用于轨道振荡细胞培养物、特别是悬浮培养物的生物反应器的制作方法

用于轨道振荡细胞培养物、特别是悬浮培养物的生物反应器
1.本发明涉及用于振荡细胞培养物、特别是任何生物细胞类型的悬浮培养物的生物反应器容器，其包括为反应器空间提供至少两个额外的内表面的集成的内部结构，以及使用所述生物反应器容器生长生物细胞的方法。
2.消耗气体例如好氧的生物细胞在悬浮细胞培养物中的生长除了提供营养素之外还需要供应充足的例如氧气，因此将空气输入液体培养物中。轨道振荡生物反应器是重要的生物反应器类型，并且通常可提供从微升到2000升的培养体积。这种反应器易于以低操作成本操作并因此是提高培养性能的目标。这种生物反应器容器的一个持续需求是增加进入细胞培养液中的气体输入。
3.例如在us 2010/0248995 a1中已经考虑增加进入振荡生物反应器的培养液中的空气输入，其中描述了具有特别形成的横截面的生物反应器。在该文献中显示，具有带多个倒圆边缘的横截面的反应器提供了相较于外表面上包括挡板的常用生物反应器来说明显更高的空气输入。已经表明最佳模式是看起来像花朵一样的横截面。
4.zhang xw,stettler m.等人在n biotechnol 35:68-75(2008)中描述了一种体积高达1000升的用于哺乳动物细胞的生物反应器，该反应器包括连接至容器壁内表面的螺旋轨道用来增加氧气供应。
5.zhu l.、song b.和wang z.在j.chem technol biotechnol 94:2212-2218(2019)中描述了一种由中空圆柱壁组成的生物反应器，其中细胞培养物在中空壁中进行轨道振荡。
6.本发明的目的是提供一种用于生物细胞培养物的生物反应器容器，其具有易于制备又有效地增加了进入细胞培养物的气体输入的配置。
7.该目的通过如权利要求中定义的生物反应器容器来实现。本发明提供的生物反应器在规定的气体条件下在生长生物细胞的过程中是有效的。
8.根据本说明书，“细胞培养物”是指任何生物细胞的培养物，例如，诸如细菌、古细菌、藻类、真菌(包括酵母)、病毒/噬菌体的微生物的培养物(与合适的宿主细胞一起)，人类或动物细胞(如哺乳动物、鸟类或昆虫细胞)或植物细胞的培养物。根据本发明，振荡培养物可以是悬浮细胞培养物或贴壁细胞培养物，其中优选悬浮培养物。特别是，微生物的悬浮培养物是本发明的焦点。
9.根据本发明，生物反应器容器(1)具有容器外壁(2)和底部(3)，并且还包括集成的内部结构(4)，内部结构(4)为所述容器的内部反应器空间提供至少两个额外的表面(4a)、(4b)，其中所述内部结构(4)与所述容器外壁(2)间隔开。
10.根据本发明，生物反应器容器(1)还可以包括多于一个的内部结构(4)，例如彼此包围或并排放置，其中所述内部结构可以具有相同的几何形式或可以彼此不同。如果将多于一个的内部结构(4)集成到生物反应器容器(1)中，则可以提供多于两个的额外的表面(4a)和(4b)。下面就一个集成的内部结构(4)来解释本发明的原理，然而，应当理解的是，可以将多于一个的这种内部结构(4)置于生物反应器容器(1)中，从而产生例如4、6、8个或更多个额外的表面。
11.应当理解的是，内部结构(4)以如下的方式置于反应器腔室的内部，即由容器(1)的容器外壁(2)包围的空间内(这里也称为“内部反应器空间”或简称为“反应器空间”)：包含在反应器腔室中的液体可以与所述内部结构(4)的至少两个表面(4a，4b)接触。
12.所述内部结构(4)可以包括提供外表面(4a)和内表面(4b)的壁，其中所述壁：(i)至少在最靠近底部(3)的区域内具有至少一个开孔(opening)(5)，或(ii)与底部(3)间隔开，或(iii)具有至少一个开孔并与底部(3)间隔开。术语“外表面”是指朝向容器外壁(2)的壁表面，“内表面”则朝向容器中心。
13.提供表面(4a)和(4b)的内部结构(4)的壁可以基本上具有与容器外壁(2)相同或相似的几何形状，使得提供表面(4a)和(4b)的壁基本上平行于容器外壁(2)在反应器内部空间内延伸。因此，例如，如果容器外壁(2)为圆柱形、圆锥形或椭圆形，则内部结构(4)的壁也可以优选为圆柱形、圆锥形或椭圆形。替代地，内部结构(4)和容器外壁(2)的形状可以不同，例如它们可以独立地选自圆柱形、圆锥形、椭圆形或任何其他合适的形状。此外，如果生物反应器容器(1)中存在多于一个的内部结构(4)，则存在于容器(1)中的多个内部结构(4)的形状可以相同或可以彼此不同。容器外壁(2)和(一个或多个)内部结构(4)的任何合适形状的组合应被视为落入本发明的定义的范围内。优选的形状是圆锥形、圆柱形和椭圆形，它们可以任意组合。例如，容器(1)的外壁(2)可以是圆锥形的并且内部结构(中的至少一个)可以是圆柱形或椭圆形的，容器(1)的外壁(2)可以是圆柱形的并且内部结构(中的至少一个)可以是圆锥形或椭圆形的。在一个优选的实施方案中，容器(1)的外壁(2)可以是圆锥形的，而内部结构(中的至少一个)可以是圆柱形的，或者反之亦然。在另一个优选的实施方案中，容器外壁(2)和至少一个具有提供所述表面(4a)和(4b)的壁的内部结构(4)二者是圆柱形的。
14.特别优选的是，提供表面(4a)和(4b)的内部结构(4)以如下的方式置于反应器空间内部：其使得在非操作状态下(不振荡时)包含在反应器空间中的液体可以至少分布/至少分布在容器(1)的底部(3)的整个区域，因此液体可以存在于反应器空间的整个横截面(根据填充高度)。
15.在其中内部结构(4)包括具有至少一个开孔(5)的壁的实施方案(i)中，特别优选的是，所述至少一个开孔(5)(例如一个、两个、三个或四个或更多个开孔(5))位于壁的最靠近底部(3)的区域中。“最靠近底部的区域”表示为朝底部(3)方向的壁的一半，优选朝底部(3)方向的壁的三分之一、更优选朝底部(3)方向的壁的四分之一或壁的五分之一。至少一个开孔(5)(或者，如果存在的话，两个、三个或四个或更多个开孔(5))可以置于内部结构的下端(与底部(3)接触的那端)，使得内部结构(4)与底部(3)之间的接触是不连续的从而存在于容器(1)中的液体可以进入内部结构(4)的内部空间。如果(一个或多个)开孔(5)位于内部结构(4)的下端，则优选开孔(5)具有如下的尺寸：该尺寸使得这些开孔允许液体进入/离开内部结构(4)的内部空间，但保留至少80％的在内部结构(4)的下端和底部(3)之间的接触面积，优选至少85％、更优选至少90％、至少95％且高达97％或甚至高达98％的在内部结构的下端和底部(3)之间的理论上可能的接触面积。因此，所述接触区域被开孔略微中断。这种结构的非限制性实施方案的实例在图1至8中示出。
16.所述开孔(5)可以具有选自代表圆形扇区的圆形、半圆形；代表卵形扇区的椭圆形、半椭圆形；三角形；矩形；多边形；波浪形或它们的任何组合的任何形状。
17.开孔(5)在任何方向上优选具有至少0.05mm或至少0.1mm的尺寸(在至少一个方向上的横截面)，例如至少0.2mm，至少0.3mm，至少0.5mm，至少0.7mm、0.8mm、0.9mm或至少1mm。应当理解的是，开孔的尺寸显然取决于生物反应器容器(1)的总尺寸。容器越大，则内部结构(4)和开孔(5)的尺寸就越大。因此，对于通常用于微升规模的微反应器，开孔(5)可能非常小，例如0.1mm或甚至更小，至多最大例如为0.5mm或0.8mm。对于为超过1000升培养液提供的大型反应器，开孔(5)的尺寸至多可达数厘米，例如在0.1cm至10cm、0.4cm至8cm、0.8cm至5cm或任何其他合适尺寸的范围内。应当理解的是，如果存在多于一个开孔，则并非所有开孔(5)都必须具有相同的大小/形状/尺寸，而是开孔可以彼此不同(但不是必须)。
18.因此，如果需要，根据生物反应器容器(1)的总尺寸，内部结构(4)的开孔(5)可以独立地具有提供在0.1mm至10cm范围内或甚至更低或更高的横截面的形状和尺寸。开孔(5)的尺寸仅受以下要求限制：允许容纳在容器(1)中的液体和细胞进入/离开内部结构(4)的内部空间，但要保持尽可能多的表面(4a)和(4b)的表面积。
19.如果存在多于一个开孔，则优选所述开孔(5)沿内部结构(4)的周向延伸不均匀地分布。如果存在多于一个开孔，则优选两个“相邻的”开孔沿圆周延伸以20至120
°
、25至90
°
或30至60
°
的角度设置，其中如果存在多于两个开孔，则开孔之间的所述角度不必相同。
20.在其中内部结构(4)与底部(3)间隔开的实施方案(ii)中，内部结构(4)不一定具有开孔(5)，但根据实施方案(iii)，则可以具有开孔。如果内部结构(4)与底部(3)间隔开，则该结构(4)可以例如通过保持结构(7)来固定，保持结构(7)的一端连接于内部结构(4)，而另一端可连接于底部(3)和/或连接于容器外壁(2)或任何其他合适的结构，例如连接于任何罩壳(6)。如果内部结构(4)与底部(3)间隔开，则应理解的是，“间隔开”是指在内部结构的下端和底部(3)之间存在一些自由空间，例如狭窄的缝。所述缝应狭窄到能够使液体和生长细胞通过，然而与生物反应器容器(1)中存在的全部液体相比，所述液体仅是非常少的量。因此，所述缝可以小至0.05mm，并且例如在容量超过1000升的容器(1)中，至多为2mm。应当理解的是，内部结构(4)的下端与底部(3)之间的空间的尺寸显然取决于生物反应器容器(1)的总尺寸。容器越大，则内部结构(4)的尺寸以及内部结构(4)的下端和底部(3)之间的空间的尺寸就越大。因此，对于通常用于微升规模的微反应器，该空间可能非常小，例如0.05mm或甚至更小，且至多最大例如为0.3mm。对于为超过1000升培养液所提供的大型反应器，内部结构(4)的下端和底部(3)之间的空间可以具有至多数毫米的尺寸，例如在0.5至2mm的范围内或任何其他合适的尺寸。因此，如果需要，根据生物反应器容器(1)的总尺寸，内部结构(4)的下端和底部(3)之间的空间可以具有0.05mm至2mm范围内、或者甚至更低或更高的尺寸。
21.内部结构(4)的开孔(5)的边缘/边界或内部结构(4)的下端的边缘/边界优选是倒圆的，使得没有尖锐的脊或缘，在所述脊或缘处在反应器腔室中生长的细胞可能被损坏或损伤。
22.根据本发明，内部结构为反应器内部空间提供至少两个额外的表面(4a，4b)。这两个额外的表面可以用内部结构(4)的壁的外表面(4a)和内表面(4b)表示。内部结构(4)还可以提供另外的壁和表面，但是在一个简单的实施方案中并且为了易于理解，这里就提供两个表面(4a)和(4b)的一个壁来解释本发明。提供额外表面的其他内部结构(4)可以增加这里描述的效果。
23.在反应器腔室内部提供至少两个额外的表面允许增加进入包含在生物反应器容器中的液体的气体输入，因为所述液体不仅与容器外壁(2)的内表面(2b)接触，而且进一步与所述额外的表面(4a,4b)接触，特别是与所述额外的表面4b接触。如果液体与表面接触，则由于粘附效应该液体沿所述表面铺展。如果进一步振荡、优选轨道振荡所述生物反应器容器，则液体在表面上弹跳并进一步沿着所述表面漂浮，由此增加了与存在于生物反应器容器中的气体接触的液体表面。随着表面(2b)、(4a)和(4b)所提供的表面积与液体体积之间的比率增加，这种效果就更加好了。可以理解的是，如果增加液体与气体之间的接触面积，则更多的气体可以进入液体。因此，如果与液体接触的面积容器(1)内部表面(表面(2b)、(4a)和(4b))的总表面积与总液体体积的比率增加，则弹跳和粘附/漂浮效应扩大了液体和气体之间的总接触面积。籍此，与额外的表面(4a)相比，额外的表面(4b)起主要作用，因为内表面(2b)和(4b)是在操作期间液体沿其流动的表面，即，对应于本体液体以“液体镰刀”形式振荡容器(1)。通过提供所述额外的表面(4b)，“液体镰刀”的数目增加，导致容器(1)的表面(2b，4b)与液体之间的接触面积增加，允许在容器的操作模式(振荡)期间液体沿着每个所述表面形成膜。
24.在一个优选的实施方案中，内部结构(4)提供了表面(4a,4b)，表面(4a,4b)的至少一部分平行于容器外壁(2)的内表面(2b)。更优选表面(4a,4b)中的至少一个平行于内表面(2b)，优选两者都平行于内表面(2b)。
25.生物反应器容器(1)可以具有任何通常已知的生物反应器容器的形状，例如容器外壁(2)可以具有圆柱形、圆锥形、椭圆形、卵形、三角形、矩形、多边形或任何其他规则或不规则的几何基本形状(视为其横截面)。内部结构(4)可以具有与容器外壁(2)相同或相似的形状，其中尺寸减小，或者内部结构(4)的形状与容器外壁(2)不同，但也是前面提到中的一种。优选地，至少内部结构(4)的形状由圆柱形、圆锥形或椭圆形横截面表示，更优选地，内部结构(4)和容器外壁(2)二者都具有这种圆柱形，圆锥形或椭圆形横截面，当两者都具有圆柱形时，则是高度优选的。
26.内部结构(4)与容器内壁(2b)间隔开以提供“反应器腔室的外圈部分”，“反应器腔室的外圈部分”是容器外壁(2)的内表面(2b)和内部结构(4)的外表面(4a)之间的空间。因此，该反应器腔室的外圈部分提供了两个与(细胞培养)液体接触的表面，即表面(2b)和(4a)。内部结构(4)的外表面(4a)与容器壁(2)的内表面(2b)之间的间隔优选地为总反应器腔室的横截面的至少1/15，或至少1/12，或至少1/10，但优选不超过总内部空间的横截面的1/3，更优选不超过1/4，甚至更优选不超过1/5或不超过1/8。在生物反应器容器(1)具有多于一个内部结构(4)的情况下，它们可以任何距离彼此间隔开，优选以如前所定义的距离，其中可能优选的是，所述(一个或多个)内部结构各自与“第一”内部结构(最靠近壁(2)的内部结构)到内表面(2b)的距离几乎相同。然而，从外壁(2)到容器(1)中心的距离也可以变化(增加或减少)。
27.在一个优选的实施方案中，所述内部结构(4)的外表面(4a)与容器外壁(2)的内表面(2b)间隔开一定距离，使得内部结构的横截面(cs
内
)与容器外壁的横截面(cs
外
)的比率在0.95至0.4的范围内，优选在0.92至0.5的范围内，更优选在0.9和0.55之间的范围内，且最优选在0.85至0.6的范围内，其中所述横截面分别在内表面(2b)和(4b)之间的空间中沿底部(3)测定。特别优选的是，容器外壁(2)和内部结构(4)都具有基本上圆柱形的形状。对于
容器中存在多于一个内部结构(4)的情况，可以假设相似的横截面比率，其中在这种情况下cs
内
对应于容器中更靠近容器中心的内部结构的横截面，而cs
外
表示更靠近外壁(2)的内部结构的横截面。
28.在具有上述定义的容器外壁(2)和内部结构(4)的尺寸/比率的生物反应器容器中，容器内部的气体交换条件是特别有利的。
29.在一个实施方案中，所述(一个或多个)内部结构可以具有5至1200mm的内部横截面cs
内
，其中所述大小取决于生物反应器容器(1)的整个尺寸。应当理解的是，所述(一个或多个)内部结构(4)的尺寸取决于生物反应器容器(1)的尺寸
30.本发明的生物反应器容器例如可以表示为容器、烧瓶、瓶子、管道、试管、杯子、细胞培养板或袋子形式的单个反应器，或者它可以是具有多个单独容器的多阵列的一部分，例如多孔板、细胞培养阵列或微量滴定板。生物反应器容器可以是待加载20μl至5ml范围的量的液体的非常小的反应器容器，但也可以是待加载大于5ml至约100ml的量的液体的小型反应器容器、待加载大于100ml至约2升的量的液体的中型反应器容器、待加载大于2升至例如10升的量的液体的大型反应器容器或待加载大于10升的量的液体的超大型反应器容器。这种容器的常见大小/尺寸对于技术人员来说是众所周知的。
31.生物反应器容器(1)特别是容器壁(2)和底部(3)以及内部结构(4)和任选的保持结构(7)可以由通常已知用于制备生物反应器的任何材料制成，像任何聚合物材料、玻璃或金属，但不限于上述材料。容器壁(2)、底部(3)以及内部结构(4)和任选的保持结构(7)可以由相同的材料或不同的材料制成，但是优选由相同的材料制成。优选地，生物反应器容器作为整体或其一部分由玻璃或塑料材料制成，所述塑料材料例如是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚醚、聚氯乙烯、聚醚砜或聚氨酯，但不限于所提及的聚合物材料，或由金属制成。玻璃是生物反应器容器(1)的优选材料。玻璃具有易润湿的亲水性表面，因此，如果在反应器容器的操作(振荡)期间液体沿玻璃表面流动，则由于玻璃的亲水性能，液体会在所述表面上形成膜，所述膜提供合适的高气体交换条件。替代地，生物反应器容器(1)可以由任何前述材料制成并且可以在内表面上(例如至少在表面2b和4b上)涂覆有亲水性涂布材料。
32.特别优选的是，至少表面(2b)、(4a)和(4b)是由亲水性大到在容器振荡期间包含在容器中的液体在所述表面上形成薄膜的材料制成，使得气体交换程度高。
33.生物反应器容器还可以包括覆盖物(6)。取决于生物反应器的类型，覆盖物可以是盖子、盖板、覆盖膜、封闭头、紧固件、塞子、覆盖帽或通常用于封闭生物反应器的任何其他合适的封闭方式，其中优选的是，所述覆盖物是透气的或允许气体进入反应器腔室。例如，微量滴定板、多孔板或培养皿通常由盖板、膜或薄膜封闭。容器、烧瓶、管子或瓶子通常由盖子、塞子、帽子或螺旋封闭装置封闭。
34.特别是如果覆盖物(6)将反应器腔室紧紧地封闭，则提供具有入口和/或出口从而允许添加或取出容器的任何内容物或将任何测量装置放置在容器内部的生物反应器容器(1)或覆盖物(6)可能是适合的。因此，可以经由入口将营养物、气体或液体添加到容器中，可以通过出口将感兴趣的内容物例如生长细胞取出，甚至以连续方式这样做。
35.本发明的生物反应器容器可用于涉及生物细胞生长的任何方法中，特别是在包含细胞培养物的液体中，其中需要使高气体输入进入与细胞接触的液体中。高度优选的生物反应器可用于振荡的液体细胞培养物。以此方式，气体可以是空气、氧气、二氧化碳、氮气、
包含它们中的至少一种的混合物或任何其他所需气体。气体优选是含氧气体，更优选气体是空气。
36.因此，本发明的一部分也是在限定的气体条件下生长生物细胞的方法，其中如以上公开内容中限定的生物反应器容器(1)提供有用于待生长的细胞并且至少部分地填充有液体培养基并且对其进行振荡使得至少所述液体在容器内部以旋转方式移动。优选的是，待生长的细胞是需氧细胞，然而，如果要生长厌氧生长细胞，则也可以使用本发明的生物反应器容器，只要必须确保在反应器腔室内提供合适的气体即可。生物反应器容器适用于悬浮细胞培养以及细胞层培养，但特别优选悬浮细胞培养。
37.为了培养细胞，用液体例如培养基填充容器(1)，其量使得在非操作状态下(容器不振荡时)内部结构(4)的至少50％的开孔(orifices)(5)、优选至少75％的开孔、甚至更优选至少90％的开孔且最优选所有开孔都浸入液体中。甚至优选的是，不仅开孔浸入液体中，而且液体与表面(4a)和(4b)接触的程度使得在旋转期间液体沿着所述表面流动，从而增加液体的总表面积。
38.附图：
39.在图1中，生物反应器容器(1)以倾斜的顶视图示出，生物反应器容器(1)包括具有外表面(2a)和内表面(2b)的容器外壁(2)、底部(3)和具有外表面(4a)和内表面(4b)的内部结构(4)以及三个周向分布在内部结构(4)下端处的开孔(5)。示出的生物反应器容器没有任何覆盖物(6)。
40.图2示出了与图1所提供的类似实施方案，其中开孔不是图1中的三角形的，而是正方形的，并且内部结构仅包括两个开孔。此外，在该图中，说明了如何定义容器(1)的横截面cs
外
和cs
内
。外横截面cs
外
对应于由容器外壁(2)的内表面(2b)限定的总横截面，内横截面cs
内
对应于由内部结构(4)的内表面(4b)限定的横截面。
41.图3以倾斜的顶视图示出了生物反应器容器(1)，其中通过保持结构(7)将内部结构(4)与底部(3)间隔开。
42.图4以横截面视图示出了生物反应器容器，所述生物反应器容器包括容器外壁(2)和内部结构(4)，内部结构(4)具有两个靠近底部的开孔(5)。生物反应器容器的外壁(2)和内部结构(4)具有不同的几何形状(外壁为“顶敞型”圆锥形，内部结构为圆柱形)。
43.图5以横截面视图示出了生物反应器容器，所述生物反应器容器包括容器外壁(2)和内部结构(4)，内部结构(4)具有一个靠近底部的开孔(5)。生物反应器容器的外壁(2)和内部结构(4)具有相同的几何形状，均为圆柱形，但是，内部结构(4)比外壁(2)更短。
44.图6以横截面视图示出了生物反应器容器，所述生物反应器容器包括容器外壁(2)和内部结构(4)，内部结构(4)具有两个靠近底部的开孔(5)。生物反应器容器的外壁(2)和内部结构(4)具有相同的几何形状，均为圆柱形，高度相同。
45.图7以横截面视图示出了生物反应器容器，所述生物反应器容器包括容器外壁(2)和内部结构(4)，内部结构(4)具有一个靠近底部的开孔(5)。生物反应器容器的外壁(2)和内部结构(4)具有不同的几何形状(外壁为圆柱形，内部结构为“顶敞型”圆锥形)。
46.图8以倾斜的侧视图示出了生物反应器容器，所述生物反应器容器包括容器外壁(2)和两个内部结构(4)，两个内部结构(4)都具有一个靠近底部(3)的开孔。生物反应器容器的外壁(2)和内部结构(4)都具有相同的几何形状。
47.图9图示了与普通生物反应器容器相比，进入不同体积的液体中的氧传递速率(容量)，所述液体在根据本发明的生物反应器容器(参见实施例1和2)中振荡。
48.图10图示了进入液体中的氧传递的改善，所述液体在根据本发明的生物反应器容器(参见实施例1和2)中振荡。
49.图11图示了进入液体中的氧传递速率(容量)，所述液体在以不同转速的根据本发明的生物反应器容器(参见实施例1和3)中振荡。
实施例
50.实施例1：实验设计：
51.用玻璃制备具有以下尺寸的三种类型的圆柱形生物反应器容器：
[0052][0053]
is＝内部结构(圆柱形)
[0054]
*4个开孔，每个都是正方形，在内部结构的下端切割
[0055]
生物反应器容器a、b、c已分别填充有如下定义的相同的液体体积(v
l
)，并在21℃下在需氧(空气)条件下振荡。如hermann r.等人于2001年9月5日发表于biotechnology and bioengineering,vol 74,no.5(john wiley&sons,inc)的论文“optical method for the determination of the oxygen-transfer capacity of small bioreactors based on sulfite oxidation”中所详述通过亚硫酸盐氧化法测定氧传递速率。
[0056]
实验配置：
[0057]
0.5m亚硫酸盐氧化法，并检测颜色变化：
[0058]
振荡器：k
ü
hner lab shaker lsr-v-12.5,振荡直径d0＝25mm
[0059]
亚硫酸盐体系：0.5m naso3(bernd kraft,duisburg,germany)，在12mm脱气磷酸盐缓冲液中(得自0.5m na2hpo4·
2h2o和0.5m nah2po4·
2h2o(roth,karlsruhe，germany)，2.4*10-5
m溴百里酚蓝(sigma-aldrich,steinheim germany)，用30％h2so4(w/w)(bernd kraft,duisburg,germany)调节至ph 8，10-7
m coso4·
7h2o(sigma-aldrich,steinheim germany)
[0060]
无菌封闭装置：用于ultra yield 2.5l flask的thomson ultra yield flask airotop enhanced seal(thomson instrument company,oceanside,usa)
[0061]
相机：samsung galaxy a3(2016)，采用“intervalcam”应用程序
[0062][0063][0064]
t
ox
＝直到反应结束的时间(颜色变化)
[0065]vo2
＝氧气的化学计量系数(0.5)
[0066]cso3
＝使用的亚硫酸盐的量
[0067]
在显示本发明实施例结果的图表(图9至11)中，将内部结构称作“管子”。
[0068]
otr
max
：最大氧传递速率(容量)
[0069]
实施例2：根据填充体积v
l
确定otr
max
[0070]
在第一种方法中，根据具有上述尺寸的生物反应器容器的填充体积来考虑传递进入液体中的氧气。通常，当体积增加时，氧传递容量会降低，因为氧传递主要发生在与气体接触的液体表面处。如果液体提供在相同尺寸的容器中(只要容器的整个底部被覆盖)，则液体体积越小，液体表面与液体体积的比率就越大。这里，考虑容器设计如何影响氧传递容量。
[0071]
已对以下样品进行(分别以容器设计a、b、c的方式)测试
[0072]
1.v
l
＝5ml，以转速250rpm振荡；
[0073]
2.v
l
＝10ml，以转速250rpm振荡；
[0074]
3.v
l
＝15ml，以转速250rpm振荡；
[0075]
4.v
l
＝10ml，以转速300rpm振荡；
[0076]
5.v
l
＝15ml，以转速300rpm振荡。
[0077]
图9示出了在两种转速(图9a：250rpm，图9b：300rpm)下依赖于容器填充体积的氧传递容量的结果。可以看出，由于内部结构(“管子”)的存在，氧传递速率增加，其中容器外壁和内部结构之间的窄间隙提高了otr
max
，明显比更宽的间隙的otr
max
更大。增加转速会显著增加氧传递速率(将图9a与图9b进行比较)。
[0078]
图10示出了可通过包含内部结构(管子)获得的氧传递的改善程度：在图10a中可以清楚地看到，在250rpm下，在更高的体积下可获得的氧传递改善要强得多，在宽间隙容器和窄间隙容器中都是如此。在300rpm下，可获得的改善几乎与填充体积无关，见图10b。这两张图都表明，采用较小的外壁与内部结构之间的距离(窄间隙)可获得的改善明显高于采用较大的距离(宽间隙)可获得的改善。然而，与没有任何内部结构的生物反应器相比，这两种设计对氧传递都有明显的积极影响。
[0079]
实施例3：根据转速n确定otr
max
[0080]
此外，已根据具有上述尺寸的生物反应器容器的转速(n)来考虑传递进入液体中的氧气传递。基本上已知，当转速增加时，氧传递容量增加，由于液体沿着容器的内壁表面
弹跳和流动的程度更高，因此通过在所述壁的内表面上形成膜来增加液体表面积。由于氧传递主要发生在与气体接触的液体表面处，因此当所述表面增加时气体交换增加。
[0081]
图11a示出了样品2和4的所述氧传递的改善，图11b示出了样品3和5的所述氧传递的改善。可以看出，在两种转速下，提供额外表面的内部结构的提供都增加了传递进入液体中的氧气。更窄间隙的更强效果可以由提供更大面积的额外内表面(内部结构的内表面)以形成液膜来解释。
[0082]
上述实施例中所示的生物反应器容器的尺寸和设计应视为说明性的。本文定义的具体尺寸可以变化。实际上，可以制备具有更大或更小尺寸的生物反应器容器，然而，特别优选的是，尺寸的比例，尤其是壁、空间、横截面的比例以及开孔的尺寸基本上对应于本文所述的尺寸。