，除非上下文清楚地指明。因此，本文中讨论的第一步骤、元件、组合物、组件、区域、层或部分可被称为第二步骤、元件、组合物、组件、区域、层或部分而不背离技术。
77.如本文使用的，术语“受试者”和“患者”是指任何生物体，包括植物、微生物和动物(例如哺乳动物，比如狗、猫、家畜和人类)。
78.如本文使用的，术语“样品”在其最广泛含义中使用。在一些实施方案中，样品是动物细胞或组织或包含动物细胞或组织。在一些实施方案中，样品包括获得自任何来源的样本或培养物(例如微生物培养物)，以及生物和环境样品。生物样品可获得自植物或动物(包括人类)，并且包括流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料，比如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不应被解释为限制可适用于本技术的样品类型。
79.如本文使用的，“生物样品”是指生物组织或流体的样品。例如，生物样品可为获得自动物(包括人类)的样品；流体、固体或组织样品；以及液体和固体的食品和饲料的产品和成分，比如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品以及废物。生物样品可获得自所有各种科的家养动物，以及未驯服的或野生的动物，包括但不限于诸如有蹄类、熊、鱼、兔形目、啮齿类等动物。生物样品的实例包括组织的切片、血液、血液级分、血浆、血清、尿液或来自其他外周来源的样品或细胞培养物、细胞集落、单细胞或单细胞的集合。此外，生物样品包括上述样品的混杂物或混合物。生物样品可通过从受试者取出细胞样品来提供，但是也可通过使用先前分离的样品来提供。例如，可通过常规活组织检查技术从疑似患有疾病的受试者取出组织样品。在一些实施方案中，血液样品取自受试者。来自患者的生物样品意指来自疑似受疾病影响的受试者的样品。
80.环境样品包括环境材料，比如表面物质、土壤、水和工业样品，以及获得自食品和乳制品加工仪器、装置、设备、器具、一次性和非一次性物品的样品。这些实例不应被解释为限制可适用于本发明的样品类型。
81.如本文使用的，术语“标记”是指任何原子、分子、分子复合物(例如金属螯合物)或胶体颗粒(例如量子点、纳米颗粒、微粒等)，其可被用于提供可检测的(优选地可量化的)效果，且其可附接于核酸或蛋白。标记包括但不限于染料(例如光学上可检测的标记、荧光染料或部分等)；放射性标记，比如
32
p；结合部分，比如生物素；半抗原，比如地高辛；发光、磷光、光学上可检测或荧光的部分；质量标签；和单独或与可通过f
ö
rster共振能量转移(fret)抑制或转移发射光谱的部分组合的荧光染料，所述f
ö
rster共振能量转移也被称为荧光共振能量转移。参见例如jones和bradshaw (2019)
ꢀ“
resonance energy transfer: from fundamental theory to recent applications
”ꢀ
frontiers in physics第7期，第100篇，通过参考结合至本文中。标记可提供可通过荧光、发光、放射性、比色法、重量分析法、x-射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量特征或受质量影响的行为(例如maldi飞行时间质谱；荧光偏振)等检测的信号。标记可为荷电部分(正或负电荷)，或者可为电荷中性的。标记可包括核酸或蛋白序列或者由其组成，只要包含所述标记的序列为可检测的。
82.如本文使用的，术语“荧光团”应被理解为是指荧光团和发光团以及淬灭荧光或发光发射的化学试剂。进一步地，如本文使用的，“荧光团”是指当适当刺激时具有荧光特性的任何种类。引发荧光的刺激一般为照明；然而，本文也考虑其他类型的刺激(例如碰撞)。术语“荧光团”、“荧光体(fluor)”、“荧光部分”、“荧光染料”和“荧光基团”可互换使用。在一些实施方案中，荧光标记包含如以下在标题为“荧光标记”的章节中所述的荧光团。
83.如本文使用的，术语“支持物”或“固体支持物”是指这样的基质：可将核酸分子、微粒等固定于其上或其中，例如可将它们与其共价或非共价地附接或者可将它们部分或完全地包埋在其中或其上，使得在很大程度上或完全地阻止它们自由扩散或相对于彼此移动。
84.如本文使用的，术语“部分”是指可将某物划分成的两个或更多个部分中的一个，比如寡核苷酸、分子、化学基团、结构域、探针等的各个部分。
85.如本文中使用的，术语“核酸”或“核酸序列”是指嘧啶和/或嘌呤碱基(优选地分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及腺嘌呤和鸟嘌呤)的聚合物或寡聚物(参见albert l. lehninger, principles of biochemistry, at 793-800 (worth pub. 1982))。本技术考虑任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分及其任何化学变体，比如这些碱基的甲基化、羟基甲基化或糖基化形式等。聚合物或寡聚物在组成上可为异源的或同源的，并且可从天然存在的来源分离，或者可以人工或合成地产生。另外，核酸可为dna或rna或其混合物，并且可永久或暂时地以单链或双链形式(包括同源双链体、异源双链体和杂合状态)存在。在一些实施方案中，核酸或核酸序列包含其他种类的核酸结构，比如dna/rna螺旋、肽核酸(pna)、吗啉代、锁核酸(lna)和/或核酶。因此，术语“核酸”或“核酸序列”也可包括这样的链：其包含可表现出与天然核苷酸相同功能的非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非核苷酸砌块(例如“核苷酸类似物”)；进一步地，如本文使用的，术语“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，并且是指基因组或合成起源的dna或rna，其可为单链或双链的，并且表示有义或反义链。
86.如本文使用的，术语“核苷酸类似物”是指修饰的或非天然存在的核苷酸，包括但
不限于具有改变的堆叠相互作用的类似物，比如7-脱氮嘌呤(例如7-脱氮-datp和7-脱氮-dgtp)；具有备选氢键键合构型的碱基类似物(例如iso-c和iso-g以及其他非标准碱基对，如s. benner的美国专利号6,001,983所述，并且所述专利通过参考结合至本文中)；非氢键键合类似物(例如非极性芳族核苷类似物，比如2,4-二氟甲苯，如b. a. schweitzer和e. t. kool, j. org. chem., 1994, 59, 7238-7242、b. a. schweitzer和e. t. kool, j. am. chem. soc., 1995, 117, 1863-1872所述；其每一个均通过参考结合至本文中)；“通用”碱基，比如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(比如分别为“k”和“p”核苷酸；p. kong等人, nucleic acids res., 1989, 17, 10373-10383、p. kong等人, nucleic acids res., 1992, 20, 5149-5152)。核苷酸类似物包括在糖部分上具有修饰的核苷酸，比如双脱氧核苷酸和2
’‑
o-甲基核苷酸。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。
87.如本文使用的，术语“肽核酸”意指并入肽样聚酰胺骨架的dna模拟物。
88.如本文使用的，术语“互补的”或“互补性”被用于指通过碱基配对法则相关的多核苷酸(例如核苷酸序列，比如寡核苷酸捕获探针、查询探针或作为核酸的分析物)。例如，对于序列“5
’‑
a-g-t-3
’”
，与序列“3
’‑
t-c-a-5
’”
为互补的。互补性可为“部分的”，其中根据碱基配对法则仅有一些核酸的碱基为匹配的。或者，核酸之间可能存在“完全(complete)”或“完全(total)”的互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中特别重要。也可使用任一术语来指涉单个核苷酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，寡核苷酸内的特定核苷酸可由于其与另一核酸链内核苷酸的互补性或缺少互补性而受到关注，与寡核苷酸的其余部分和核酸链之间的互补性形成对比或比较。
89.在一些上下文中，术语“互补性”和相关术语(例如“互补的”、“互补物”)是指可通过氢键与另一核酸序列结合的核酸序列的核苷酸，例如能够例如通过watson-crick碱基配对或其他碱基配对进行碱基配对的核苷酸。可形成碱基对(例如彼此互补的)核苷酸为以下的对：胞嘧啶和鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶以及鸟嘌呤和尿嘧啶。百分比互补性不需要在核酸序列的整个长度上进行计算。互补性的百分比可限于核酸序列碱基配对的特定区域，例如从第一个碱基配对的核苷酸开始并在最后一个碱基配对的核苷酸结束。如本文使用的，核酸序列的互补物是指当其与核酸序列比对使得一个序列的5’端与另一个的3’端配对时，处于“反向平行缔合”的寡核苷酸。某些在天然核酸中不常见的碱基可被包括在本发明的核酸中并且包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性不需要完美；稳定的双链体可含有错配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可根据经验考虑以下许多变量来确定双链体稳定性：包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、错配碱基对的离子强度和发生率。
90.因此，在一些实施方案中，“互补的”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上与第二核碱基序列的互补物具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的第一核碱基序列，或者这两个序列在严格杂交条件下杂交。“完全互补的”意指第一核酸的每个核碱基能够与第二核酸中对应位置处的每个核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中每个核碱基都对核酸具有互补性的寡核苷酸具有在8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上与核酸的互补物具有同一性的核碱基序列。
91.如本文使用的，术语“错配”是指不能与第二核酸对应位置处的核碱基配对的第一核酸的核碱基。
92.如本文使用的，术语“结构域”在关于多肽进行使用时，是指具有独特的结构和/或功能特征的多肽的子部分；一般地，该特征在各种多肽之间类似。子部分一般包含连续氨基酸，尽管其也可包含协同地起作用的氨基酸或者由于折叠或其他构型而紧密靠近的氨基酸。蛋白结构域的实例包括跨膜结构域、糖基化位点等。
93.如本文使用的，术语“基因”是指包含对于产生rna或多肽或其前体(例如胰岛素原)而言必需的编码序列的核酸(例如dna或rna)序列。功能性多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分进行编码，只要多肽的期望的活性或功能特性(例如酶促活性、配体结合、信号转导等)得到保持。术语“部分”在关于基因进行使用时，是指该基因的片段。片段的大小范围可为几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“至少包含基因的一部分的核苷酸”可包含基因的片段或整个基因。
94.术语“基因”还包括结构基因的编码区，并且包括在5’和3’两端上位于邻近编码区(在任一端相距约1 kb)的序列，使得基因对应于全长mrna的长度。位于编码区的5’和存在于mrna上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游和存在于mrna上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cdna形式和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆含有编码区，其被称为“内含子”或“间隔区”或“间隔序列”的非编码序列间断。内含子为被转录成核rna (hnrna)的基因区段；内含子可含有调控元件，比如增强子。内含子从核或初级转录本中去除或“剪接掉”；因此内含子不存在于信使rna (mrna)转录本中。mrna在翻译期间发挥功能以规定在新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
95.除含有内含子之外，基因的基因组形式还可包括位于存在于rna转录本上的序列的5’和3’两端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mrna转录本上的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区域可含有调控序列，比如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3’侧翼区域可含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
96.如本文使用的，术语“野生型”是指这样的基因或基因产物：其当分离自天然存在的来源时具有该基因或基因产物的特征。野生型基因为在群体中最频繁地观察到的基因，并且因此任意地命名为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变体”或“多态的”是指当与野生型基因或基因产物相比较时，显示出序列和/或功能特性的修饰(即改变的特征)的基因或基因产物。应当注意，可分离天然存在的突变体；这些通过以下事实来鉴定：当与野生型基因或基因产物相比较时，它们具有改变的特征。因此，术语“变体”和“突变体”在关于核苷酸序列进行使用时，是指与另一通常相关的核苷酸序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。“变异”为两个不同核苷酸序列之间的差异；在一些实施方案中，一个序列为参考序列。
97.如本文使用的，术语“等位基因”是指基因中的不同变异；变异包括但不限于变体和突变体、多态性基因座和单核苷酸多态性基因座、移码和剪接突变。等位基因可天然存在于群体中，或者其可在群体的任何特定个体的寿命期间产生。
98.如本文使用的，术语“杂交”关于互补核酸的配对进行使用。杂交和杂交的强度(例如核酸之间的缔合强度)受比如以下因素影响：核酸之间的互补程度、涉及的条件严格性和所形成的杂合物的tm。“杂交”方法涉及一个核酸与另一互补核酸(例如具有互补核苷酸序列的核酸)的退火。含有互补序列的两种核酸聚合物通过碱基配对相互作用找到彼此并退火的能力为充分公认的现象。由marmur和lane, proc. natl. acad. sci. usa 46:453 (1960)和doty等人, proc. natl. acad. sci. usa 46:461 (1960)对“杂交”过程的初始观察之后，已将该过程细化成现代生物学的基本工具。
99.如本文使用的，术语“t
m”关于“解链温度”进行使用。解链温度为双链核酸分子的群体变得半解离成单链时的温度。几个用于计算核酸的tm的方程式为本领域众所周知的。如标准参考文献所指示的，可通过以下方程式计算tm值的简单估计：t
m = 81.5 0.41* (%g c)，当核酸在1 m nacl的水溶液中时(参见例如anderson和young, quantitative filter hybridization, in nucleic acid hybridization (1985))。其他参考文献(例如allawi和santalucia, biochemistry 36: 10581-94 (1997)，通过参考结合至本文中)包括更复杂的计算，其考虑结构、环境和序列特征来计算tm。例如，在一些实施方案中，这些计算会提供关于短核酸探针和靶标(例如如在实施例中使用的)的tm的改进估计。
100.如本文使用的，术语“蛋白”和“多肽”是指包含经肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。由基因编码的“蛋白”或“多肽”不限于由基因编码的氨基酸序列，还包括蛋白的翻译后修饰。当在本文叙述术语“氨基酸序列”以指蛋白分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语比如“多肽”或“蛋白”并不意指将氨基酸序列限于与所述蛋白分子相关的完整天然氨基酸序列。此外，“氨基酸序列”可从编码蛋白的核酸序列推断。常规的单字母和三字母氨基酸代码在本文中使用如下：丙氨酸：ala，a；精氨酸：arg，r；天冬酰胺：asn，n；天冬氨酸：asp，d；半胱氨酸：cys，c；谷氨酸：glu、e；谷氨酰胺：gln，q；甘氨酸：gly，g；组氨酸：his，h；异亮氨酸：ile，i；亮氨酸：leu，l；赖氨酸：lys，k；甲硫氨酸：met，m；苯丙氨酸：phe，f；脯氨酸：pro，p；丝氨酸：ser，s；苏氨酸：thr，t；色氨酸：trp，w；酪氨酸：tyr，y；缬氨酸：val，v。如本文使用的，代码xaa和x是指任何氨基酸。
101.如本文使用的，术语“变体”和“突变体”在关于多肽进行使用时，是指与另一通常相关的多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
102.如本文使用的，术语“解链”在关于核酸进行使用时，是指双链核酸或核酸区域解离成单链核酸或核酸区域。
103.如本文使用的，“查询探针”或“读取探针”为识别分析物(例如与分析物结合，例如与分析物特异性地结合)的任何实体(例如分子、生物分子等)。在示例性的实施方案中，查询探针为识别分析物的蛋白(例如抗体)。在一些其他示例性的实施方案中，查询探针为识别分析物的核酸(例如dna、rna、包含dna和rna的核酸、包含经修饰的碱基和/或经修饰的碱基间键的核酸；例如如上文所述的核酸，核酸适体)。在一些实施方案中，查询探针例如被可检测标记(比如如本文所述的荧光部分)标记。在一些实施方案中，查询探针包含多于一种类型的分子(例如蛋白、核酸、化学接头或化学部分中的多于一种)。
104.如本文使用的，“事件”是指查询探针与分析物结合的情况或查询探针与分析物解离的情况，例如如通过监测指示查询探针与分析物的结合和/或查询探针与分析物的解离的可检测特性所测量的。
105.如本文使用的，“捕获探针”为识别分析物(例如与分析物结合，例如与分析物特异性地结合)并将分析物连接于固体支持物的任何实体(例如分子、生物分子等)。在一些实施方案中，捕获探针为识别分析物的蛋白(例如抗体)。在一些实施方案中，捕获探针为识别分析物(例如dna、rna、包含dna和rna的核酸、包含经修饰的碱基和/或经修饰的碱基间键的核酸；例如如上文所述的核酸，核酸适体)的核酸。在一些实施方案中，捕获探针例如被可检测标记(比如如本文所述的荧光部分)标记。在一些实施方案中，捕获探针包含多于一种类型的分子(例如蛋白、核酸、化学接头或化学部分中的多于一种)。
106.如本文使用的，术语“灵敏度”是指当样品包含分析物时测定对分析物给出阳性结果的概率。灵敏度被计算为真阳性结果的数量除以真阳性和假阴性的总和。灵敏度为测定检测分析物的程度的量度。
107.如本文使用的，术语“特异性”是指当样品不包含分析物时，测定给出阴性结果的概率。特异性被计算为真阴性结果的数量除以真阴性和假阳性的总和。特异性为本发明的方法将不包含分析物的样品从确实包含分析物的那些中排除的程度的量度。
108.如本文使用的，“平衡常数”(k
eq
)、“平衡缔合常数”(ka)和“缔合结合常数”(或“结合常数”(kb))可互换地用于以下在平衡时a和b的结合反应：其中a和b为两个彼此缔合的实体(例如捕获探针和分析物、查询探针和分析物)，并且k
eq = [ab] / ([a]
ꢀ×ꢀ
[b])。解离常数k
d = 1/kb。kd为描述一个结合配偶体a对与之缔合的配偶体b的亲和力的有用方式，例如数值kd代表产生显著量的ab所需的a或b的浓度。k
eq = k
off / k
on
；k
d = k
off / k
on
。因此，解离常数kd和缔合常数ka为亲和力的定量量度。在平衡时，a和b与a-b复合物处于平衡，并且速率常数ka和kd量化平衡状态的单个正向和逆向反应的速率：在平衡时，k
a [a][b]=k
d [ab]。解离常数kd由k
d = k
d / ka=[a][b] / [ab]给出。kd具有浓度单位，例如m、mm、
µ
m、nm、pm等。当比较被表示为kd的亲和力时，更低的数值指示更大的亲和力。缔合常数ka由k
a = 1 / k
d = [ab] / [a][b]给出。ka具有浓度倒数的单位，最一般地为m-1
、mm-1
、
µ
m-1
、nm-1
、pm-1
等。
[0109]
如本文使用的，彼此缔合的两个实体的产物(例如根据以上方程式从a和b形成ab)的“显著量”，是指等于或大于a或b的游离浓度(以较小的为准)的ab的浓度。
[0110]
如本文使用的，“纳摩尔亲和力范围”是指两种组分的缔合，其具有在纳摩尔范围内的平衡解离常数k
d (例如k
off / k
on
的比率)，例如1
ꢀ×ꢀ
10-10
至1
ꢀ×ꢀ
10-5 m (例如在一些实施方案中1
ꢀ×ꢀ
10-9
至1
ꢀ×ꢀ
10-6 m)的解离常数(kd)。解离常数具有摩尔单位(m)。解离常数越小，两种组分(例如捕获探针和分析物；查询探针和分析物)之间的亲和力越高。
[0111]
如本文使用的，“弱亲和力”或“弱结合”或“弱缔合”是指具有约100纳摩尔(例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、
400或500纳摩尔)和/或在一些实施方案中1纳摩尔至10微摩尔范围内的kd的缔合。
[0112]
术语“特异性结合”或“特异性地结合”在关于彼此缔合的两种组分a和b的相互作用进行使用时，是指具有比a或b与溶液中的其他类似组分(例如溶液中不是a或b的至少一种其他分子物种)的相互作用的kd更小的kd的a和b的缔合。
[0113]
如本文使用的词语“存在”或“不存在”(或者“存在的”或“不存在的”)以相对的含义被用于描述特定实体(例如分析物)的量或水平。例如，当分析物被称为在样品中“存在”时，其意指该分析物的水平或量高于预定的阈值；相反地，当分析物被称为在样品中“不存在”时，其意指该分析物的水平或量低于预定的阈值。预定的阈值可为与被用于检测分析物的特定测试相关的检测能力的阈值或任何其他阈值。当分析物在样品中“被检测到”时，其在样品中“存在”；当分析物“未被检测到”时，其在样品中“不存在”。进一步地，其中分析物“被检测到”或其中分析物“存在”的样品为对于分析物为“阳性”的样品。其中分析物“未被检测到”或其中分析物“不存在”的样品为对于分析物为“阴性”的样品。
[0114]
如本文使用的，“增加”或“减少”是指相对于先前测量的变量值、相对于预先确立的值和/或相对于标准对照值，变量值的可检测的(例如测量的)正向或负向变化。增加为相对于先前测量的变量值、预先确立的值和/或标准对照值，优选至少10%、更优选50%、仍然更优选2倍、甚至更优选至少5倍和最优选至少10倍的正向变化。类似地，减少为先前测量的变量值、预先确立的值和/或标准对照值的优选至少10%、更优选50%、仍然更优选至少80%和最优选至少90%的负向变化。指示定量变化或差异的其他术语，比如“更多”或“更少”，在本文中以与以上所述相同的方式使用。
[0115]
术语“检测测定”是指用于检测分析物存在或不存在或者分析物的活性或效果或者用于检测分析物的变体存在或不存在的测定。
[0116]
如本文使用的，术语“系统”表示包含一个整体的真实或抽象的一组组分，其中各组分与该整体内的至少一种其他组分相互作用或相关联。
[0117]
在一些实施方案中，该技术包括抗体组分或部分，例如包含抗体或者其片段或衍生物的捕获探针和/或查询探针。如本文使用的，“抗体”，也被称为“免疫球蛋白”(例如igg、igm、iga、igd、ige)，包含两条通过二硫键彼此连接的重链和两条轻链，所述轻链中的每条都通过二硫键连接于重链。抗体的特异性在于抗体的抗原结合位点(或互补位)与抗原决定簇(或表位)之间的结构互补性。抗原结合位点由主要来自高变或互补决定区(cdr)的残基组成。偶尔地，来自非高变或框架区的残基影响总体结构域结构，并因此影响结合位点。一些实施方案包含抗体片段，例如任何含有蛋白或多肽的分子，其包含免疫球蛋白分子的至少一部分，以致允许所述分子与抗原之间特异性相互作用。免疫球蛋白分子的部分可包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(cdr)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。此类片段可通过酶促切割、合成或重组技术产生，如本领域已知和/或如本文所述的。也可使用其中一个或多个终止密码子已被引入天然终止位点上游的抗体基因来产生呈多种截短形式的抗体。抗体的各个部分可通过常规技术化学连接在一起，或者可使用基因工程技术制备为连续蛋白。
[0118]
抗体片段包括但不限于fab (例如通过木瓜蛋白酶消化)、f(ab’)
2 (例如通过胃蛋白酶消化)、fab
’ꢀ
(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和fv或scfv (例如通过分子生物学技术)片段。
[0119]
可通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理抗体来获得fab片段。此外，可通过将编码抗体的fab的dna插入到用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体中，并将载体引入到原核生物或真核生物中以表达fab，来产生fab。可通过用蛋白酶胃蛋白酶处理抗体来获得f(ab’)2。此外，可通过经硫醚键或二硫键结合fab’来产生f(ab’)2。可通过用还原剂(例如二硫苏糖醇)处理f(ab’)2来获得fab。此外，可通过将编码抗体的fab’片段的dna插入到用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体中，并将载体引入到原核生物或真核生物中以供其表达，来产生fab’。fv片段可通过经胃蛋白酶的限制性切割来产生，例如在4℃和ph 4.0下(被称为“冷胃蛋白酶消化”的方法)。fv片段由通过强非共价相互作用保持在一起的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(v
l
)组成。scfv片段可通过以下来产生：获得编码如先前所述的vh和v
l
结构域的cdna，构建编码scfv的dna，将dna插入到用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体中，并然后将表达载体引入到原核生物或真核生物中以表达scfv。
[0120]
一般而言，通常可使用本领域目前众所周知的许多常规技术针对任何抗原建立抗体。
[0121]
如本文使用的，术语“缀合的”是指当一种分子或试剂物理或化学偶联或者附着于另一种分子或试剂时。缀合的实例包括共价键和静电复合。术语“复合的”、“与...复合”和“缀合的”在本文中可互换使用。
[0122]
如本文使用的，“稳定相互作用”或指涉“稳定结合的”相互作用是指在相互作用的热力学平衡条件下相对持久的缔合。在一些实施方案中，“稳定相互作用”为具有小于约10-9 m的kd或者在一些实施方案中小于10-8 m的kd的两种组分之间的相互作用。在一些实施方案中，“稳定相互作用”具有每小时小于1的解离速率常数k
off
，或者在一些实施方案中具有每分钟小于1的解离速率常数k
off
。在一些实施方案中，“稳定相互作用”被定义为不是“瞬时相互作用”，而“瞬时相互作用”被定义为不是“稳定相互作用”。在一些实施方案中，“稳定相互作用”包括由共价键介导的相互作用和其他相互作用，所述其他相互作用一般不由kd值描述但涉及两个实体之间每次相互作用长于约1分钟(例如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180秒)的平均缔合寿命。
[0123]
在一些实施方案中，“稳定相互作用”和“瞬时相互作用”之间的区别由kd和/或k
off
和/或描述缔合的另一动力学或热力学值的截止值来确定，其中该截止值被用于在稳定和瞬时相互作用之间进行区分，所述稳定和瞬时相互作用如果以kd和/或k
off
的绝对项或者描述缔合的另一动力学或热力学值来描述，则可以不同方式另外表征。例如，由kd值表征的“稳定相互作用”也可在另一种甚至更稳定的相互作用的上下文中被表征为“瞬时相互作用”。本领域的技术人员应当理解稳定和瞬时相互作用的其他相对比较，例如，由kd值表征的“瞬时相互作用”也可在另一种甚至更瞬时(更不稳定)的相互作用的上下文中被表征为“稳定相互作用”。
[0124]
如本文使用的，术语“稳定相互作用”、“稳定结合”和“稳定缔合”可互换使用。如本文使用的，术语“瞬时相互作用”、“瞬时结合”和“瞬时缔合”可互换使用。
[0125]
如本文使用的，术语“亲和力”是指一个实体(例如分子)与另一实体(例如分子)的相互作用(例如结合)的强度，所述一个实体与另一实体例如抗体与抗原。在一些实施方案
中，亲和力取决于实体之间立体化学配合的紧密度，基于它们之间的接触面积大小，基于荷电和疏水基团的分布等。
[0126]
如本文使用的，术语“不可逆相互作用”是指相互作用(例如缔合、结合等)具有的解离半衰期长于温育时间，例如在一些实施方案中，时间为1-10分钟(例如60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600秒或者更长)。
[0127]
如本文使用的，“部分”是指某物可划分成的两个或更多个部分中的一个，比如寡核苷酸、分子、化学基团、结构域、探针、“r”基团、多肽等的各个部分。
[0128]
如本文使用的，在一些实施方案中，“信号”为与所测定样品的一种或多种特性(例如查询探针与分析物的结合和/或查询探针与分析物的解离)相关的时变数量。信号可为时域连续的或时域离散的。作为数学抽象概念，连续时间信号的域为实数集(或其区间)，而离散时间信号的域为整数集(或其区间)，离散信号通常经连续信号的“数字采样”产生。例如，声音信号由在线路上连续波动的电压组成，该信号可通过以规律间隔(例如每50微秒)读取线路上的电压水平而数字化。所得数字流作为离散时间数字信号进行储存。在一些实施方案中，信号被记录为空间中位置的函数(例如x，y坐标；例如x，y，z坐标)。在一些实施方案中，信号被记录为时间的函数。在一些实施方案中，信号被记录为时间和位置的函数。
[0129]
如本文使用的，术语“算法”为广泛的术语并且以其普通含义进行使用，包括但不限于涉及将信息从一种状态变换为另一种的计算过程(例如程序)，例如使用计算机处理。
[0130]
描述尽管本文的公开提及某些说明性实施方案，但是应当理解，这些实施方案通过实例而非通过限制呈现。
[0131]
simreps如本文使用的，术语“通过平衡泊松采样的单分子识别”及其缩写“simreps”是指无扩增的单分子检测方法，用于通过“动力学指纹”识别和计数生物流体中的分析物。如本文使用的，术语“动力学指纹”可与术语“simreps”互换使用。该技术描述于美国专利号10,093,967、美国专利申请序列号16/154,045、16/076,853、15/914,729、16/219,070和国际专利申请号pct/us19/43022中，其每一个均通过参考结合至本文中。也参见johnson-buck等人，(2015)
ꢀ“
kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids
”ꢀ
nature biotechnology 33: 730-32，其通过参考结合至本文中。
[0132]
简言之，simreps技术包括直接观察荧光探针与表面捕获的分析物(例如核酸、蛋白质等)的重复结合，这产生特异性的(例如对于核酸为序列特异性的)动力学指纹。动力学指纹在单分子分辨率下以高置信度识别分析物。动力学指纹克服先前受热力学特异性障碍限制的技术，从而最小化和/或消除假阳性。因此，simreps技术提供超高特异性，所述超高特异性可用于检测例如稀有分析物，比如稀有或低丰度突变dna等位基因。现有工作已表明，simreps能够进行单核苷酸辨别(参见例如johnson-buck等人(2015)
ꢀ“
kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids
”ꢀ
nat. biotechnol. 33: 730-32；su等人(2017)
ꢀ“
single-molecule counting of point mutations by transient dna binding
”ꢀ
sci rep7: 43824，其每一个通过参考结合至本文中)。参见图1。
[0133]
该技术例如在存在类似分析物的情况下，并且在一些实施方案中在存在背景噪声的情况下，提供分析物的检测。在一些实施方案中，源于查询探针与分析物的瞬时结合的信号可区别于由未结合查询探针产生的信号(例如通过观察、监测和/或记录在结合事件期间信号强度的局部变化)。在一些实施方案中，观察查询探针(例如荧光标记的查询探针)与分析物的瞬时结合通过诸如全内反射荧光(tirf)或近-tirf显微术、零模波导(zmw)、光片显微术、受激发射损耗(sted)显微术或共焦显微术等技术提供。在一些实施方案中，本文提供的技术使用查询探针，其具有当未结合于分析物时淬灭的荧光发射和/或当结合于分析物时去淬灭的荧光发射。
[0134]
在特定实施方案中，该技术可用于使用捕获探针和/或查询探针来检测蛋白分析物，所述捕获探针和/或查询探针包含抗体或抗原结合的抗体片段(例如igg、(fab)2、单价fab、纳米抗体或单链可变片段抗体)，适体(例如核酸或肽适体)，或蛋白分析物的天然存在的结合配偶体，蛋白分析物的肽序列，或蛋白分析物的翻译后修饰。参见图2a和图2b。
[0135]
该技术包括在所观察的面积的离散区域和/或体积的离散区域内，例如在平面或体积的特定空间坐标处，定位和/或观察查询探针与分析物的瞬时结合。在一些实施方案中，相对于固定的(例如表面结合的)分析物之间的平均间隔，在确定结合或解离事件的空间坐标方面的误差(例如由于有限的信号、检测器噪声或检测器中的空间分箱)是小的(例如被最小化、消除)。在包括使用宽视野荧光显微术的一些实施方案中，通过在样本平面中使用有效检测器像素尺寸来最小化和/或消除测量误差，所述尺寸不大于固定的(例如表面结合的)分析物之间的平均距离，且每个检测时间点收集许多荧光光子(在一些实施方案中，多于100个，例如多于80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130或者更多个)。
[0136]
在一些实施方案中，当可检测(例如荧光)查询探针靠近固体支持物的表面(例如在固体支持物的表面约100 nm内)时，该查询探针会产生荧光发射信号。当未结合时，查询探针快速地扩散且因此不单独被检测；因此，当处于未结合状态时，查询探针产生低水平的扩散背景荧光。结果，在一些实施方案中，结合的查询探针的检测包括使用全内反射荧光显微术(tirf)、hilo显微术(参见例如美国专利申请公开号20090084980、欧洲专利号2300983 b1、国际专利申请公开号wo 2014018584 a1和国际专利申请公开号wo2014018584 a1，其每一个通过参考结合至本文中)、共焦扫描显微术或包含照明方案的其他技术，所述照明方案仅照亮(例如激发)在固体支持物表面附近或上面的那些查询探针分子。因此，在一些实施方案中，只有与在表面附近或上面的固定的靶标结合的查询探针会产生可被证实为源于单个分子的点样发射信号(例如“斑点”)。
[0137]
在一些实施方案中，查询探针包含具有发射波长的荧光标记。在荧光标记的发射波长处的荧光发射的检测指示查询探针与固定的分析物结合。查询探针与分析物的结合为“结合事件”。在该技术的一些实施方案中，结合事件具有荧光发射，其具有大于限定阈值的测量强度。例如，在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)至少1、2、3、4或更多个标准差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)至少2个标准差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有为背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的平均荧光强度)至少1.5、2、3、4或5
倍的荧光强度。
[0138]
因此，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出荧光指示结合事件已经发生(例如在其中固定了分析物的固体支持物上的离散位置处)。此外，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出荧光指示结合事件已经开始。因此，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出不存在荧光指示结合事件已经结束(例如查询探针已经与分析物解离)。当结合事件开始时和当结合事件结束时之间的时间长度(例如在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的荧光探针的发射波长处检测出荧光的时间长度)为结合事件的停留时间。“转换”是指查询探针与分析物的结合和解离(例如开/关事件)，例如查询探针从结合状态解离或查询探针从未结合状态与分析物缔合。
[0139]
根据该技术的方法包括在为“采集时间”的确定时间间隔(例如数十至数百至数千秒，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或0分钟；例如1、1.5、2、2.5或3小时的时间间隔)期间，计数固体支持物上每个离散位置处(例如在通过x，y坐标确认的位置处)发生的查询探针结合事件的数量。在一些实施方案中，采集时间为约1-10秒至1-10分钟(例如约1-100秒，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如1-100分钟，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)。
[0140]
进一步地，查询探针在结合事件期间保持与分析物结合的时间长度为结合事件的“停留时间”。在采集时间期间检测到的结合事件的数量和/或对结合事件记录的停留时间的长度为与分析物结合的查询探针的特征，并且因此提供以下指示：分析物被固定于所述离散位置处，以及因此分析物存在于样品中。
[0141]
在确定时间间隔期间(例如在采集时间期间)，监测(例如使用光源来激发荧光探针并检测来自结合的查询探针的荧光发射，例如使用荧光显微镜)和/或记录查询探针与固定的分析物的结合和/或查询探针与固定的分析物的解离。确定在采集时间期间查询探针与分析物结合的次数和/或在每个结合事件期间查询探针保持与分析物结合的时间长度和在每个结合事件之间查询探针保持与分析物未结合的时间长度(例如分别处于结合和未结合状态的“停留时间”)，例如通过使用计算机和软件(例如使用隐马尔科夫模型和泊松统计学来分析数据)。
[0142]
在一些实施方案中，测量阳性和/或阴性对照样品(例如已知包含或不包含靶标的对照样品)。在阴性对照样品中检测到的荧光为“背景荧光”或“背景(荧光)强度”或“基线”。
[0143]
在一些实施方案中，将包含查询探针发射波长处荧光强度的测量的数据记录为时间的函数。参见图3a。在一些实施方案中，从数据确定(例如通过确定荧光强度高于阈值背景荧光强度的次数和时间长度)结合事件的数量和结合事件的停留时间(例如对于每种固定的分析物)。在一些实施方案中，对其中固定了分析物的固体支持物上的每个离散位置计数转换(例如一个或多个查询探针的结合和解离)。在一些实施方案中，使用转换的阈值数量将分析物在固体支持物上离散位置处的存在与背景信号、非分析物和/或查询探针的虚
假结合区分开。参见图3b和图3c。
[0144]
在一些实施方案中，确定每个固定靶标的转换次数的分布，例如对所观察的每个固定分析物计数转换次数。在一些实施方案中，产生直方图。在一些实施方案中，确定分布的特征参数，例如确定分布的平均值、中值、峰、形状等。在一些实施方案中，通过识别数据中的模式和规律的算法来分析数据和/或参数(例如荧光数据(例如时域中的荧光数据)、动力学数据、分布的特征参数等)，例如使用人工智能、模式识别、机器学习、统计推论、神经网络等。在一些实施方案中，分析包括频率分析的使用，并且在一些实施方案中，分析包括贝叶斯分析的使用。在一些实施方案中，使用已知的“训练”数据(例如使用监督学习)训练模式识别系统，和在一些实施方案中，使用算法来发现先前未知的模式(例如无监督学习)。参见例如duda等人(2001) pattern classification (第2版), wiley, new york；bishop (2006) pattern recognition and machine learning, springer。
[0145]
模式识别(例如使用训练集、监督学习、无监督学习和未知样品的分析)将所鉴定的模式与分析物相关联，使得特定模式提供可用于分析物的检测、量化和鉴定的特定分析物的“指纹”。
[0146]
在一些实施方案中，由分析物产生的分布与由非分析物产生的分布或在不存在分析物的情况下产生的分布显著不同。在一些实施方案中，对多个固定的分析物确定平均转换次数。在一些实施方案中，将对包含分析物的样品观察到的平均转换次数作为时间的函数近似线性地相关并且具有正斜率(例如平均转换次数作为时间的函数近似线性地增加)。
[0147]
在一些实施方案中，使用统计学(例如泊松统计学)来处理数据，以确定在固体支持物上每个离散位置处作为时间的函数发生的转换的概率。在一些特定实施方案中，在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的相对恒定的概率指示分析物在固体支持物上所述离散位置处的存在。在一些实施方案中，从在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的概率计算关联事件数量和消耗时间的相关系数。在一些实施方案中，当从在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的概率进行计算时，大于0.95的关联事件数量和消耗时间的相关系数指示分析物在固体支持物上所述离散位置处的存在。
[0148]
在一些实施方案中，使用结合的查询探针的停留时间(τ
on
)和未结合的查询探针的停留时间(τ
off
)来鉴定分析物在样品中的存在和/或将包含分析物的样品与包含非分析物和/或不包含分析物的样品区分开。例如，分析物的τ
on
大于非分析物的τ
on
；并且分析物的τ
off
小于非分析物的τ
off
。在一些实施方案中，测量阴性对照和样品的τ
on
和τ
off
指示分析物在样品中存在或不存在。在一些实施方案中，对在固体支持物上成像的多个斑点中的每一个，例如对对照(例如阳性和/或阴性对照)和疑似包含分析物的样品，确定多个τ
on
和τ
off
值。在一些实施方案中，对在固体支持物上成像的多个斑点中的每一个，例如对对照(例如阳性和/或阴性对照)和疑似包含分析物的样品，确定平均τ
on
和τ
off
。在一些实施方案中，所有成像的斑点的τ
on
相对于τ
off (例如平均τ
on
和τ
off
，按时间平均的τ
on
和τ
off
等)的图指示分析物在样品中存在或不存在。参见图3b和图3c。
[0149]
如本文描述的，该技术通过动力学检测技术检测分析物。因此，该技术的特定实施方案涉及通过分析查询探针与待检测的分析物的相互作用的动力学来检测分析物。对于查询探针q (例如在平衡浓度[q]下)与分析物t (例如在平衡浓度[t]下)的相互作用，动力学
速率常数k
on
描述包含与分析物t杂交的探针q的复合物qt的时间依赖性形成。在特定实施方案中，尽管qt复合物的形成与依赖于查询探针浓度且具有m-1
min-1
(或之类)的单位的二级速率常数有关，但是qt复合物的形成通过k
on
充分进行描述，所述k
on
为与qt复合物的形成相关的假一阶速率常数。因此，如本文使用的，k
on
为表观(“假”)一阶速率常数。
[0150]
同样地，动力学速率常数k
off
描述复合物qt向探针q和分析物t的时间依赖性解离。动力学速率一般在本文中以min-1
或s-1
的单位提供。处于结合状态的查询探针q的“停留时间”(τ
on
)为在查询探针q与分析物t结合以形成qt复合物的每种情况期间，探针q与分析物t杂交的时间间隔(例如时间长度)。处于未结合状态的查询探针q的“停留时间”(τ
off
)为在查询探针q与分析物结合以形成qt复合物的每种情况之间，探针q不与分析物t杂交的时间间隔(例如时间长度) (例如在查询探针q与分析物t的连续结合事件之间，查询探针q与分析物t解离的时间)。可将停留时间提供为对许多结合和非结合事件积分的平均值或加权平均值。
[0151]
进一步地，在一些实施方案中，将探针(例如被可检测地标记的查询探针(例如荧光探针))与分析物的重复随机结合建模为每单位时间以恒定概率发生的泊松过程，并且其中每单位时间的结合和解离事件的数量的标准差(n
b d
)增加为(n
b d
)
1/2
。因此，统计噪声随着观察时间增加而变为n
b d
的较小分数。因此，在一些实施方案中，根据需要延长观察以实现靶标和脱靶结合之间的区分。并且，随着采集时间增加，n
b d
直方图中的信号和背景峰变得越来越分离，且信号分布的宽度随着n
b d
的平方根而增加，这与动力学蒙特卡罗模拟一致。
[0152]
进一步地，在一些实施方案中，控制测定条件来调整动力学行为，以改进查询探针与分析物的结合事件和背景结合的区别。例如，在一些实施方案中，该技术包括控制测定条件，比如使用被设计为与分析物弱相互作用(例如在纳摩尔亲和力范围内)的查询探针；控制温度使得查询探针与分析物弱相互作用；控制溶液条件，例如离子强度、离子组成、有机化合物的存在、离液剂的添加和竞争探针的添加。
[0153]
一些实施方案提供通过重复性查询探针结合来鉴定分析物的方法。在一些实施方案中，方法包括将分析物固定于固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物为表面(例如基本上平坦的表面、圆形表面)，例如与主体溶液(例如包含分析物的主体溶液)接触的表面。在一些实施方案中，固体支持物为可自由扩散的固体支持物(例如珠粒、胶体颗粒，例如直径为约10-1000 nm (例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 nm)的胶体颗粒)，例如在主体溶液(例如包含分析物的主体溶液)内自由扩散的固体支持物。在一些实施方案中，将分析物固定于固体支持物包括固体支持物和分析物之间的共价相互作用。在一些实施方案中，将分析物固定于固体支持物包括固体支持物和分析物之间的非共价相互作用。在一些实施方案中，分析物(例如分子，例如分子比如蛋白、肽、核酸、小分子、脂质、代谢物、药物等)稳定地固定于表面，并且方法包括查询探针与分析物的重复性(例如瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括检测查询探针与分析物的重复性(例如瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括产生包含由查询探针与分析物的结合产生的信号的数据集(例如作为时间函数的查询探针信号的数据集)和描述查询探针与分析物的结合在表面上的空间位置的信息(例如坐标，例如x，y坐标)。在一些实施方案中，将数据集
进行处理(例如操纵、转换、可视化等)，例如以改进查询探针结合事件的空间分辨率。例如，在一些实施方案中，数据集(例如包含作为时间函数的查询探针信号和描述查询探针与分析物的结合在表面上的空间位置的信息(例如坐标，例如x，y坐标))经受处理。在一些实施方案中，处理包括逐帧减法处理以产生差分强度分布图，其显示时间序列数据的每一帧内的查询探针结合或解离事件。在开发本文描述的技术期间收集的数据指示差分强度分布图比查询探针结合信号相对于位置图具有更高的分辨率。在一些实施方案中，在确定每个查询探针结合和/或解离事件的空间位置(例如x，y坐标)之后，多个事件根据空间位置簇集，并且每个簇内事件的动力学经受统计学分析以确定事件簇是否源于给定分析物。
[0154]
例如，用于量化一种或多种表面固定的或扩散性的分析物的方法的一些实施方案包括一个或多个步骤，其包括例如以单分子灵敏度测量一种或多种与一种或多种固定分析物瞬时结合的查询探针的信号。在一些实施方案中，方法包括不依赖于查询探针结合来跟踪分析物(例如检测和/或记录其位置)。在一些实施方案中，该方法进一步包括计算作为位置(例如x，y位置)的函数的在表面处的时间依赖性探针结合信号强度变化。在一些实施方案中，计算作为位置(例如x，y位置)的函数的在表面处的时间依赖性查询探针结合信号强度变化产生对于查询探针与分析物的结合的“差分强度分布图”。在一些实施方案中，方法包括以亚像素准确度从差分强度分布图确定每个查询探针结合和解离事件(“事件”)的位置(例如x，y位置)。在一些实施方案中，方法包括按表面上的位置(例如x，y位置)将事件分组成局部簇，例如以对单个固定的分析物关联事件。在一些实施方案中，方法包括从每个事件局部簇计算动力学参数，以确定该簇是否源于特定分析物，例如源于与特定分析物的瞬时探针结合。
[0155]
方法的实施方案在所检测的分析物方面不受限制。例如，在一些实施方案中分析物为多肽，例如蛋白或肽。在一些实施方案中，分析物为核酸。在一些实施方案中，分析物为小分子。
[0156]
在一些实施方案中，分析物和查询探针之间的相互作用明显地受到分析物的共价修饰的影响。例如，在一些实施方案中，分析物为包含翻译后修饰的多肽，例如包含翻译后修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，多肽的翻译后修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为多肽上翻译后修饰存在或不存在的函数。例如，在一些实施方案中，分析物为包含表观遗传修饰的核酸，例如包含甲基化碱基的核酸。在一些实施方案中，分析物为包含对分析物的核碱基、核糖或脱氧核糖部分的共价修饰的核酸。
[0157]
在一些实施方案中，核酸的修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为核酸上修饰存在或不存在的函数。在一些实施方案中，翻译后修饰和查询探针之间的瞬时相互作用通过化学亲和标签(例如包含核酸的化学亲和标签)介导。
[0158]
在一些实施方案中，查询探针为核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，查询探针为dna结合蛋白、rna结合蛋白或dna结合的核糖核蛋白复合物。
[0159]
在一些实施方案中，每个结合或解离事件的位置，例如(x，y)位置，通过使差分强度分布图经受形心确定、对高斯函数的最小二乘拟合、对艾里斑函数的最小二乘拟合、对多项式函数(例如抛物线)的最小二乘拟合或最大似然估计来确定。
[0160]
在一些实施方案中，捕获探针为高亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施
方案中，捕获探针为核酸。在一些实施方案中，捕获通过将分析物与表面和/或与表面结合的捕获探针交联的共价键介导。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的情况下经受热变性。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的的情况下经受化学变性，例如分析物用诸如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高ph、低ph或十二烷基硫酸钠(sds)等变性剂进行变性。
[0161]
分析物该技术不限于被检测、量化、鉴定或以其他方式表征(例如存在、不存在、量、浓度、状态)的分析物。如本文使用的，术语“分析物”为广泛的术语，并且以其普通含义使用，非限制性地包括，以指涉诸如可分析的生物流体(例如血液、间质液、脑脊液、淋巴液或尿液)等样品中的物质或化学成分。分析物可包括天然存在的物质、人工物质、代谢物和/或反应产物。在一些实施方案中，分析物包含盐、糖、蛋白、脂肪、维生素或激素。在一些实施方案中，分析物天然存在于生物样品中(例如为“内源性的”)；例如，在一些实施方案中，分析物为代谢产物、激素、抗原、抗体等。或者，在一些实施方案中，分析物被引入到生物有机体中(例如为“外源性的”)，例如药物、药物代谢物、药物前体(例如前药)、成像用造影剂、放射性同位素、化学试剂等。药物的代谢产物和药用组合物也为考虑的分析物。
[0162]
在一些实施方案中，分析物为多肽、核酸、小分子、脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂、有机分子、无机分子、辅因子、药物、生物活性剂、细胞、组织、生物体等。在一些实施方案中，分析物包含多肽、核酸、小分子、脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂、有机分子、无机分子、辅因子、药物、生物活性剂、细胞、组织、生物体等。在一些实施方案中，分析物包含多肽、核酸、小分子、脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂、有机分子、无机分子、辅因子、药物、生物活性剂、细胞、组织、生物体等中的一种或多种的组合。
[0163]
在一些实施方案中，分析物为多分子复合物的一部分，例如多蛋白复合物、核酸/蛋白复合物、分子机器、细胞器(例如无细胞线粒体(例如在血浆中)；质体；高尔基体、内质网、液泡、过氧化物酶体、溶酶体和/或细胞核)、细胞、病毒颗粒、组织、生物体或任何可捕获且适合于通过本文所述技术进行分析的大分子复合物或结构或其他实体(例如核糖体、剪接体、穹窿体、蛋白酶体、dna聚合酶iii全酶、rna聚合酶ii全酶、对称病毒衣壳、groel/groes；膜蛋白复合物：光合系统i、atp合酶、核小体、中心粒和微管组织中心(mtoc)、细胞骨架、鞭毛、核仁、应激颗粒、生殖细胞颗粒或神经元运输颗粒)。例如，在一些实施方案中，多分子复合物为分离的，并且该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测与该多分子复合物相关(例如为该多分子复合物的组分)的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，细胞外囊泡为分离的，并且该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测与囊泡相关的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测蛋白(例如表面蛋白)和/或存在于囊泡内的分析物，例如蛋白、核酸或本文所述的其他分析物。在一些实施方案中，囊泡在分析之前进行固定和透化。在一些实施方案中，蛋白为抗原和/或包含抗原，并且测定包括使用包含抗体的查询探针和/或包含抗体的捕获探针。该技术可用于检测广泛种类的蛋白分析物(例如抗原)。参见图6。
[0164]
在一些实施方案中，分析物经化学修饰以提供用于查询探针结合的位点。例如，在一些实施方案中，磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸在强碱性条件下的β-消除被用于引入烯烃，然
后是诸如二硫醇等亲核试剂michael加成至烯烃。然后将剩余的游离硫醇用于缀合于与寡核苷酸查询探针具有互补序列的含有马来酰亚胺的寡核苷酸。磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸的翻译后修饰然后可如本文所述使用查询探针探测和分析。
[0165]
如本文使用的，术语“检测分析物”或“检测物质”应理解为包括直接检测分析物本身或间接检测分析物(例如通过检测副产物)。
[0166]
捕获该技术的实施方案包括捕获分析物。在一些实施方案中，分析物被捕获和固定。在一些实施方案中，分析物稳定地附接于固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物相对于接触固体支持物的主体液相为固定的。在一些实施方案中，固体支持物在接触固体支持物的主体液相内为可扩散的。
[0167]
该技术在捕获探针方面不受限制。在一些实施方案中，捕获探针为抗体(例如单克隆抗体)或抗体片段。在一些实施方案中，捕获探针为已被设计以增加对分析物的亲和力的抗体抗体或片段。在一些实施方案中，捕获探针为纳米抗体、dna结合蛋白或蛋白结构域、甲基化结合结构域(mbd)、激酶、磷酸酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、酶或多肽。在一些实施方案中，捕获探针为与分析物相互作用的寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获探针为药剂，例如药物或其他生物活性分子。在一些实施方案中，捕获探针为金属离子复合物。在一些实施方案中，捕获探针为甲基结合结构域(例如mbd1)。在一些实施方案中，捕获探针用如本文描述的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，捕获探针与可检测标记共价连接。在一些实施方案中，捕获探针与可检测标记间接和/或非共价连接和/或缔合。在一些实施方案中，可检测标记为荧光的。
[0168]
在一些实施方案中，捕获探针为抗体(例如单克隆抗体)或抗体片段。在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，捕获探针包含碳水化合物结合蛋白，比如凝集素或碳水化合物结合抗体。
[0169]
在一些实施方案中，分析物与表面或其他固体基质的稳定附接通过高亲和力或不可逆相互作用来提供(例如如本文使用的，“不可逆相互作用”是指具有长于观察时间的解离半衰期的相互作用，例如在一些实施方案中，时间为1-5分钟(例如60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600秒或更长))。该技术在用于捕获分析物的组分和/或方法方面不受限制。例如，稳定附接通过多种方法提供，所述方法包括但不限于以下一种或多种。
[0170]
在一些实施方案中，分析物通过表面结合捕获探针进行固定，所述探针具有对分析物小于约1纳摩尔(nm) (例如小于1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5纳摩尔)的解离常数(kd)和对分析物小于约1 min-1 (例如小于约1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 min-1
)的解离速率常数。示例性的表面结合捕获探针包括例如抗体、抗体片段、纳米抗体或其他蛋白；高亲和力dna结合蛋白或核糖核蛋白复合物，比如cas9、dcas9、cpf1、转录因子或转录激活因子样效应核酸酶(talen)；寡核苷酸；小有机分子；或金属离子复合物。
[0171]
在一些实施方案中，分析物通过直接非共价附接于表面(例如通过分析物和表面
之间的相互作用，所述表面例如玻璃表面或尼龙、硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯膜)进行固定。
[0172]
在一些实施方案中，分析物通过分析物与固体支持物的化学连接(例如通过共价键)进行固定。在一些实施方案中，分析物通过例如碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、马来酰亚胺、卤代乙酰基、酰肼或烷氧基胺而与固体支持物化学连接。在一些实施方案中，分析物通过分析物与表面和/或附接于表面的捕获探针的辐射(例如紫外光)诱导的交联来进行固定。在一些实施方案中，捕获探针为单克隆抗体。在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，捕获探针包含碳水化合物结合蛋白，例如凝集素或碳水化合物结合抗体。
[0173]
在一些实施方案中，该技术包括形成一个或多个共价键以将分析物与表面固定的捕获探针交联，从而防止分析物在测量之前或期间与表面解离。该技术不限于被用于在分析物和捕获探针之间产生交联的化学。例如，将分析物-捕获探针复合物与反应性化学物质一起温育的实施方案，所述反应性化学物质比如nhs酯衍生物(例如酒石酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯或戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、亚氨酸酯衍生物(例如庚二亚氨酸二甲酯、辛二亚氨酸二甲酯)、卤代乙酰基衍生物(例如碘乙酸琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚胺衍生物(例如4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)或碳二亚胺衍生物(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)；或通过用uv光辐照分析物-捕获探针复合物。在将分析物与表面固定的捕获探针交联之后，捕获的分析物通过simreps检测。
[0174]
或者，一些实施方案不是将分析物固定于相对于如上所述接触固体支持物的主体相相对静止的固体支持物，而是提供分析物与自由扩散颗粒的缔合，所述自由扩散颗粒在接触自由扩散颗粒的主体流体相内扩散。因此，在一些实施方案中，分析物与自由扩散的基质共价或非共价结合。在一些实施方案中，自由扩散的基质为例如胶体颗粒(例如直径为约10-1000 nm (例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 nm)的颗粒)。在一些实施方案中，自由扩散的基质包含例如聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、金或dna折纸，和/或由其构成。在一些实施方案中，分析物与相对于查询探针的扩散缓慢扩散的自由扩散的颗粒缔合，例如分析物的扩散系数为小于查询探针的扩散系数的约10% (例如小于15、14、13、12、11、10.5、10.4、10.3、10.2、10.1、10.0、9.9、9.8、9.7、9.6、9.5或9.0%或更少)。
[0175]
此外，在一些实施方案中，分析物与自由扩散颗粒缔合，且分析物的位置独立于观察和/或记录查询探针结合为可观察和/或可记录的。例如，在一些实施方案中，可检测标记(例如荧光团、荧光蛋白、量子点)共价或非共价地附接于分析物，例如用于检测和定位分析物。因此，在一些实施方案中，同时且独立地测量分析物的位置和查询探针结合事件的位置。
[0176]
在一些实施方案中，通过使用包含捕获探针的纳米颗粒捕获分析物并在表面处收集(例如固定)包含捕获的分析物的颗粒用于随后的simreps分析，使分析物与表面缔合。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5-约200纳米的直径，并且通过向包含纳米颗粒的组合物施加力(例如磁性的、惯性的(例如离心的)、电的)在表面处进行收集(例如固定)。
[0177]
查询该技术的实施方案包含与分析物瞬时和重复地结合的查询探针(例如被可检测地
标记的查询探针)，例如每观察窗口与分析物结合和解离数次(例如大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)的查询探针。在一些实施方案中，在测定条件下查询探针对于分析物具有大于约1纳摩尔(例如大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0或更大纳摩尔)的解离常数(kd)。在一些实施方案中，查询探针对于分析物具有大于约1 min-1 (例如大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0或更大min-1
)的结合和/或解离常数。
[0178]
该技术在查询探针方面不受限制。在一些实施方案中，查询探针为抗体或抗体片段。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体或抗体片段。在一些实施方案中，查询探针为经设计以具有降低的亲和力的抗体。在一些实施方案中，查询探针为纳米抗体、dna结合蛋白或蛋白结构域、甲基化结合结构域(mbd)、激酶、磷酸酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、酶或多肽。在一些实施方案中，查询探针为与分析物相互作用的寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，查询探针为与分析物杂交以形成双链体(其具有在进行观察的温度的约10℃内的解链温度)的寡核苷酸(例如对于在室温下进行的观察为约7-12个核苷酸)。在一些实施方案中，查询探针为单核苷酸。在一些实施方案中，查询探针为小有机分子(例如分子量小于约2000道尔顿，例如小于2100、2050、2000、1950、1900、1850、1800、1750、1700、1650、1600、1550、1500道尔顿或更小的分子)。在一些实施方案中，查询探针为药用物质，例如药物或其他生物活性分子。在一些实施方案中，查询探针为金属离子复合物。在一些实施方案中，查询探针为甲基结合结构域(例如mbd1)。在一些实施方案中，查询探针用如本文所述的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，查询探针共价连接于可检测标记。在一些实施方案中，查询探针与可检测标记间接和/或非共价地连接和/或缔合。在一些实施方案中，可检测标记为荧光的。
[0179]
在一些实施方案中，查询探针为抗体(例如单克隆抗体)或抗体片段。
[0180]
在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，查询探针包含碳水化合物结合蛋白，比如凝集素或碳水化合物结合抗体。
[0181]
在一些实施方案中，该技术涉及使用以两种或更多种不同标记(例如荧光团)标记的查询探针来检测分析物的存在、不存在和/或数量的simreps的用途。在一些实施方案中，该技术包括使用对相同分析物具有特异性并且包含两种或更多种不同标记的两种或更多种查询探针。
[0182]
在一些实施方案中，两种或更多种查询探针包括包含第一标记的第一查询探针和包含第二标记的第二查询探针(以及任选地，分别包含第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十等标记的第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十等查询探针)。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针不同的查询探针(例如组合物包含含有不同标记的不同查询探针)。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针相同的查询探针(例如查询探针分子的第一部分包含第一标记和查询探针分子的第二部分包含第二标记)。在一些实施方案中，第一标记和第二标记为fret对。在一些实施方案中，该技术包括检测由两种或更多种标记产生的共定位信号和/或检测两个标记之间的fret。
[0183]
检测该技术例如在存在类似分析物的情况下，和在一些实施方案中在存在背景噪声的情况下，提供分析物的检测。在一些实施方案中，源于查询探针与分析物的瞬时结合的信号可区别于由未结合查询探针产生的信号(例如通过观察、监测和/或记录结合事件期间信号强度的局部变化)。在一些实施方案中，观察查询探针(例如荧光标记的查询探针)与分析物的瞬时结合通过诸如全内反射荧光(tirf)或近-tirf显微术、零模波导(zmw)、光片显微术、受激发射损耗(sted)显微术或共焦显微术等技术提供。在一些实施方案中，本文提供的技术使用查询探针，其具有当未结合于分析物时淬灭的荧光发射和/或当结合于分析物时去淬灭的荧光发射。
[0184]
该技术包括在所观察的面积的离散区域和/或体积的离散区域内，例如在平面或体积的特定空间坐标处，定位和/或观察查询探针与分析物的瞬时结合。在一些实施方案中，相对于固定的(例如表面结合的)分析物之间的平均间隔，在确定结合或解离事件的空间坐标方面的误差(例如由于有限的信号、检测器噪声或检测器中的空间分箱)是小的(例如被最小化、消除)。在包括使用宽视野荧光显微术的一些实施方案中，通过在样本平面中使用有效检测器像素尺寸来最小化和/或消除测量误差，所述尺寸不大于固定的(例如表面结合的)分析物之间的平均距离，且每个检测时间点收集许多荧光光子(在一些实施方案中，多于100个，例如多于80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130或者更多个)。
[0185]
在一些实施方案中，当可检测(例如荧光)查询探针靠近固体支持物的表面(例如在固体支持物的表面约100 nm内)时，该查询探针会产生荧光发射信号。当未结合时，查询探针快速地扩散且因此不单独被检测；因此，当处于未结合状态时，查询探针产生低水平的扩散背景荧光。结果，在一些实施方案中，结合的查询探针的检测包括使用全内反射荧光显微术(tirf)、hilo显微术(参见例如美国专利申请公开号20090084980、欧洲专利号2300983 b1、国际专利申请公开号wo 2014018584 a1和国际专利申请公开号wo 2014018584 a1，其每一个通过参考结合至本文中)、共焦扫描显微术或包含照明方案的其他技术，所述照明方案仅照亮(例如激发)在固体支持物表面附近或上面的那些查询探针分子。因此，在一些实施方案中，只有与在表面附近或上面的固定的靶标结合的查询探针会产生可被证实为源于单个分子的点样发射信号(例如“斑点”)。
[0186]
在一些实施方案中，查询探针包含具有发射波长的荧光标记。在荧光标记的发射波长处的荧光发射的检测指示查询探针与固定的分析物结合。查询探针与分析物的结合为“结合事件”。在该技术的一些实施方案中，结合事件具有荧光发射，其具有大于限定阈值的测量强度。例如，在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)至少1、2、3、4或更多个标准差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)至少2个标准差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有为背景荧光强度(例如在不存在分析物的情况下观察到的平均荧光强度)至少1.5、2、3、4或5倍的荧光强度。
[0187]
因此，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出荧光指示结合事件已经发生(例如在其中固定
了分析物的固体支持物上的离散位置处)。此外，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出荧光指示结合事件已经开始。因此，在一些实施方案中，在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的查询探针的发射波长处检测出不存在荧光指示结合事件已经结束(例如查询探针已经与分析物解离)。当结合事件开始时和当结合事件结束时之间的时间长度(例如在具有高于限定阈值的强度(例如比背景强度高至少2个标准差)的荧光探针的发射波长处检测出荧光的时间长度)为结合事件的停留时间。“转换”是指查询探针与分析物的结合和解离(例如开/关事件)，例如查询探针从结合状态解离或查询探针从未结合状态与分析物缔合。
[0188]
根据该技术的方法包括在为“采集时间”的确定时间间隔(例如数十至数百至数千秒，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或0分钟；例如1、1.5、2、2.5或3小时的时间间隔)期间，计数固体支持物上每个离散位置处(例如在通过x，y坐标确认的位置处)发生的查询探针结合事件的数量。在一些实施方案中，采集时间为约1-10秒至1-10分钟(例如约1-100秒，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如1-100分钟，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)。
[0189]
进一步地，查询探针在结合事件期间保持与分析物结合的时间长度为结合事件的“停留时间”。在采集时间期间检测到的结合事件的数量和/或对结合事件记录的停留时间的长度为与分析物结合的查询探针的特征，并且因此提供以下指示：分析物被固定于所述离散位置处，以及因此分析物存在于样品中。
[0190]
在确定时间间隔期间(例如在采集时间期间)，监测(例如使用光源来激发荧光探针并检测来自结合的查询探针的荧光发射，例如使用荧光显微镜)和/或记录查询探针与固定的分析物的结合和/或查询探针与固定的分析物的解离。确定在采集时间期间查询探针与分析物结合的次数和/或在每个结合事件期间查询探针保持与分析物结合的时间长度和在每个结合事件之间查询探针保持与分析物未结合的时间长度(例如分别处于结合和未结合状态的“停留时间”)，例如通过使用计算机和软件(例如使用隐马尔科夫模型和泊松统计学来分析数据)。
[0191]
在一些实施方案中，测量阳性和/或阴性对照样品(例如已知包含或不包含靶标的对照样品)。在阴性对照样品中检测到的荧光为“背景荧光”或“背景(荧光)强度”或“基线”。
[0192]
在一些实施方案中，将包含查询探针发射波长处荧光强度的测量的数据记录为时间的函数。在一些实施方案中，从数据确定(例如通过确定荧光强度高于阈值背景荧光强度的次数和时间长度)结合事件的数量和结合事件的停留时间(例如对于每种固定的分析物)。在一些实施方案中，对其中固定了分析物的固体支持物上的每个离散位置计数转换(例如查询探针的结合和解离)。在一些实施方案中，使用转换的阈值数量将分析物在固体支持物上离散位置处的存在与背景信号、非分析物和/或查询探针的虚假结合区分开。
[0193]
在一些实施方案中，确定每个固定靶标的转换次数的分布，例如对所观察的每个固定分析物计数转换次数。在一些实施方案中，产生直方图。在一些实施方案中，确定分布的特征参数，例如确定分布的平均值、中值、峰、形状等。在一些实施方案中，通过识别数据
中的模式和规律的算法来分析数据和/或参数(例如荧光数据(例如时域中的荧光数据)、动力学数据、分布的特征参数等)，例如使用人工智能、模式识别、机器学习、统计推论、神经网络等。在一些实施方案中，分析包括频率分析的使用，并且在一些实施方案中，分析包括贝叶斯分析的使用。在一些实施方案中，使用已知的“训练”数据(例如使用监督学习)训练模式识别系统，和在一些实施方案中，使用算法来发现先前未知的模式(例如无监督学习)。参见例如duda等人(2001) pattern classification (第2版), wiley, new york；和bishop (2006) pattern recognition and machine learning, springer。
[0194]
模式识别(例如使用训练集、监督学习、无监督学习和未知样品的分析)将所鉴定的模式与分析物相关联，使得特定模式提供可用于分析物的检测、量化和鉴定的特定分析物的“指纹”。
[0195]
在一些实施方案中，由分析物产生的分布与由非分析物产生的分布或在不存在分析物的情况下产生的分布显著不同。在一些实施方案中，对多个固定的分析物确定平均转换次数。在一些实施方案中，将对包含分析物的样品观察到的平均转换次数作为时间的函数近似线性地相关并且具有正斜率(例如平均转换次数作为时间的函数近似线性地增加)。
[0196]
在一些实施方案中，使用统计学(例如泊松统计学)来处理数据，以确定在固体支持物上每个离散位置处作为时间的函数发生的转换的概率。在一些特定实施方案中，在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的相对恒定的概率指示分析物在固体支持物上所述离散位置处的存在。在一些实施方案中，从在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的概率计算关联事件数量和消耗时间的相关系数。在一些实施方案中，当从在固体支持物上离散位置处作为时间的函数发生的转换事件的概率进行计算时，大于0.95的关联事件数量和消耗时间的相关系数指示分析物在固体支持物上所述离散位置处的存在。
[0197]
在一些实施方案中，使用结合的查询探针的停留时间(τ
on
)和未结合的查询探针的停留时间(τ
off
)来鉴定分析物在样品中的存在和/或将包含分析物的样品与包含非分析物和/或不包含分析物的样品区分开。例如，分析物的τ
on
大于非分析物的τ
on
；并且分析物的τ
off
小于非分析物的τ
off
。在一些实施方案中，测量阴性对照和样品的τ
on
和τ
off
指示分析物在样品中存在或不存在。在一些实施方案中，对在固体支持物上成像的多个斑点中的每一个，例如对对照(例如阳性和/或阴性对照)和疑似包含分析物的样品，确定多个τ
on
和τ
off
值。在一些实施方案中，对在固体支持物上成像的多个斑点中的每一个，例如对对照(例如阳性和/或阴性对照)和疑似包含分析物的样品，确定平均τ
on
和τ
off
。在一些实施方案中，所有成像的斑点的τ
on
相对于τ
off (例如平均τ
on
和τ
off
，按时间平均的τ
on
和τ
off
等)的图指示分析物在样品中存在或不存在。
[0198]
在一些实施方案中，该技术涉及使用simreps测定条件，所述条件被提供以调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的缔合和/或调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物解离。在一些实施方案中，调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的缔合和/或调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的解离导致调节(例如增加和/或减少)测定时间(例如收集指示查询探针与分析物瞬时相互作用的动力学活性的信号所需的时间)。在特定实施方案中，通过增加查询探针与分析物缔合的速率和/或增加查询探针与分析物解离的速率来减少测定时间。进行调节以减少测定时间的示例性的测定条件包括例如
增加测定温度(例如至高于室温的温度(例如至30℃或以上(例如至30-37℃ (例如30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5或37.0)、至33-37 (例如33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0)或至高于37℃)))；通过增加盐浓度(例如将盐从约150 mm钠离子增加至约600 mm钠离子)；和/或通过增加有机溶剂的浓度。在一些实施方案中，调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的缔合和/或调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的解离使测定时间减少超过50% (例如50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%)。
[0199]
在一些实施方案中，该技术检测组合物(例如样品)中浓度为约1 am或更高(例如约1-10 am (例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0 am)、约10-100 am (例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 am)或约100-1000 am (例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000 am)的分析物。
[0200]
在一些实施方案中，该技术检测组合物(例如样品)中浓度为约1 fm或更高(例如约1-10 fm (例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0 fm)、约10-100 fm (例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 fm)或约100-1000 fm (例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、
810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000 fm)的分析物。
[0201]
在一些实施方案中，该技术检测组合物(例如样品)中浓度为约1 pm或更高(例如约1-10 pm (例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0 pm)、约10-100 pm (例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 pm)或约100-1000 pm (例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000 pm)的分析物。
[0202]
例如，在一些实施方案中，该技术检测浓度为约50 am-约50 pm的蛋白和/或核酸分析物(例如在一些实施方案中，该技术具有约50 am-约50 pm的检测下限)。在一些实施方案中，该技术检测浓度为至少10-20 am的蛋白和/或核酸分析物，例如使用如本文所述技术的实施方案(例如包括使用微流体装置，纳米颗粒，和/或分析物与捕获探针和/或成像表面的不可逆连接)，其提供至少50%-约100%的分析物捕获效率(例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%的捕获效率)。也就是说，在一些实施方案中，如本文描述的技术(例如包括使用微流体装置、纳米颗粒和/或分析物与捕获探针和/或成像表面的不可逆连接)提供至少50%-约100%的分析物捕获效率(例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%的捕获效率)，并因此提供约10-20 am (例如10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0 am)的检测下限。参见例如chang (2012)
ꢀ“
single molecule enzyme-linked immunosorbent assays: theoretical considerations
”ꢀ
j. immunological methods 378: 102-115，其通过参考结合至本文中。在一些实施方案中，分析物的捕获效率为至少50%-约100% (例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%的捕获效率)，并且捕获表面的至少50%-约100% (例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%)被成像，这一起提供约0.05 am-约5 am
的蛋白和/或核酸的检测下限(例如0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、2.00、2.05、2.10、2.15、2.20、2.25、2.30、2.35、2.40、2.45、2.50、2.55、2.60、2.65、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、2.95、3.00、3.05、3.10、3.15、3.20、3.25、3.30、3.35、3.40、3.45、3.50、3.55、3.60、3.65、3.70、3.75、3.80、3.85、3.90、3.95、4.00、4.05、4.10、4.15、4.20、4.25、4.30、4.35、4.40、4.45、4.50、4.55、4.60、4.65、4.70、4.75、4.80、4.85、4.90、4.95或5.00 am的检测下限)。使用检测下限描述的技术的能力表明该技术检测以至少为检测下限的浓度存在的分析物，并且因此，该技术检测以高于检测下限的浓度存在的分析物。
[0203]
荧光部分在一些实施方案中，查询探针和/或分析物包含荧光部分(例如荧光染料，也被称为“荧光团”或“荧光体”)。广泛种类的荧光部分为本领域已知的，并且已知用于将荧光部分连接于分析物和/或查询探针的方法。
[0204]
可被用作荧光部分的化合物的实例包括但不限于呫吨、蒽、花青、卟啉和香豆素染料。可用于本技术的呫吨染料的实例包括但不限于荧光素、6-羧基荧光素(6-fam)、5-羧基荧光素(5-fam)、5-或6-羧基-4,7,2’,7
’‑
四氯荧光素(tet)、5-或6-羧基-4
’5’2’4’5’7’
六氯荧光素(hex)、5
’‑
或6
’‑
羧基-4’,5
’‑
二氯-2’,7
’‑
二甲氧基荧光素(joe)、5-羧基-2’,4’,5’,7
’‑
四氯荧光素(zoe)、对甲氨基酚、罗丹明、四甲基罗丹明(tamra)、4 ,7-二氯四甲基罗丹明(dtamra)、罗丹明x (rox)和德克萨斯红。可用于本发明的花青染料的实例包括但不限于cy 3、cy 3b、cy 3.5、cy 5、cy 5.5、cy 7和cy 7.5。可用于本技术的其他荧光部分和/或染料包括但不限于能量转移染料、复合染料和给出荧光信号的其他芳族化合物。在一些实施方案中，荧光部分包含量子点或聚合物点和聚合染料。
[0205]
在一些实施方案中，荧光部分包含荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(gfp)、经修饰的gfp的衍生物(例如包含s65t的gfp、增强型gfp (例如包含f64l))或本领域已知的其他荧光蛋白，比如蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、蓝铜矿、mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、天蓝(cerulean)、cypet、mturquoise2)和黄色荧光蛋白衍生物(例如yfp、柠檬黄、venus、ypet)。实施方案提供荧光蛋白可共价或非共价地键合于一种或多种查询探针、分析物和/或捕获探针。
[0206]
荧光染料非限制性地包括d-罗丹明受体染料，包括cy5、二氯[r110]、二氯[r6g]、二氯[tamra]、二氯[rox]等；荧光素供体染料，包括荧光素、6-fam、5-fam等；吖啶，包括吖啶橙、吖啶黄、原黄素，ph 7等；芳烃，包括2-甲基苯并噁唑、对二甲氨基苯甲酸乙酯、苯酚、吡咯、苯、甲苯等；芳基甲川型染料，包括金胺o、结晶紫、结晶紫-甘油、孔雀绿等；香豆素染料，包括7-甲氧基香豆素-4-乙酸、香豆素1、香豆素30、香豆素314、香豆素343、香豆素6等；花青染料，包括1,1
’‑
二乙基-2,2
’‑
碘化花青、隐花青、吲哚羰花青(c3)染料、吲哚二羰花青(c5)染料、吲哚三羰花青(c7)染料、氧杂羰花青(c3)染料、氧杂二羰花青(c5)染料、氧杂三羰花青(c7)染料、碘化频哪氰醇、全染色剂、硫杂羰花青(c3)染料-乙醇、硫杂羰花青(c3)染料-正丙醇、硫杂二羰花青(c5)染料、硫杂三羰花青(c7)染料等；二吡咯甲烯染料，包括n,n
’‑
二氟硼基-1,9-二甲基-5-(4-碘苯基)-二吡咯甲烯、n,n
’‑
二氟硼基-1,9-二甲基-5-[(4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)、n,n
’‑
二氟硼基-1,9-二甲基-5-苯基二吡咯甲烯等；部花青类，包
594、atto rho13、atto 610、atto 620、atto rho14、atto 633、atto 647、atto 647n、atto 655、atto oxa12、atto 665、atto 680、atto 700、atto 725、atto740)。
[0209]
本领域的普通技术人员应当认识到，也可使用具有在这些范围之外的发射最大值的染料。在一些情况下，500 nm-700 nm之间范围内的染料具有处于可见光谱内的优势，并且可使用现有的光电倍增管进行检测。在一些实施方案中，广泛范围的可用染料使得能够选择具有分布在整个检测范围内的发射波长的染料组。能够区分许多染料的检测系统为本领域已知的。
[0210]
方法一些实施方案提供通过重复性查询探针结合来鉴定分析物的方法。在一些实施方案中，方法包括将分析物固定于固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物为表面(例如基本上平坦的表面、圆形表面)，例如与主体溶液(例如包含分析物的主体溶液)接触的表面。在一些实施方案中，固体支持物为可自由扩散的固体支持物(例如珠粒、胶体颗粒，例如直径为约10-1000 nm (例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 nm)的胶体颗粒)，例如在主体溶液(例如包含分析物的主体溶液)内自由扩散的固体支持物。在一些实施方案中，将分析物固定于固体支持物包括固体支持物和分析物之间的共价相互作用。在一些实施方案中，将分析物固定于固体支持物包括固体支持物和分析物之间的非共价相互作用。在一些实施方案中，分析物(例如分子，例如分子比如蛋白、肽、核酸、小分子、脂质、代谢物、药物等)稳定地固定于表面，并且方法包括查询探针与分析物的重复性(例如瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括检测查询探针与分析物的重复性(例如瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括产生包含由查询探针与分析物的结合产生的信号的数据集(例如作为时间函数的查询探针信号的数据集)和描述查询探针与分析物的结合在表面上的空间位置的信息(例如坐标，例如x，y坐标)。在一些实施方案中，将数据集进行处理(例如操纵、转换、可视化等)，例如以改进查询探针结合事件的空间分辨率。例如，在特定实施方案中，数据集(例如包含作为时间函数的查询探针信号和描述查询探针与分析物的结合在表面上的空间位置的信息(例如坐标，例如x，y坐标))经受处理。在一些实施方案中，处理包括逐帧减法处理以产生差分强度分布图，其显示时间序列数据的每一帧内的查询探针结合或解离事件。在开发本文描述的技术期间收集的数据指示差分强度分布图比查询探针结合信号相对于位置图具有更高的分辨率。在一些实施方案中，在确定每个查询探针结合和/或解离事件的空间位置(例如x，y坐标)之后，多个事件根据空间位置簇集，并且每个簇内事件的动力学经受统计学分析以确定事件簇是否源于给定分析物。
[0211]
例如，用于量化一种或多种表面-固定的或扩散性的分析物的方法的一些实施方案包括一个或多个步骤，其包括例如以单分子灵敏度测量一种或多种与一种或多种固定分析物瞬时结合的查询探针的信号。在一些实施方案中，方法包括不依赖于查询探针结合来跟踪分析物(例如检测和/或记录其位置)。在一些实施方案中，该方法进一步包括计算作为位置(例如x，y位置)的函数的在表面处的时间依赖性探针结合信号强度变化。在一些实施方案中，计算作为位置(例如x，y位置)的函数的在表面处的时间依赖性查询探针结合信号强度变化产生对于查询探针与分析物的结合的“差分强度分布图”。在一些实施方案中，方法包括以亚像素准确度从差分强度分布图确定每个查询探针结合和解离事件(“事件”)的
位置(例如x，y位置)。在一些实施方案中，方法包括按表面上的位置(例如x，y位置)将事件分组成局部簇，例如以对单个固定的分析物关联事件。在一些实施方案中，方法包括从每个事件局部簇计算动力学参数，以确定该簇是否源于特定分析物，例如源于与特定分析物的瞬时探针结合。
[0212]
方法的实施方案在所检测的分析物方面不受限制。例如，在一些实施方案中分析物为多肽，例如蛋白或肽。在一些实施方案中，分析物为核酸。在一些实施方案中，分析物为小分子。
[0213]
在一些实施方案中，分析物和查询探针之间的相互作用明显地受到分析物的共价修饰的影响。例如，在一些实施方案中，分析物为包含翻译后修饰的多肽，例如包含翻译后修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，多肽的翻译后修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为多肽上翻译后修饰存在或不存在的函数。例如，在一些实施方案中，分析物为包含表观遗传修饰的核酸，例如包含甲基化碱基的核酸。在一些实施方案中，分析物为包含对分析物的核碱基、核糖或脱氧核糖部分的共价修饰的核酸。
[0214]
在一些实施方案中，核酸的修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为核酸上修饰存在或不存在的函数。
[0215]
在一些实施方案中，翻译后修饰和查询探针之间的瞬时相互作用通过化学亲和标签(例如包含核酸的化学亲和标签)介导。
[0216]
在一些实施方案中，查询探针为核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，查询探针为dna结合蛋白、rna结合蛋白或dna结合的核糖核蛋白复合物。
[0217]
在一些实施方案中，每个结合或解离事件的位置，例如(x，y)位置，通过使差分强度分布图经受形心确定、对高斯函数的最小二乘拟合、对艾里斑函数的最小二乘拟合、对多项式函数(例如抛物线)的最小二乘拟合或最大似然估计来确定。
[0218]
在一些实施方案中，捕获探针为高亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，捕获探针为核酸。在一些实施方案中，捕获通过将分析物与表面交联的共价键介导。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的情况下经受热变性。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的的情况下经受化学变性，例如分析物用诸如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高ph、低ph或十二烷基硫酸钠(sds)等变性剂进行变性。
[0219]
系统该技术的实施方案涉及用于检测分析物的系统。例如，在一些实施方案中，该技术提供用于量化一种或多种分析物的系统，其中系统包含稳定地结合分析物的表面结合的捕获探针或表面结合的部分。在一些实施方案中，表面结合的捕获探针或表面结合的部分经结合位点、表位或识别位点(例如第一结合位点、第一表位或第一识别位点)稳定地结合分析物。在一些实施方案中，系统进一步包含在第二结合位点、第二表位或第二识别位点以低亲和力结合分析物的查询探针。在一些实施方案中，查询探针在接触系统表面的主体溶液中为可自由扩散的。此外，一些系统实施方案包含记录来自查询探针与分析物的相互作用的信号的检测组件。例如，在一些实施方案中，检测组件记录由查询探针与分析物的相互作用产生的作为时间函数的信号变化。在一些实施方案中，检测组件记录查询探针与所述分
析物的结合和解离事件的空间位置(例如作为x，y坐标对)和强度。在一些实施方案中，检测组件记录查询探针与所述分析物的结合和解离事件的空间位置(例如作为x，y坐标对)和开始和/或结束时间。在一些实施方案中，检测组件记录查询探针与所述分析物的结合和解离事件的空间位置(例如作为x，y坐标对)和时间长度。
[0220]
系统实施方案包括分析过程(例如体现为一组指导微处理器实施分析过程的指令，其例如被编码在软件中)以鉴定单个分析物分子。在一些实施方案中，分析过程使用对所述分析物的重复结合和解离事件的空间位置数据和时机(例如开始、结束或时间长度)作为输入数据。
[0221]
系统的实施方案在所检测的分析物方面不受限制。例如，在一些实施方案中分析物为多肽，例如蛋白或肽。在一些实施方案中，分析物为核酸。在一些实施方案中，分析物为小分子。
[0222]
在一些实施方案中，分析物和查询探针之间的相互作用明显地受到分析物的共价修饰的影响。例如，在一些实施方案中，分析物为包含翻译后修饰的多肽，例如包含翻译后修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，多肽的翻译后修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为多肽上翻译后修饰存在或不存在的函数。例如，在一些实施方案中，分析物为包含表观遗传修饰的核酸，例如包含甲基化碱基的核酸。在一些实施方案中，核酸的修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如查询探针信号为核酸上修饰的存在或不存在的函数。
[0223]
在一些实施方案中，翻译后修饰和查询探针之间的瞬时相互作用通过化学亲和标签(例如包含核酸的化学亲和标签)介导。
[0224]
在一些实施方案中，查询探针为核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针为低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，查询探针为dna结合蛋白、rna结合蛋白或dna结合的核糖核蛋白复合物。
[0225]
在一些实施方案中，分析物为包含对分析物的核碱基、核糖或脱氧核糖部分的共价修饰的核酸。
[0226]
在一些实施方案中，捕获探针为高亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，捕获探针为核酸。在一些实施方案中，捕获通过将分析物与表面交联的共价键介导。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的情况下经受热变性。在一些实施方案中，在表面固定之前，分析物在存在载体的的情况下经受化学变性，例如分析物用诸如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高ph、低ph或十二烷基硫酸钠(sds)等变性剂进行变性。
[0227]
该技术的一些系统实施方案包含用于检测和量化分析物的组件。根据该技术的系统包含例如固体支持物(例如显微镜载玻片、盖玻片、亲和素(例如链霉亲和素)缀合的显微镜载玻片或盖玻片、包含零模波导阵列的固体支持物等)和如本文所述的查询探针。
[0228]
一些系统实施方案包含检测组件，其为包含照明配置以激发结合的查询探针的荧光显微镜(例如棱镜型全内反射荧光(tirf)显微镜、物镜型tirf显微镜、近tirf或hilo显微镜、共焦激光扫描显微镜、零模波导和/或能够平行监测大面积载玻片或盖玻片(》 100 μm2)同时将照明限制于表面附近小区域空间的照明配置)。一些实施方案包含荧光检测器，例如包含增强型电荷耦合装置(iccd)、电子倍增电荷耦合装置(em-ccd)、互补金属氧化物
半导体(cmos)、光电增倍管(pmt)、雪崩光电二极管(apd)的检测器和/或能够检测来自单个发色团的荧光发射的另一检测器。一些特定实施方案包含被配置用于无透镜成像的组件，例如无透镜显微镜，例如用于不使用透镜而直接在检测器(例如cmos)上成像的检测和/或成像组件。
[0229]
一些实施方案包括计算机和编码用于计算机来执行的指令的软件，例如以控制数据采集和/或用于处理数据的分析过程。
[0230]
一些实施方案包括光学器件，比如透镜、反射镜、二向色镜、滤光片等，例如以选择性地检测特定波长范围或多个波长范围内的荧光。
[0231]
例如，在一些实施方案中，基于计算机的分析软件被用于将由检测测定产生的原始数据(例如一种或多种分析物的存在、不存在或量，例如作为在表面上的函数时间和/或位置(例如x，y坐标))翻译成供临床医师的预测值数据。临床医师可使用任何合适的方式访问预测数据。
[0232]
一些系统实施方案包括可在其上实施本技术的实施方案的计算机系统。在各种实施方案中，计算机系统包括用于通信信息的总线或其他通信机制以及与总线耦合用于处理信息的处理器。在各种实施方案中，计算机系统包括耦合于总线的存储器，其可为随机访问存储器(ram)或其他动态存储设备，以及待由处理器执行的指令。存储器还可被用于在执行待由处理器执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。在各种实施方案中，计算机系统可进一步包括耦合于总线的只读存储器(rom)或其他静态存储设备，用于存储处理器的静态信息和指令。可提供存储设备(比如磁盘或光盘)并将其耦合于总线用于存储信息和指令。
[0233]
在各种实施方案中，计算机系统经总线耦合于显示器，比如阴极射线管(crt)或液晶显示器(lcd)，用于将信息显示给计算机用户。输入设备，包括字母数字键和其他键，可耦合于总线，用于将信息和命令选择通信给处理器。另一种类型的用户输入设备为光标控制，比如鼠标、跟踪球或光标方向键，用于将方向信息和命令选择通信给处理器和用于控制显示器上的光标移动。该输入设备一般具有在两个轴(第一轴(例如x)和第二轴(例如y))上的两个自由度，这使得设备能够在平面中指定位置。
[0234]
计算机系统可实施本技术的实施方案。与本技术的某些实施方式一致，可响应于处理器通过计算机系统来提供结果，所述处理器执行存储器中含有的一个或多个指令的一个或多个序列。此类指令可从另一计算机可读介质(比如存储设备)读入存储器中。执行存储器中含有的指令序列可导致处理器实施本文所述的方法。或者，可使用硬连线电路替代软件指令或与软件指令组合来实施本讲授。因此，本技术的实施方式不限于硬件电路和软件的任何特定组合。
[0235]
在一些实施方案中，所述方法的步骤以软件代码实施，例如指示计算机和/或微处理器产生和/或转换如上所述的数据的一系列程序步骤。在一些实施方案中，软件指令以编程语言编码，所述编程语言比如basic、nextstep、c、c 、c#、objective c、java、matlab、mathematica、perl、php、ruby、scala、lisp、smalltalk、python、swift或r。
[0236]
在一些实施方案中，在连接于模块化系统中的单个软件对象中提供一个或多个步骤或组件。在一些实施方案中，软件对象为可扩展和可移植的。在一些实施方案中，对象包括转换对象数据的数据结构和操作。在一些实施方案中，对象通过操纵其数据和调用其方
法来使用。因此，实施方案提供模拟、建模或提供具体实体(例如对于数量、形状、数据结构)的可操纵的软件对象。在一些实施方案中，软件对象在计算机或微处理器中为可操作的。在一些实施方案中，软件对象存储于计算机可读介质上。
[0237]
在一些实施方案中，提供本文描述的方法的步骤作为对象方法。在一些实施方案中，提供本文描述的数据和/或数据结构作为对象数据结构。
[0238]
一些实施方案提供用于处理数据(例如包含一个或多个软件对象)以产生结果的面向对象的管线。
[0239]
实施方案包括使用产生和操纵软件对象的代码，例如如使用诸如但不限于java、c 、c#、python、php、ruby、perl、object pascal、objective-c、swift、scala、common lisp和smalltalk等语言编码的。
[0240]
如本文使用的，术语“计算机可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。这种介质可采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质的实例可包括但不限于光盘或磁盘，比如存储设备。易失性介质的实例可包括但不限于动态存储器。传输介质的实例可包括但不限于同轴电缆、铜线和光纤，包括构成总线的线。
[0241]
计算机可读介质的常见形式包括例如软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其他磁性介质，cd-rom、任何其他光学介质，穿孔卡片、纸带、任何其他具有孔图案的物理介质，ram、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储芯片或存储盒，或计算机可从其读取的任何其他有形介质。
[0242]
各种形式的计算机可读介质可参与将一个或多个指令的一个或一个序列携带到处理器以供执行。例如，指令最初可被携带于远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中，并经网络连接(例如lan、wan、互联网、电话线)发送指令。本地计算机系统可接收数据并将其传输到总线。总线可将运送数据到存储器，处理器从所述存储器中检索并执行指令。由存储器接收的指令可任选地在由处理器执行之前或之后存储于存储设备上。
[0243]
根据各种实施方案，将被配置为由处理器执行以实施方法的指令储存于计算机可读介质上。计算机可读介质可为存储数字信息的设备。例如，计算机可读介质包括光盘只读存储器(cd-rom)，如本领域已知用于存储软件的。计算机可读介质由适合于执行被配置为执行的指令的处理器访问。
[0244]
根据这种计算机系统，本文提供的技术的一些实施方案进一步包含用于收集、存储和/或分析数据(例如分析物的存在、不存在、浓度)的功能性。例如，一些实施方案考虑这样的系统：其包含处理器、存储器和/或数据库，用于例如存储和执行指令，分析荧光、图像数据，使用数据进行计算，转换数据以及存储数据。在一些实施方案中，算法将统计模型(例如泊松模型或隐马尔可夫模型)应用于数据。
[0245]
在一些实施方案中，系统包含虚拟提供的计算机和/或数据存储(例如作为云计算资源)。在特定实施方案中，该技术包括使用云计算来提供虚拟计算机系统，所述系统包括组件和/或执行如本文所述的计算机功能。因此，在一些实施方案中，云计算通过网络和/或经互联网来提供如本文所述的基础设施、应用和软件。在一些实施方案中，计算资源(例如数据分析、计算、数据存储、应用程序、文件存储等)经网络(例如互联网)、一般通过web浏览
器远程提供。例如，许多web浏览器能够运行应用，这些应用本身可为对远程服务器上运行的更复杂应用的应用编程界面(“api”)。在一些实施方案中，云计算涉及使用web浏览器界面来控制在远程服务器上运行的应用程序。
[0246]
许多诊断涉及确定一种或多种核酸的存在或核苷酸序列。
[0247]
在一些实施方案中，包含代表一种或多种分析物存在、不存在、浓度、量或序列特性的变量的方程式产生可用于做出诊断或评价分析物存在或质量的值。因此，在一些实施方案中，该值由设备，例如由与结果相关的指示器(例如led、在显示器上的图标、声音等)呈现。在一些实施方案中，设备存储该值、传输该值或使用该值用于另外的计算。在一些实施方案中，方程式包含代表一种或多种分析物存在、不存在、浓度、量或特性的变量。
[0248]
因此，在一些实施方案中，本技术提供进一步的益处，即可能在分析测定方面未经培训的临床医师不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医师。然后，临床医师能够利用该信息来优化受试者的护理。本技术考虑能够接收、处理以及向和从进行测定的实验室、信息提供者、医学人员和/或受试者传输该信息的任何方法。例如，在本技术的一些实施方案中，样品获得自受试者并提交给位于世界的任何部分(例如在不同于其中受试者所在的或其中最终使用信息的国家)的概况分析服务(例如在医疗设施处的临床实验室、基因组概况分析企业等)，以产生原始数据。在样品包含组织或其他生物样品的情况下，受试者可访问医学中心以使得样品被获得并发送至概况分析中心，或着受试者可自己收集样品并直接将其发送至概况分析中心。在样品包含先前确定的生物信息的情况下，信息可由受试者直接发送至概况分析服务(例如可通过计算机扫描含有信息的信息卡并使用电子通信系统将数据传输至概况分析中心的计算机)。一旦样品被概况分析服务接收，就处理该样品，并产生对于受试者所期望的诊断或预后信息而言特定的概况。然后以适合于由治疗的临床医师解释的形式制备概况数据。例如，不是提供原始表达数据而是准备好的形式可代表受试者的诊断或风险评价以及对于特定治疗选择的建议。数据可通过任意合适的方法显示给临床医师。例如，在一些实施方案中，概况分析服务产生这样的报告：其可打印给临床医师(例如在护理点)或在计算机显示屏上显示给临床医师。在一些实施方案中，首先在护理点处或在区域设施处分析信息。然后将原始数据发送至中央处理设施用于进一步分析和/或以将原始数据转化为对于临床医师或患者有用的信息。中央处理设施提供数据分析的私密性(所有数据均以统一安全协议存储于中央设施中)、速度和一致性的优势。然后，中央处理设施可在受试者治疗后控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中央设施可将数据提供给临床医师、受试者或研究人员。在一些实施方案中，受试者能够使用电子通信系统访问数据。受试者可基于结果选择进一步的干预或咨询。在一些实施方案中，将数据用于研究用途。例如，可使用数据以进一步优化标志物的包含或消除作为与疾病相关的特定病症的有用指标。
[0249]
样品在一些实施方案中，从生物样品分离分析物。分析物可获得自任何材料(例如细胞材料(活的或死的)、细胞外材料、病毒材料、环境样品(例如宏基因组样品)、合成材料(例如扩增子，比如通过pcr或其他扩增技术提供的))，获得自动物、植物、细菌、古核生物、真菌或任何其他生物体。用于本技术的生物样品包括病毒颗粒或其制品。分析物可直接获得自生物体或获得自从生物体获得的生物样品，例如获得自血液、尿液、脑脊液、精液、唾液、痰液、
粪便、毛发、汗液、泪液、皮肤和组织。示例性的样品包括但不限于全血、淋巴流体、血清、血浆、口腔细胞、汗液、泪液、唾液、痰液、毛发、皮肤、活组织检查、脑脊液(csf)、羊水、精液、阴道排泄物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、漏出液、渗出液、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品和拭子、抽吸物(例如骨髓、细针等)、洗液(例如口腔、鼻咽、支气管、支气管肺泡、眼、直肠、肠道、阴道、表皮等)、呼吸冷凝液和/或其他样本。
[0250]
可使用任何组织或体液样本作为用于该技术的分析物来源，包括法医样本、存档样本、保存样本和/或储存长时间段的样本，例如新鲜冷冻的、甲醇/乙酸固定的或福尔马林固定石蜡包埋的(ffpe)样本和样品。分析物还可从培养细胞分离，比如原代细胞培养物或细胞系。可用病毒或其他细胞内病原体感染从中获得分析物的细胞或组织。样品还可为从生物样本、cdna文库、病毒或基因组dna提取的总rna。样品也可为来自非细胞起源的分离的dna，例如已经储存于冰柜中的扩增/分离的dna。
[0251]
例如通过从生物样品中提取，例如通过多种技术比如maniatis等人(1982) molecular cloning: a laboratory manual, cold spring harbor, n.y. (参见例如第280-281页)描述的那些，可获得分析物(例如核酸分子、多肽、脂质)。
[0252]
在一些实施方案中，该技术提供分析物的大小选择，例如以提供限定大小范围的分子(包括分析物)。
[0253]
用途各种实施方案涉及广泛范围分析物的检测。例如，在一些实施方案中，该技术可用于检测核酸(例如dna或rna)。在一些实施方案中，该技术可用于检测包含特定目标序列的核酸。在一些实施方案中，该技术可用于检测包含特定突变的核酸(例如单核苷酸多态性、插入、缺失、错义突变、无义突变、基因重排、基因融合等)。在一些实施方案中，该技术可用于检测多肽(例如蛋白、肽)。在一些实施方案中，该技术可用于检测由包含突变的核酸编码的多肽(例如包含取代的多肽、截短的多肽、突变体或变体多肽)。
[0254]
在一些实施方案中，该技术可用于检测多肽的翻译后修饰(例如磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化(例如o-连接的糖基化、n-连接的糖基化、泛素化、官能团附接(例如肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化(isoprenylation)、异戊二烯化(prenylation)、法尼基化、香叶基化、香叶基香叶基化、糖基磷脂酰肌醇化、糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定形成)、羟基化、生物素化、聚乙二醇化、氧化、sumo化、二硫桥形成、二硫桥切割、蛋白水解切割、酰胺化、硫酸盐化作用、吡咯烷酮羧酸形成)。在一些实施方案中，该技术可用于检测这些特征的丧失，例如去磷酸化、去甲基化、去乙酰化、去糖基化、去酰胺化、去羟基化、去泛素化等。在一些实施方案中，该技术可用于检测对dna或rna的表观遗传修饰(例如甲基化(例如cpg位点的甲基化)、羟甲基化)。在一些实施方案中，该技术可用于检测这些特征的丧失，例如dna或rna的去甲基化等。在一些实施方案中，该技术可用于检测染色质结构、核小体结构、组蛋白修饰等的改变，以及用于检测对核酸的损伤。
[0255]
在一些实施方案中，该技术可用作分子诊断测定，例如测定具有小样本体积的样品(例如一滴血，例如用于邮寄服务)。在一些实施方案中，该技术使用对非常低丰度的分析物生物标志物的灵敏检测来提供癌症或感染性疾病的早期检测。在一些实施方案中，该技术可用于分子诊断，以测定蛋白生物标志物的表观遗传修饰(例如翻译后修饰)。
[0256]
在一些实施方案中，该技术可用于表征多分子复合物(例如表征多分子复合物的
一种或多种组分)，例如多蛋白复合物、核酸/蛋白复合物、分子机器、细胞器(例如无细胞线粒体(例如在血浆中))、细胞、病毒颗粒、生物体、组织或任何可捕获且适合于通过本文所述技术进行分析的大分子结构或实体。例如，在一些实施方案中，多分子复合物为分离的并且该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测与该多分子复合物相关的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，细胞外囊泡为分离的并且该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测与该囊泡相关的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，该技术可用于表征、鉴定、量化和/或检测蛋白(例如表面蛋白)和/或存在于囊泡内的分析物，例如蛋白、核酸或本文所述的其他分析物。在一些实施方案中，囊泡在分析之前进行固定和透化。
[0257]
通过包含捕获探针的纳米颗粒的分析物捕获在一些实施方案中，该技术涉及使用纳米颗粒捕获分析物用于通过simreps进行分析。在一些实施方案中，该技术包括使用纳米颗粒，其直径在约5纳米-约200纳米范围内(例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200纳米)并且包含(例如涂覆、连接)对分析物(例如分别为核酸、抗原、抗体)具有特定亲和力的捕获探针(例如核酸、抗体、抗原)。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径足够大以有效地收集(例如沉积(例如固定))在表面处，并且足够小以完全或大部分安置在激发场(例如tirf消逝场)内。此外，在一些实施方案中，该技术包括使用直径小于约200 nm的纳米颗粒来减少激发或发射光的散射，从而提高检测查询探针的单个结合事件的灵敏度。
[0258]
在通过纳米颗粒(例如通过纳米颗粒的捕获探针)捕获分析物之后，在表面处收集(例如沉积(例如固定))纳米颗粒以供simreps分析，例如在存在与捕获的分析物重复结合以提供可检测信号的查询探针的情况下使用单分子成像(例如全内反射荧光(tirf))，所述可检测信号在查询探针与分析物的特异性结合和查询探针与其他非分析物实体的非特异性结合(如果有的话)之间进行区分。
[0259]
根据该技术的实施方案，通过施加外力，纳米颗粒可与周围介质分离，例如以在表面处收集(例如沉积(例如固定))包含分析物的纳米颗粒。该技术不限于被用于在表面上收集(例如沉积(例如固定))纳米颗粒的方法(例如外力)。例如，在一些实施方案中，通过提供磁场(例如对于磁性或顺磁性纳米颗粒)、通过提供电场(例如对于极性和/或荷电纳米颗粒)和/或通过提供惯性力(例如离心(例如对于具有与周围介质不同的密度的纳米颗粒)以及/或重力)来沉积纳米颗粒。在一个示例性的实施方案中，使用超顺磁性纳米颗粒的悬浮液从溶液中捕获分析物，并将包含分析物的纳米颗粒快速(例如在少于5分钟(例如小于5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或0.5分钟内)沉积到具有外部稀土磁体的玻璃盖玻片上以供simreps分析。在另一个示例性的实施方案中，使用金纳米颗粒的悬浮液从溶液中捕获分析物，并然后通过离心将包含分析物的纳米颗粒沉积到玻璃盖玻片上以供simreps分析。
[0260]
在一些实施方案中，相对于单独通过扩散的捕获，与simreps技术一起使用纳米颗粒提高分析物捕获的速度和/或增加抗原捕获的效率。因此，与simreps一起使用纳米颗粒缩短获得结果的时间和/或提高simreps测定的灵敏度。
[0261]
如本文使用的，术语“顺磁性”和“超顺磁性”为可互换的。顺磁性和超顺磁性材料(例如当制成纳米颗粒时)具有这样的特性：当存在外部磁场时响应该外部磁场，但在外部磁场解除时会立即消散任何残余磁性，并且因此易于重新悬浮且保持单分散性，但当被置
于靠近磁场时，则紧密地聚集在一起，该过程通过简单地移除磁场而为完全可逆的。
[0262]
如本文使用的，术语“磁力场”或“磁场”是指由磁体两磁或线圈两面之间的磁通线限定的体积。电磁体和驱动电路可被用于产生磁场和局部磁场。也可以使用永磁体。优选的永磁材料包括ndfeb (钕-铁-硼nd2fe14b)、铁氧体(锶或钡铁氧体)、alnico (铝-镍-钴)和smco (钐钴)。磁力场内的磁力遵循磁通线。在磁通量最密集的地方，磁力最强。磁力场可穿透大多数固体和液体。移动的磁力场具有两个矢量：一个在磁场移动方向上而另一个在磁通线方向上。
[0263]
使用多种查询探针进行分析物检测在一些实施方案中，该技术涉及使用以两种或更多种不同标记(例如荧光团)标记的查询探针来检测分析物的存在、不存在和/或数量的simreps的用途。在一些实施方案中，该技术包括使用对相同分析物具有特异性并且包含两种或更多种不同标记的两种或更多种查询探针。
[0264]
在一些实施方案中，两种或更多种查询探针包括包含第一标记的第一查询探针和包含第二标记的第二查询探针(以及任选地，分别包含第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十等标记的第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十等查询探针)。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针不同的查询探针(例如组合物包含含有不同标记的不同查询探针)。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针相同的查询探针(例如查询探针分子的第一部分包含第一标记和查询探针分子的第二部分包含第二标记)。根据该技术的实施方案，包含两种或更多种不同标记的查询探针被提供于用于simreps的组合物(例如成像缓冲液)，并且如本文所述在表面上进行收集(例如沉积(例如固定))。根据一些实施方案，当两种(或所有)荧光团都重复出现在成像表面(例如固体支持物)上的相同位置时，检测到表面固定的分析物，从而指示包含两种或更多种标记中每一种的多种探针的重复结合。
[0265]
在一些实施方案中，两种或更多种查询探针包括包含第一标记的第一查询探针和包含第二标记的第二查询探针，并且第一标记和第二标记为f
ö
rster共振能量转移(fret)对。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针不同的查询探针(例如组合物包含含有作为fret对的不同标记的不同查询探针)。在一些实施方案中，第一查询探针为与第二查询探针相同的查询探针(例如查询探针分子的第一部分包含第一标记和查询探针分子的第二部分包含第二标记，并且第一标记和第二标记为fret对)。因此，在一些实施方案中，包含作为fret对的标记的查询探针以将两个fret对标记定位得足够靠近以使在两个标记之间发生fret (例如比两个标记(例如荧光团)的近似f
ö
rster半径更靠近的距离) (例如约2-10纳米(例如2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0 nm)))的方式同时结合于相同分析物，并且检测fret受体的发射。因此，将多种(例如两种)查询探针组合在用于simrep的组合物(例如成像缓冲液)中，并且在fret信号重复出现在表面(例如固体支持物)上的相同位置时，检测到表面固定的分析物。
[0266]
在使用两种或更多种标记(例如两种或更多种荧光团(例如fret对))的一些实施方案中，检测分析物与检测(观察、记录、测量)指示在荧光和非荧光状态之间(或在fret和非fret状态之间)转换的特定动力学特征的信号(例如信号或信号特征的重复出现)相关联。也就是说，在一些实施方案中，特定动力学特征指示分析物存在的置信度增加。在两种版本中，分析物都固定于固体支持物(例如盖玻片、显微镜载玻片、多孔板、可扩散颗粒(例如纳米颗粒))上和/或固定于固定细胞或其他三维基质上，之后在存在查询探针的情况下成像。
[0267]
在一些实施方案中，使用两种或更多种探针和/或两种或更多种标记提供比使用单荧光的查询探针更具特异性的信号。因此，包括使用两种或更多种探针和/或两种或更多种标记的simreps技术的实施方案通过减少假阳性来降低检测限。在包括使用两种或更多种探针和/或两种或更多种标记的simreps技术的一些实施方案中，检测限没有变化或基本上没有变化，并且采集时间被缩短(例如通过减少观察、记录和/或测量和查询探针与非分析物实体的非特异性结合不同的查询探针与分析物重复结合的动力学特征所需的时间量)。例如，在一些情况下，单个查询探针可能偶尔会与成像表面结合并产生和由查询探针与分析物的重复结合所提供的信号相似的信号，但其实际上为由光物理过程产生的信号，例如重复淬灭和去淬灭和/或重复光闪烁(例如暗三重态和荧光单重态之间的系间窜越)，而不是重复结合。因此，使用两种或更多种查询探针提高灵敏度和/或特异性，因为两种不同标记的探针在表面上彼此紧密结合并产生虚假重复闪烁信号的可能性远低于两种不同标记的探针通过结合同一分析物分子而紧密结合在一起的可能性。
[0268]
调节查询探针动力学的测定条件在一些实施方案中，该技术涉及使用simreps测定条件，所述条件被提供以调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的缔合和/或调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物解离。在一些实施方案中，调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的缔合和/或调节(例如增加和/或减少)查询探针与分析物的解离导致调节(例如增加和/或减少)测定时间(例如收集指示查询探针与分析物瞬时相互作用的动力学活性的信号所需的时间)。在特定实施方案中，通过增加查询探针与分析物缔合的速率和/或增加查询探针与分析物解离的速率来减少测定时间。
[0269]
该技术包括各种实施方案，其中控制测定条件以提供测定时间的改进。例如，在一些实施方案中，提高实施simreps测定的温度(例如使用热电偶、微波辐射、光等)减少测定时间，例如通过增加扩散和削弱化学相互作用，从而增加查询探针与分析物缔合的速率和/或增加查询探针与分析物解离的速率(例如增加查询探针开/关速率)。参见图4a、图4b和图4c。在一些实施方案中，温度为高于30℃(例如高于30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5或50.0℃)。在一些实施方案中，温度保持在30-50℃之间(例如30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5或50.0℃)加减1-5℃(例如
±ꢀ
1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、
3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0℃)。
[0270]
在一些实施方案中，该技术包括增加simreps测定反应混合物(例如成像缓冲液)中盐的浓度以削弱离子相互作用，从而增加查询探针与分析物缔合的速率和/或增加查询探针与分析物解离的速率(例如增加查询探针开/关速率)。在一些实施方案中，该技术包括增加simreps测定反应混合物(例如成像缓冲液)中有机溶剂的浓度以削弱疏水相互作用，从而增加查询探针与分析物缔合的速率和/或增加查询探针与分析物解离的速率(例如增加查询探针开/关速率)。在一些实施方案中，盐浓度增加至大于150 nm (例如150 mm-600 mm (例如150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600 mm))。在一些实施方案中，盐浓度增加至大于100 mm (例如100 mm-1000 mm (例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 mm))。
[0271]
在一些实施方案中，盐浓度增加至大于150 mm一价(例如钠)离子(例如150 mm-600 mm (例如150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600 mm))。在一些实施方案中，盐浓度增加至大于100 mm一价(例如钠)离子(例如100 mm-1000 mm (例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 mm))。
[0272]
在一些实施方案中，增加查询探针开/关速率提供数据收集速率的增加，并因此减少测定时间和/或算法鉴定(例如检测)分析物和区分分析物与背景和假阳性信号所需的时间。特别地，simreps在分析物和非分析物之间进行区分的能力作为查询探针结合事件数量的函数增加，例如simreps的区分能力随着查询探针与给定分析物分子的结合事件数量增大而增加。换言之，增加查询探针与分析物的缔合速率和/或查询探针与分析物的解离速率，例如通过在测量期间操纵盐浓度或温度，每单位时间的结合事件的速率增加(例如可在更短时间内观察到相同数量的结合事件)，从而提供足以在更短时间段内对分析物进行阳性检测的动态指纹采集。
[0273]
微流体装置在一些实施方案中，该技术涉及使用微流体样品处理用于分析物的表面捕获，随后为通过simreps测定检测分析物。在一些实施方案中，该技术(例如方法)包括提供包含受控通道尺寸的微流体装置；提供包含分析物的样品；以及在包括涂覆有捕获探针(例如捕获抗体)的小捕获区域的微流体装置中接触包含分析物的样品。在一些实施方案中，该技术使在捕获区域内固定的分析物的分数最大化(例如》5% (例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多))。
[0274]
在一些实施方案中，该技术包括循环地将新鲜的分析物样品等分试样或相同的分
析物样品等分试样重新加载到装置中(参见例如macdonald, anal.biochem., 2019, 566:139-145，通过参考结合至本文中)。在这些实施方案中，将新鲜的分析物样品等分试样以规定的间隔(例如以约每1-2分钟的间隔(例如以约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300秒的间隔))引入到微流体装置中。在引入每个分析物样品等分试样之间，清除装置内的捕获区域的先前的等分试样。可通过用缓冲液或不包含分析物的其他溶液洗涤捕获区域或者通过将空气(或另一种气体，比如氮气)泵送通过装置内的捕获区域(也称为气隙)来进行清洗。在使用空气用于清洗的情况下，清洗时间可为约1秒(或更少)或长达约30
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60秒(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60秒)。在一些实施方案中，该技术包括循环地将相同的分析物样品等分试样多次重新加载到装置中(也被称为样品回收)。在这些实施方案中，将分析物样品的等分试样引入到微流体装置中并清洗。可通过用缓冲液或不含分析物的其他溶液洗涤捕获区域或者通过将空气泵送通过装置内的捕获区域来进行清洗。在清洗捕获区域之后，然后将相同的分析物样品等分试样重新加载到微流体装置的捕获区域中。
[0275]
在一些实施方案中，该技术包括使用数字微流体(dmf)方法控制样品添加和混合，其中离散液滴的操纵进行电子控制(参见例如miller, anal bioanal chem, 2011, 339:337-345；shamsi, 2014, lab chip 14: 547-554，其每一个通过参考结合至本文中)。
[0276]
在一些实施方案中，该技术包括使用流约束用于微流体装置内捕获区域中的分析物的浓集(参见例如hofmann, anal. chem. 2002, 74:5243-5250，通过参考结合至本文中)。在这些实施方案中，样品流与约束流(例如水或样品介质)连接。约束流以垂直方向连接样品流。通过使用层流条件，不会发生混合，并且在汇合之后，获得样品流和约束流之间的平面片状几何形状。可使用约束流的流速来控制样品的约束。
[0277]
在一些实施方案中，该技术包括在微流体装置内，例如在微流体装置的捕获区域内，混合分析物样品(参见例如ward, 2015, j. micromechmicroeng., 25: 1-33，通过参考结合至本文中)。微流体混合可分为两类：主动和被动混合。被动混合可通过改变流体通道的结构或配置来实现，并在制作期间并入系统中。混合程度由装置配置确定，并通过使用样品流速进行调整。主动混合器由用户激活和控制。因此，一些实施方案包括通过在微流体装置的一个或多个通道或装置的分析物捕获区域中引入倾斜孔、脊、人字形图案和/或槽，在微流体装置的捕获区域内被动混合样品分析物。在一些实施方案中，槽和/或脊的深度和/或高度可以变化，以影响混合效率。在一些实施方案中，被动混合与微流体装置的通道和/或捕获区域内的荷电壁一起使用。例如，用于构建装置的基底可具有疏水或荷电特性。
[0278]
仍然其他实施方案包括在微流体装置的捕获区域内使用分析物样品的主动混合。在一些实施方案中，微型搅拌器被用于在微流体装置的捕获区域内混合分析物样品。一些实施方案包括使用声波在微流体装置的捕获区域内混合分析物样品。声波可与其他混合元件(比如微泡)组合，以在微流体装置的捕获区域中混合分析物样品。仍然其他实施方案包括在微流体装置的捕获区域内使用周期性流体脉动、热混合、电动混合和/或分析物样品的其他类型的混合。如对本领域的技术人员也将为显而易见的，在本文描述的方法中可使用
主动和被动混合的任何组合。
[0279]
在一些实施方案中，样品在包含固定捕获分子的水凝胶材料的表面上浓集(例如使用电泳)。在一些实施方案中，水凝胶的折射率为约1.5或更高，并且与全内反射兼容(参见zhou, 2013, macromol biosci 13: 1485-1491，通过参考结合至本文中)。在一些情况下，水凝胶模制成棱柱或矩形厚块的形状。
[0280]
用于在微流体装置的捕获区域内浓集和/或混合分析物样品的方法和技术的非限制性另外实例也公开于glaser, 1993, analytical biochemistry 213: 152-161；hibbert, 2002, langmuir 18: 1770-1776；gervais, 2006, chemical engineering science 61: 1102-1121；yang, 2008, journal of applied physics 103: 084702-1-084702-10；selmi, 2017, scientific reports 7: 1-11；stott, 2010, pnas 107: 18392-18397；stroock, 2002, science 295: 647-651；green, 2007, int. j. of multiphysics 1: 1-32；ward, 2015, j. micromech microeng. 25: 1-33；hofmann, 2002, analytical chemistry 74: 5243-5250；和macdonald, 2019, analytical chemistry 566: 139-145中，其每一个特此通过参考以其全部结合。
[0281]
相反，数据显示在非微流体样品池(例如附于检测载玻片上的圆柱形样品孔)中的扩散在成像表面提供约1%的抗原捕获效率。用微流体向小的捕获区域的受控样品递送预计产生更高的捕获效率以及更小面积的捕获，从而导致更高的捕获效率和灵敏度。
[0282]
在一些实施方案中，该技术(例如方法)包括使捕获的分析物与包含查询探针的成像溶液接触；和观察、记录和/或测量瞬时、重复的查询探针与分析物的缔合以及查询探针与分析物的解离。在一些实施方案中，缔合和解离产生特征动力学，其指示分析物存在于由微流体装置提供的固体支持物的离散区域中。在一些实施方案中，由微流体装置提供的小通道尺寸改善分析物捕获的效率。特别地，短的扩散距离(例如小于约100微米(例如小于100、90、80、70、60、50、40、30、20或10微米))增加分析物和表面之间的碰撞频率。在某些优选的实施方案中，通道尺寸是这样的，即通道的深度为10微米或更小(例如小于9、8、7、6、5、4、3、2或1微米)。此外，由于通道的横截面积小，微流体装置的使用显著增加微流体通道相邻部分中表面结合捕获探针的有效浓度。因此，微流体装置的使用通常增加捕获探针捕获分析物的动力学速率，并驱动平衡朝向分析物-捕获探针复合物。随后的可逆结合的查询探针的引入提供一种simreps测定，用于通过对由查询探针的缔合和解离产生的信号进行动力学分析，以高特异性和灵敏度检测表面结合的抗原。
[0283]
在各种实施方案中，微流体装置使用诸如激光模板印刷、压凸、冲压、注塑、掩模、蚀刻和三维软刻印等技术由各种材料进行制作。层压式微流体装置进一步用粘合剂中间层或通过高温无粘合剂接合技术(比如通过定向聚丙烯的压力处理)进行制作。层压式和模制式微流体装置的微架构可能不同。在一些实施方案中，通常使用适合于微制造技术的多种方法和材料中的一种或多种来制作卡盒。例如，在一些实施方案中，装置的主体包含多个平面构件，这些平面构件为由多种聚合材料制作的单独注塑的部件，或者为硅、玻璃等。在结晶基底如二氧化硅、玻璃或硅的情况下，使用用于蚀刻、研磨、钻孔等的方法来产生孔和凹陷，这些孔和凹陷构成卡盒内的各种反应室和流体通道。微制造技术，比如半导体和微电子工业中经常使用的那些，特别适合于这些材料和方法。这些技术包括例如电沉积、低压气相沉积、光刻(例如软光刻)、蚀刻、激光钻孔等。在使用这些方法的情况下，通常将为合乎期望
的是由与半导体工业中使用的那些相似的材料(例如二氧化硅、硅或砷化镓基底)制作装置的平面构件。出于所有目的通过参考以其全部结合至本文中的美国专利号5,252,294报告了在生物技术应用中用于样品处理的硅基多孔装置的制作。在一些实施方案中，使用多层软刻印技术制备微流体装置。例如，在该技术相关的一些实施方案中，使用多层软刻印技术(msl)将微流体装置制备为多层pdms (例如sylgard 183)装置(例如在固体基底上，例如在玻璃上)。参见例如unger等人(2000) science 288: 113-116和国际专利申请wo2001001025，每一个均通过参考以其全部结合至本文中。
[0284]
在一些实施方案中，蚀刻基底的光刻方法特别良好地适合于这些微流体卡盒的微制造。例如，基底的第一片可用光致抗蚀剂覆盖。然后可使电磁辐射源发光通过光刻掩模，以将光致抗蚀剂暴露在反映片材表面上的腔室和/或通道图案的图案中。在去除暴露的光致抗蚀剂之后，可蚀刻暴露的基底以产生期望的孔和通道。通常优选的光致抗蚀剂包括半导体工业中广泛使用的那些。此类材料包括聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)及其衍生物，以及电子束抗蚀剂比如聚(烯烃砜)等(更充分地在例如ghandi,
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vlsi fabrication principles,
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wiley (1983)第10章中进行讨论，出于所有目的通过参考以其全部结合至本文中)。
[0285]
如本文使用的，术语“微流体通道”或“微通道”是指具有可变长度和横截面中一个维度小于500-1000
ꢀµ
m的流体通道。微流体通道中的微流体流动行为是高度非理想和分层的，并且可更加依赖于壁润湿特性、粗糙度、液体粘度、粘附性和凝聚性，而不是端对端的压降或横截面积。微流体流动状态通常与通道中“虚拟液体壁”的存在有关。然而，在较大的通道中，10 psi或更高的头端压力可产生接近湍流的过渡流动状态，这在测定的冲洗步骤中可为重要的。
[0286]
在一些实施方案中，微流体装置包括用于控制和流体操纵的气动歧管，尽管在一些实施方案中可使用电子激活的阀。在一些实施方案中，空气端口连接于气动歧管。在一些实施方案中，空气端口提供有疏水性分离过滤器(例如任何液体不可渗透气体可渗透的滤膜)，其中流体从装置内泄漏为不合期望的和不安全的。
[0287]
一些实施方案包括柔性膜层。柔性膜层提供微流体阀和泵。在一些实施方案中，柔性膜层将卡盒连接于压力和真空阀所在的控制器平台。在控制器盒上操纵阀和泵向柔性膜施加压力或真空，并通过气动驱动使液体移动通过通道。
[0288]
在一些实施方案中，在微流体装置上提供反应室，并且该反应室可为任何合适的形状，比如矩形室、圆形室、锥形室、蛇形通道和用于进行反应的各种几何形状。这些腔室可具有观察窗(例如允许光谱的可见、紫外和/或红外范围内的电磁辐射通过)，例如用于检查内容物(例如通过用户，通过可见、紫外和/或红外信号的检测器等)，例如提供一个或多个包含用于simreps测定的表面的检测腔室。通常在微流体装置上提供废物室。废物室任选地用卫生疏水性膜进行排气。
[0289]
在一些实施方案中，该技术包括非微流体(例如宏观流体)和微流体元件。在一些实施方案中，非微流体元件(通道、腔室等)通过微流体装置例如微流体装置中的微流体通道彼此流体连接，并与微流体元件(通道、腔室等)流体地连接。微流体装置包括方向控制机构，比如阀和泵，通过所述机构流体选择性地在不同腔室之间和沿着不同通道路由，以及通过所述机构单个腔室可与多个其他腔室连通。这些连接和路由机制允许由微流体装置执行
的功能自动化。
[0290]
分析物与成像表面的共价缔合在一些实施方案中，该技术涉及将分析物共价连接于simreps成像表面(例如通过在分析物和表面之间和/或在分析物和固定于表面上的捕获探针之间形成化学键)。在一些实施方案中，该技术提高通simreps检测分析物的灵敏度。特别地，尽管simreps和其他基于表面的测定包括使用捕获探针以将感兴趣的分析物(例如抗原)固定于表面以供检测，但捕获探针对分析物的亲和力为有限的，并且对于许多分析物-捕获探针对而言，与表面解离的分析物部分在数分钟或数小时的时间尺度上为显著的(例如大于10%)。因此，表面上分析物的量会随着时间的推移而减少，如果没有很好地控制捕获和检测之间的时间间隔，则会导致灵敏度降低和重现性可能降低。例如，收集到的数据表明，不同的蛋白simreps测定的灵敏度随着时间的推移而降低，这强烈地表明抗原与表面的解离为显著的。
[0291]
因此，在一些实施方案中，本文提供的simreps技术减少分析物解离以提高simreps和其他基于表面的测量的灵敏度。特别地，本文提供的技术的实施方案提供一个或多个将分析物与捕获探针交联的共价键，从而防止分析物在测量之前或期间与表面解离。该技术不限于在分析物和捕获探针之间产生交联的化学用途。例如，实施方案将分析物-捕获探针复合物与反应性化学物质一起温育，所述反应性物质比如nhs酯衍生物(例如酒石酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯或戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、亚氨酸酯衍生物(例如庚二亚氨酸二甲酯、辛二亚氨酸二甲酯)、卤代乙酰基衍生物(例如碘乙酸琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚胺衍生物(例如4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)或碳二亚胺衍生物(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)；或通过用uv光辐照分析物-捕获探针复合物。在将分析物与捕获探针交联之后，捕获的分析物通过simreps进行检测，例如在存在与捕获的分析物瞬时结合的具有构成可检测的动力学指纹的特征动力学的查询探针的情况下使用成像，例如通过全内反射荧光显微术。在一些实施方案中，重要的是交联剂确实显著干扰查询探针和分析物之间的相互作用。例如，如果查询探针与之相互作用的分析物区域(例如表位)不含参与交联的官能团，则这是优选的。
实施例
[0292]
实施例1在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以测试直径为约100 nm且包含捕获探针的金纳米颗粒，以及测试直径为约100 nm且包含捕获探针的磁性纳米颗粒，以捕获分析物和随后进行如本文所述的simreps分析。在这些实验中，收集的数据表明使用包含捕获探针的纳米颗粒与核酸和蛋白分析物两者的simreps检测都兼容。
[0293]
实施例2在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以通过提供增加的温度和/或盐浓度来调节simreps测定采集时间。实验期间收集的数据表明，使用包含荧光标记的单价fab片段的查询探针进行simreps动力学指纹测定的速度可通过操纵盐和/或温度而提高超过10倍，从而在一些实施方案中将simreps测定时间缩短90%或更多。
[0294]
例如，在这些实验期间收集的数据表明，将simreps测定温度升高至30-37℃提供改进的对白细胞介素-6 (il-6)抗原分析物的simreps测定，所述测定使用包含与il-6抗原
(例如分析物)瞬时相互作用的抗体(荧光fab片段)的查询探针。通过使用加热台将测定温度升高至33℃或使用物镜加热器升高至约33-37℃，simreps在约2分钟内特异性地检测到il-6抗原分析物。相对地，在室温(例如约22-24℃)下通过simreps的il-6抗原的特异性检测在20分钟内发生。类似地，在这些实验期间收集的数据表明，检测纤溶酶原激活物抑制剂-1 (pai-1)蛋白的simreps测定在约30-37℃的测定温度下于约2分钟内完成。相对地，在室温下检测pai-1蛋白的simreps测定在约10分钟内发生。因此，这些数据表明，升高simreps测定的温度提供通过动态结合和解离查询探针来提高simrep测量的采集速率的通用方法。参见图4。
[0295]
另外，在实验期间收集的数据表明，将simreps反应混合物(例如成像缓冲液)的盐浓度从约150 mm钠离子增加至约600 mm钠离子，令使用包含荧光fab片段的查询探针检测pai-1分析物simreps测定的数据采集加速了约5倍的系数：例如，每个视野10分钟到2分钟。在不受理论约束的情况下，增加钠离子的浓度会减少查询探针与分析物结合的停留时间和降低查询探针与检测表面非特异性结合的频率。参见图5。
[0296]
因此，数据表明升高温度和/或盐浓度可改善simreps在更短时间段内将查询探针与分析物结合的动力学指纹与背景动力学区分开来的能力。
[0297]
实施例3在开发本文提供的技术的实施方案期间，使用本文描述的simreps技术的实施方案进行实验以量化4种不同蛋白抗原。具体而言，为pai-1、il-6、vegf-a和il-34产生了一系列标准曲线，其指示了使用荧光标记的查询探针的simreps动力学指纹对这4种蛋白分析物的定量检测。图6。
[0298]
基质为动物血清(对pai-1和il-6为马血清；对vegf-a和il-34为鸡血清)。表观检测限对pai-1为770 am，对il-6为770 am，对vegf-a为3.6 fm，和对il-34为6.5 fm，其作为高于空白平均值3个标准差进行计算。数据表明，在100微升样品中，每飞摩尔抗原在成像表面上捕获250-1300个之间的分子，对应于这些特定实验条件下0.4-2.2%的捕获效率。
[0299]
实施例4在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以开发和测试用于simreps的免洗方案。图7a。该方案被用于simreps，并提供血清中il-6的定量检测。在该方案中，将含有il-6的血清样品与包含查询探针的成像溶液合并，并然后添加到预涂有捕获抗体的盖玻片上。温育(例如30分钟)之后，样品通过tirf显微术进行成像，以量化il-6。使用来自用免洗方案的il-6的动力学指纹的数据来产生标准曲线。图7b。使用来自通过simreps (无洗涤方案，对所有样品稀释100倍)和elisa (可变稀释系数，4或64倍，取决于分析物浓度)在34个患者来源(人类)的血清样品中测量il-6的数据来产生相关图。两种方法之间的相关系数为0.999。图7c。相对于elisa，simreps方案避免样品引入后的洗涤步骤。另外，simreps提供相对于elisa改进的用于检测分析物(例如蛋白分析物)的方法，因为simreps使用比elisa的样品更加稀释高达25倍的样品。
[0300]
在以上说明书中提及的所有出版物和专利均出于所有目的通过参考以其全部结合至本文中。该技术的所述组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域的技术人员而言将为显而易见的，而不背离所述技术的范围和精神。尽管已经结合具体示例性实施方案描述了该技术，但是应当理解，要求保护的发明不应不适当地限于此类具体实施方案。实
际上，对于本领域的技术人员显而易见的所述用于实施本发明的模式的各种修改预期处于以下权利要求的范围内。