一种用虹鳟鱼肝S9亚细胞组分RT-S9测定体外固有清除率的方法

一种用虹鳟鱼肝s9亚细胞组分rt-s9测定体外固有清除率的方法
技术领域
1.本发明属于环境生态毒理学领域，具体涉及一种用虹鳟鱼肝s9亚细胞组分rt-s9测定体外固有清除率的方法。


背景技术：

2.随着工业化进程的持续推进，新污染物(emerging contaminants)不断被产生并释放到生态环境中。为避免具有持久性有机污染物和高富集物质(pbt/vpvb)进入环境，化学品管理机构加强源头管控，要求新化学物质登记需进行大量的实验和研究以完成环境风险评估。为了促进非动物测试方法和其他替代方法的发展，欧美各国已开始关注有害结局路径(aop)框架下所强调的作用机制，并开发了一系列体外替代方法。在reach法规下，脊椎动物试验只能作为获取数据最后的方法。然而，到目前为止我国对化学品和农药的安全性评价仍以动物实验为主的风险评估导向。
3.化学品的生物富集性评估是监管环境风险和危害评估的一个基本和强制性的部分。传统的生物富集实验周期长至数周或数月，且需要使用较多的试验鱼，成本高。尽管根据体外数据预测的生物富集系数可能无法完全替代体内鱼类生物富集试验的结果，但体外试验具有周期短、动物使用量少等明显优势。因此，当体内测试技术不可行(如针对水溶性极低的化合物)，或相应的监管框架不允许脊椎动物测试时，体外试验成为了重要的替代方法。到目前为止较常用的体外替代方法是用qasr模型预测鱼体生物富集系数(bioconcentration factors,bcfs)。qasr模型的建立是基于受试物的分配系数正辛醇/水(k
ow
)，通常不考虑鱼类代谢对固有清除率的贡献，因此其预测结果往往与实验得到的生物富集结果存在较大差异。
4.研究发现，鱼类肝脏是参与新陈代谢的重要器官之一，肝脏中的各种酶发挥着重要作用。肝切片、s9亚细胞组分和肝细胞可有效的避免体内研究的高成本和技术挑战，包含着参与代谢的重要酶类，如细胞色素p450家族(水解酶、还原酶、结合酶等)参与催化阶段ⅰ反应和通过转移酶参与催化阶段ⅱ的反应，从而实现了有机污染物的活化或者解毒过程，可提供外源性肝代谢率，被认为是研究外源性生物转化的有用模型。由于肝组织亚组分体外代谢途径与体内肝代谢更接近，具有不同的复杂程度来评估酶转化的潜力，由此获得的体外数据可以更真实地了解鱼类生物转化反应和清除途径，从而提高体外至体内外推法(in vitro to in vivo，ivive)评估化学品在鱼类体内生物富集的准确性，优化现有化学品在鱼体内生物累积的计算机模拟方法，提高预测结果的准确性和可利用性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用虹鳟鱼肝s9亚细胞组分rt-s9测定体外固有清除率的方法。该方法是以虹鳟鱼或其他合适鱼的肝s9亚细胞组分评估有机化合物体外生物转化作用并获得体外固有清除率，通过外推方法或模型获得有机物的生物富集系数
(bioconcentration factors，bcfs)。
6.本发明采用的技术方案为：
7.一种用虹鳟鱼肝s9亚细胞组分rt-s9测定体外固有清除率的方法，包括以下步骤：将rt-s9、混合辅助因子、磷酸盐缓冲液按一定体积比混合，然后添加待测受试物或参比物，在10℃～12℃下培养，于不同的时间点取样，将样品与终止液混合后停止反应，测定样品中受试物浓度，将受试物浓度进行对数转换后对时间作图，获得对数下降曲线，根据对数下降曲线的斜率、rt-s9浓度求得受试物的体外固有清除率，其公式为：
[0008][0009]
上式中，cl,
in vitro,int
：体外固有清除率；
[0010]crt-s9
蛋白质浓度：培养体系中rt-s9蛋白浓度；
[0011]
ke：一级清除常数，由-2.3
×
对数下降曲线的斜率获得。
[0012]
优选的，所述的磷酸盐缓冲液为ph7.8 100mm磷酸钾缓冲液。
[0013]
优选的，所述的混合辅助因子是由250μl/ml丙甲甘肽、20mm nadph、20mm udpga、50mm gsh、1mm paps按等体积比混合得到。
[0014]
优选的，反应体系中rt-s9蛋白终浓度为0.25mg/l-2.0mg/l，一般推荐为1.0mg/l，反应体系中蛋白质具体浓度需通过预试验摸索获得。
[0015]
优选的，所述的rt-s9、混合辅助因子、磷酸盐缓冲液混合的体积比为1:5:4。
[0016]
优选的，所述的参比物选自芘、壬基酚、甲氧滴滴涕、倍硫磷中的至少一种。
[0017]
优选的，根据受试物分析方法选择终止溶液，所述的终止液如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁醚等。
[0018]
优选的，所述的方法是以酶促失活的rt-s9作为底物消耗的阴性对照材料，来区分生物转化和非生物的减少，失活rt-s9在测试过程中待测受试物或参比物的损失量＜20％。
[0019]
优选的，所述的方法至少测定6个时间点的受试物浓度确定受试物的体外固有清除率。
[0020]
优选的，所述的方法至少进行2次独立试验，若回归计算结果具有显著差异，则应进行第三次试验以获验证相关结果。
[0021]
本发明方法的原理是：受试化合物的体外固有清除率(cl,
in vitro,int
)，用底物清除法来测定。培养体系由rt-s9和磷酸钾缓冲液，辅助因子和丙甲甘肽组成，可作用于ⅰ期和ⅱ期生物转化酶，反应以添加受试物作为启动信号。为了在不同的时间点收集样品，通过将该悬浮液的试样转移到终止溶液中从而终止反应。受试物的浓度随着时间的推移而降低，通过受试物浓度变化计算体外固有清除率(cl,
in vitro,int
)。使用失活rt-s9来区分生物转化和非生物的减少。
[0022]
本发明以虹鳟鱼肝细胞亚组分(rainbow trout liver s9 sub-cellular fraction,rt-s9)作为试验对象，其他适合的鱼类亦可用于本发明。本发明主要目的是通过肝细胞体外试验获得有机物的生物清除率，进而外推至动物全身，用于预测有机化合物生物富集系数，为建立预测数据库提供信息。
附图说明
[0023]
图1为受试物浓度分析的取样方法(单瓶法)。
[0024]
图2为受试物浓度分析的取样方法(多瓶法)。
[0025]
图3为实施例2的底物(受试物)的清除曲线。
具体实施方式
[0026]
以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。
[0027]
实施例1
[0028]
1、肝细胞亚组分(rt-s9)的获取
[0029]
肝脏s9亚细胞组分可从虹鳟鱼及其他合适的鱼类中获取。新鲜制备或者购买的rt-s9在液氮或-80
±
1℃冰箱中储存，至少可保存2年。
[0030]
2、rt-s9活性评价和含量的确定
[0031]
(1)酶活性评价
[0032]
试验前需对每批次rt-s9活性进行评估，以达到催化阶段ⅰ和催化阶段ⅱ酶反应质控要求。评价催化阶段ⅰ如细胞色素p450家族(cytochrome p450,cyp)和催化阶段ⅱ转移酶如谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,gst)、磺基转移酶(sulfotransferases,sult)、尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferases,ugt)等的活性，用于评估rt-s9是否达到能力质控要求。
[0033]
其中脱乙基酶(ethoxyresorufin-o-deethylase activity,erod)活性、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase activity,ugt)活性、谷胱甘肽转移酶(glutathione-s-transferase activity,gst)活性分别为5.49
±
0.44pmol/min/mg protein,1178
±
109pmol/min/mg protein和889
±
159pmol/min/mg protein.
[0034]
以上的数据仅限于某一批次的rt-s9相关酶活性数据，包括但不限于以上结果，需要结合参比物结果加以评估。
[0035]
(2)蛋白质含量
[0036]
试验前需测定每批次rt-s9的蛋白质含量，以便配制一定蛋白质浓度的rt-s9。
[0037]
3、测试受试物质的配制
[0038]
受试物溶液通常用ph 7.8的磷酸钾缓冲液配制或能与水混溶的有机溶剂(乙腈、丙酮和甲醇等)配制，如采用有机溶剂，其总含量不应超过1％，以免抑制酶活性。受试物的添加量或者配制浓度取决于分析方法的精确度。
[0039]
4、反应体系相关试剂的配制和辅助因子的混合
[0040]
(1)丙甲甘肽溶液的配制：称取5mg丙甲甘肽至装有500μl甲醇的1.5ml离心管中，充分溶解后，将其分装至1.5ml离心管，每个离心管分装25μl，置于-20℃条件下保存。配制丙甲甘肽使用液(250μg/ml)：25μl丙甲甘肽贮备液 975μl ph 7.8磷酸缓冲液。
[0041]
(2)制备酶促失活的rt-s9：酶促失活的rt-s9作为底物消耗的阴性对照材料，将其置于加盖的小瓶中并于沸水中加热失活，也可使用手持式均质器处理以获得酶促失活材料。沸水灭活如遇凝集，转移至均质器均质，用ph 7.8磷酸钾缓存液稀释至10mg/ml。亦可常
温放置24h使其失活。将酶促失活材料置于-80
±
1℃保存。
[0042]
酶促失活的rt-s9在本发明方法中是用来区分生物转化和非生物的减少，失活rt-s9在测试过程中待测受试物或参比物的损失量＜20％。
[0043]
(3)配制具有活性的rt-s9：混合培养物中rt-s9蛋白的终浓度宜在0.25-2mg/ml范围内，通常为1.0mg/ml。为了符合一级动力学要求，通常需要通过预试验确定测试底物(受试物)和蛋白质的浓度。
[0044]
(4)混合辅助因子
[0045]
用5ml离心管配制酶辅助因子，酶辅助因子置于冰水中储存。以单瓶法为例，分装400μl酶辅助因子至7ml闪烁管中，加入100μl丙甲甘肽使用液(250μg/ml)，得到500μl混合辅助因子。其中，酶辅助因子由以下体积及浓度的成分混合：
[0046]
500μl 20mmβ-腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐(nadph)
[0047]
500μl 20mm尿苷-5-二磷酸葡萄糖醛酸三钠盐(udpga)
[0048]
500μl 50mm谷胱甘肽(gsh)
[0049]
500μl 1mm 3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(paps)
[0050]
注：用ph8.0磷酸钾缓冲液中配制paps，其余用ph7.8的磷酸钾缓冲液配制。
[0051]
(5)反应体系的配制
[0052]
以7ml闪烁管为例的混合反应体系为：
[0053]
①
400μl 100mm ph7.8磷酸钾缓冲液(提前恒温，如11
±
1℃)
[0054]
②
加入100μl，250μg/ml丙甲甘肽使用液(终浓度为25μg/ml)
[0055]
③
400μl混合辅助因子，其终浓度如下：
[0056]
100μl 20mm nadph(终浓度为2mm)
[0057]
100μl 20mm udpga(终浓度为2mm)
[0058]
100μl 50mm gsh(终浓度为5mm)
[0059]
100μl 1mm paps(终浓度为0.1mm)
[0060]
④
100μl预稀释活性rt-s9或非酶活性rt-s9(终浓度为0.25-2.0mg/ml，推荐1.0mg/l)
[0061]
将上述的
①②③④
培养体系共1000μl轻轻混合均匀，在一定温度(如11
±
1℃)条件下预温育10分钟。
[0062]
(6)添加测试受试物或参比物启动反应
[0063]
本发明推荐使用芘、壬基酚、甲氧滴滴涕或倍硫磷作为参比物，其操作程序与受试物试验一致。通常在培养体系中添加如5μl，1μm测试受试物溶液(底物)，旋转小瓶以分散化学品并松散盖上盖子。受试物的添加量需考虑分析方法的检测限、定量限，可通过预试验确定添加量，以达到精确的底物消耗。为了获得一个可用于体外到体内外推模型的化学消耗速率，通常希望在测试过程实现清除率达到20％-90％。为此，需要调整的变量包括rt-s9蛋白质浓度(如在反应体系中其终浓度范围为0.25-2mg/ml)、测试开始时受试物浓度和总孵育时间(一般不超过2小时，对于转化很慢的测试底物，最多4小时)。
[0064]
(7)受试物(底物)浓度的分析
[0065]
对于易测试的化学物质(如无挥发性、不黏附于容器壁、能在培养体系中迅速分布)推荐使用单瓶法；对于疏水性、挥发性的受试物，推荐使用多瓶法。通过预试验在指定时
间点取样分析，如2min、10min、20min、30min、60min、90min、120min取样测试底物浓度变化。至少需要6个时间点确定体外固有清除率(cl,
in vitro,int
)，以获得较好的回归方程和斜率。
[0066]
在指定时间点取样，将孵育小瓶从水浴或培养箱中取出，轻轻旋转或摇动，用移液管取出等分试样(例如100μl)并直接装入置于冰上含有终止溶液的1.5ml微型离心管中。
[0067]
可预先添加终止溶液(如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁醚)至1.5ml微量离心管中，再添加样品(如100μl被终止样品添加到400μl终止溶液中)，置于冰上保存。对于挥发性溶剂(在室温下挥发的溶剂，如二氯甲烷，甲基叔丁醚)，应盖紧和冷藏，或者在采样前先直接添加溶剂。对于某些与塑料发生反应的溶剂，应采用玻璃管。如果使用与水混溶的溶剂作为终止溶液，离心前将样品冷藏过夜将有助于促进蛋白质的完全沉淀。如果使用挥发性溶剂如二氯甲烷和甲基叔丁醚，样品必须经过提取，在可能的情况下，在停止反应后直接提取。
[0068]
如采用单瓶法，每个试验至少包含2个独立运行的试验瓶用于测定体外固有清除率cl,
in vitro,int,
，每个试验瓶可在同一天或不同天运行。若2次独立试验的回归计算结果具有显著差异(如t检验，p《0.05)，则应进行第三次试验以获验证相关结果。
[0069]
采用单瓶法，受试物浓度分析的取样方法见图1。
[0070]
采用多瓶法，受试物浓度分析的取样方法见图2。
[0071]
(8)分析方法
[0072]
采用经过验证的分析方法测定样品中受试物浓度。由于受试物分析方法的准确性、精密度、灵敏度、回收率严重影响试验结果的准确性和可靠性，因此需事先进行验证，方法验证中受试物的回收率应达到70％-120％。
[0073]
5、数据统计分析
[0074]
将受试物浓度进行对数转换后(log10转换的底物浓度)对时间作图，应呈现对数线性下降(r2》0.85)。如果回归检验出现明显的离群值，则可使用统计上有效的离群检验去除虚假数据点，并记录去掉的理由。消耗速率应该从曲线的线性范围上确定，应至少有6个数据点。
[0075]
一级清除常数，ke(h-1
)，由-2.3
×
对数下降曲线的斜率获得。体外固有清除率cl,
in vitro,int
计算公式为：
[0076][0077]
上式中，cl,
in vitro,int
：体外固有清除率，单位：ml/h/mg蛋白；
[0078]crt-s9
蛋白质浓度：培养体系中rt-s9蛋白浓度，单位：mg/ml；
[0079]
ke：一级清除常数，ke(h-1
)，由-2.3
×
对数下降曲线的斜率获得。
[0080]
通过获得体外固有清除率，根据以下公式计算获得体内固有清除率：
[0081]
cl
in vivo,int
＝cl
invitro,int
×
l
s9
×
l
fbw
×
24
ꢀꢀꢀ
(2)
[0082]
其中cl
in vivo,int
：体内固有清除率，l/d/kg鱼；
[0083]
l
s9
:肝脏组织中s9含量，mg/g肝，以163mg/g计算；
[0084]
l
fbw
：鱼体中肝脏含量，g肝/g鱼体，以0.15g/g计算。
[0085]
实施例2
[0086]
本实施例选择1种受试物和参比物芘进行体外清除实验，相关方法和结果如下：
[0087]
1、体外清除试验相关方法
[0088]
①
本试验选择某一受试物作为清除评估对象，该受试物在鱼体中生物富集系数bcfss＝2451，分子量366.46，分子式c
26h22
o2，logkow＝4.35。以芘(pyrene,别名：嵌二萘)为参比物，cas no：129-00-0，分子量：202.26，logkow＝4.88。
[0089]
②
试验以7ml闪烁管混合反应体系，按照单瓶方法混合辅助因子、rt-s9、磷酸缓冲液，分别添加5μl受试物和参比物，受试物终浓度为1.83mg/l和参比物终浓度为0.025mg/l，同时设计1个酶促失活的受试物浓度组，相关溶液的配制参见实施例1。
[0090]
③
底物试验组采样时间点为2min,10min，20min，30min,40min，50min,60min；参比物芘采样时间点分别为2min,4min，6min，8min,10min，12min,14min。于每个采样时间点，取100μl反应体系至400μl冰冻乙腈中以终止反应。将以上样品冰箱中冷藏过夜后，12000rpm/min,10min，收集上清液用于受试物和参比物浓度分析。
[0091]
2、体外试验相关结果
[0092]
添加受试物后rt-s9被快速激活而启动，其活性成分使底物(受试物)不断发生体外生物转化作用，底物实测浓度不断下降，底物清除曲线见下图3。其相关系数r2＝0.9683，大于0.85，说明底物(受试物)与酶达到较好的饱和，符合一级动力学。以受试物实测浓度对数作图，通过斜率计算的体外固有清除率cl,
in vitro,int
为0.0099ml/h/mg蛋白，由此计算的体内固有清除速率cl
in vivo,int
为0.580l/d/kg鱼。生物富集系数推导计算结果为1059，相关推导结果和公式见下表1。
[0093]
表1预测生物富集系数涉及的参数计算结果
[0094][0095][0096]
注：以上推导过程涉及参数设置，不同参数设置和定义会对结果造成细微差别。
[0097]
以测试底物开展的对稀有鮈鲫的生物富集：流水式试验获得稳定态生物富集系数bcf
ss
为2451，而通过qasr模型预测的结果为248；由于qasr模型预测原理主要基于分配系数的定量结构活性关系评估，缺乏体外相关转化数据，难免使其预测结果存在偏离。利用虹鳟鱼肝亚细胞组分(rt-s9)获得体外清除率计算获得bcf
tot
为1059，涉及肝酶活性诱导的相关体外生物转化作用，其推测的结果与实验室真实暴露获得结果更接近，而由于物种差异性仍具差距。
[0098]
虹鳟鱼肝细胞体外实验虽不能完全取代经典的生物富集实验，由于其获得结果更接近经典实验获得的生物富集系数，且周期不足2小时，其结果仍具有较大的参考价值，可为建立数据库预测模型提供更多的数据。考虑3r原则，在reach法规下，脊椎动物试验只能作为获取数据最后的方法，而echa的目的也是希望促进非动物测试方法和其他替代方法的发展，因此体外试验需要进一步研究和建立，以尽可能取代、减少和完善体内研究。此外，根据体外数据预测的生物浓缩系数可能无法完全替代体内鱼类生物累积试验，然而，如果体内测试在技术上不可行，或者如果相应的监管框架不允许脊椎动物测试，它们提供了一种替代方法。
[0099]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。