一种抑制马拉色菌的多粘类芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及医药与日化领域，具体涉及一种抑制马拉色菌的多粘类芽孢杆菌，及其在医药领域与日化领域上的应用。


背景技术：

2.马拉色菌是一种条件致病菌，在人群皮肤毛发样品中可以检出，有些未展现危害，但当某些内外条件改变时会引起马拉色菌过度繁殖，导致花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病，严重影响人们的生活质量，同时给人们造成精神困扰。因此寻找一种能够抑制马拉色菌过度繁殖的药物刻不容缓。酮康唑、伊曲康唑等唑类抗真菌剂曾因效果明显而备受患者们的青睐，但随着时间的推移，人们发现此类药物存在副作用大、容易复发等问题，一些新型的抗马拉色菌制剂开发也在不断探索中(朱敏.中草药及其单体抗马拉色菌作用的研究[d].复旦大学,2003)。
[0003]
作为类芽孢杆菌属的模式菌，多粘类芽孢杆菌具有革兰氏染色呈阳性、好氧或兼性厌氧、能产生芽孢、抗逆性强等特点(和林松,陶玲庆,韦露萍,等.多粘类芽孢杆菌胞外多糖的功能研究进展[j].安徽农学通报,2022,28(06):41-45.)，在自然界中广泛存在。近些年来多粘类芽孢杆菌的研究主要集中于以下两个方面：一是多粘类芽孢杆菌本身在生物防治方面上的应用，抑制植物病原菌贮藏腐败菌，例如防治小麦赤霉病、燕麦根腐病和葡萄霜霉病等；二是其生产的胞外多糖、抗菌肽为代表的代谢产物所具有的生理功能，包括抑菌特性、抗氧化性、免疫活性和抗肿瘤活性等。综合前人研究，尚未发现多粘类芽孢杆菌在抑制马拉色菌方面的报道。
[0004]
近期nature子刊中的一篇文章介绍一种新的皮肤病治疗模式，该模式认为特征性皮炎等皮肤疾病处于菌群失调的状态，应该在皮肤上重新接种有益微生物去治疗，而不是使用药物(schmidt c.out of your skin[j].nature biotechnology, 2020,38(4):392-397.)。该治疗模式受到了较大的关注，不少公司或科研团队纷纷投入其中，例如美国的matrisys biosciences公司。该公司声称其开发的人葡萄球菌制剂可以通过抑制金黄色葡萄球菌的生长用于治疗特征性皮炎。目前皮肤微生态研究是化妆品公司为主导。多家化妆品公司瞄准微生态化妆品市场，将皮肤微生态作为研发的焦点，以益生菌、益生元、后生元等作为研究对象，希望开发出具有显著护肤效果的洗化产品。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种能够抑制马拉色菌的多粘类芽孢杆菌，使其能在医药领域和日化领域能作为益生菌调节皮肤微生态，从而为治疗或缓解某些皮肤问题提供新方案，扩展芽孢杆菌在日化和医药领域应用。
[0006]
本发明公开了一种抑制马拉色菌的多粘类芽孢杆菌jwyb12，其经过16s rdna菌种鉴定确定为多粘类芽孢杆菌，现保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no：24850，保藏日期为2022年5月9 日。体外抑菌实验显示多粘类芽孢杆菌
对马拉色菌的抑制作用明显。
[0007]
本发明进一步提供了一种基于上述多粘类芽孢杆菌的发酵方法，其包括如下步骤：
[0008]
1)将冻存的多粘类芽孢杆菌取出，于lb固体培养基上划线培养，置于28-37℃培养箱中16-24h；划取固体培养基上的单菌落，于发酵液体培养基中，28-37℃、 150-200rpm摇床培养16-24h后完成活化；
[0009]
2)取活化好的多粘类芽孢杆菌，按照1-3％的接种比例接种到发酵液体培养基中，28-37℃、150-200rpm摇床培养36-48h后取出；得到发酵液。
[0010]
进一步地，所涉及到的多粘类芽孢杆菌的发酵液体培养基的配方如下：蔗糖 50g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母浸粉1g/l，磷酸氢二钠3g/l，115℃高温灭菌20min。
[0011]
进一步地，所涉及到的多粘类芽孢杆菌的lb固体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂20g/l，121℃高温灭菌15min。
[0012]
优选地，所涉及到的多粘类芽孢杆菌的培养温度是30℃。
[0013]
本发明还提出了该多粘类芽孢杆菌在医药领域上预防和治疗相关皮肤疾病方面的应用。
[0014]
进一步地，相关皮肤疾病是指因马拉色菌过度繁殖导致的皮肤病，例如花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等。
[0015]
进一步地，可将该多粘类芽孢杆菌制成多种形式的药物，例如口服药、外用药和注射剂等。
[0016]
优选地，将该多粘类芽孢杆菌制成外用药。
[0017]
此外，本发明提出该多粘类芽孢杆菌在日化领域上关于护肤的洗化产品应用。
[0018]
进一步地，洗化产品的形式包括但不限于洗发水、护发素、沐浴露、洗面奶、面膜等。
[0019]
本发明进一步提供了一种马拉色菌抑制剂，其包括上述的多粘类芽孢杆菌，或上述发方法得到的发酵液，或基于上述发酵液制备的产物。
[0020]
进一步的，所述的基于发酵液制备的产物的制备方法为：将上述发酵方法所得的发酵液离心吸去上清液，加入相同体积的生理盐水吹打混匀后配成原菌液。
[0021]
进一步的，马拉色菌抑制剂中多粘类芽孢杆菌的浓度不低于1.7
×
10
4 cfu/ml。
[0022]
本发明的优点包括以下几点：
[0023]
(1)多粘类芽孢杆菌作为常见的生防菌，安全性较高；
[0024]
(2)体外抑菌实验得到的抑菌圈较大，作用明显；
[0025]
(3)该多粘类芽孢杆菌的生长繁殖较为容易，生产成本较低、工艺简单、速度较快。
[0026]
(4)不涉及到有毒有害的化学物质，绿色环保。
[0027]
图表说明
[0028]
图1多粘类芽孢杆菌jwyb12与相似菌株16s rdna序列的系统发育树。
[0029]
图2不同浓度的多粘类芽孢杆菌jwyb12对马拉色菌的抑制作用(阴性对照：无菌水；阳性对照：酮康唑1g/l)。
具体实施方式
[0030]
下面是对本发明的实例作详细说明。
[0031]
实例1：多粘类芽孢杆菌对马拉色菌的抑制作用。
[0032]
1.多粘类芽孢杆菌jwyb12：
[0033]
(1)菌株来源：多粘类芽孢杆菌jwyb12分离自牛饲料。其具体分离方法为在生理盐水中加入少量粉状饲料过夜放置；随后80℃下水浴10min，吸取100 μl菌液涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基，置于37℃培养24h；最后挑取固体培养基上的单菌落镜检，镜检合格后保藏。
[0034]
(2)菌种鉴定：经16s rdna菌种测序得到长度为1463bp的序列，将其在 ncbi进行blast比对，使用mega软件作系统发育分析。结果如图1所示，鉴定该菌为多粘类芽孢杆菌。
[0035]
(3)培养基配方：将蔗糖50g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钠 3g添加到1l蒸馏水中，灭菌锅115℃灭菌20min得到发酵液体培养基；将胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g添加到1l蒸馏水中，灭菌锅121℃灭菌15min得到lb固体培养基。
[0036]
(4)活化：将冻存于-80℃冰箱中的多粘类芽孢杆菌取出，轻沾一下于lb 固体培养基上划线培养，置于30℃培养箱中24h。划取lb固体培养基上的单菌落，于发酵液体培养基中，30℃、180rpm摇床培养24h后即可活化完成。
[0037]
2.限制马拉色菌(malassezia restricta)：
[0038]
(1)来源：该马拉色菌购自北纳生物。
[0039]
(2)活化：培养基使用商品化的ym液体培养基，ym固体培养基则需要在ym液体培养基的基础上额外添加2％的琼脂。沾取少量冻存在-80℃冰箱的马拉色菌于ym固体培养基上划线，30℃培养48h即可完成活化。
[0040]
3.体外抑制实验：
[0041]
(1)多粘类芽孢杆菌处理：取活化好的多粘类芽孢杆菌，按照2％的接种比例接种到发酵液体培养基中，30℃、180rpm摇床培养48h后取出。所得发酵液于冷冻离心机中4℃、4000rpm离心10min后吸去上清液，加入相同体积的生理盐水吹打混匀后配成原菌液待用。并利用生理盐水将其稀释5倍、10倍、20倍、 50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍得到不同浓度的菌液待用。将原菌液稀释到合适的倍数，取100μl菌悬液于lb固体培养基上涂布计数。
[0042]
(2)限制马拉色菌处理：沾取少量活化的马拉色菌单菌落，置于适量无菌生理盐水中，振荡混匀。利用血细胞计数板测量马拉色菌的浓度，然后将其浓度调整到其菌浓度大致为1.0
×
106cfu/ml。取400μl菌悬液均匀涂布在ym固体培养基上。
[0043]
(3)体外抑菌实验：采用打孔法，在无菌条件下，用灭过菌的打孔器在每个涂过马拉色菌的ym固体培养基上打孔，用镊子将多余培养基取出。将不同浓度的多粘类芽孢杆菌菌液添加到打好的孔洞中，每个加样量为10μl，重复3 次。放到30℃的培养箱中培养，3d后测定抑菌圈的大小。生理盐水做阴性对照， 1g/l酮康唑做阳性对照。
[0044]
4.结果与分析：
[0045]
为筛选获得对马拉色菌抑制效果较好的菌株，同期进行多种菌株对马拉色菌的体外平板抑制实验，部分结果如表1所示。表1所示的菌株中，paenibacilluspolymyxa pyq1、kosakonia pyq2、rahnella aquatilis pyq3和pseudomonasrhodesiae pyq4均分离自木粉，paenibacillus polymyxa jwyb12分离自牛饲料。其中paenibacillus polymyxa pyq1、
pseudomonas rhodesiae pyq4和paenibacilluspolymyxa jwyb12现都保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为cgmcc no：16444、cgmcc no：16674和cgmcc no：24850。 paenibacillus polymyxa pyq1所生产的多糖被发现具有较强的抗uv能力(wangy-q,huang j-x,zhou w-w.isolation,characterization and cytoprotective effectsagainst uv radiation of exopolysaccharide produced from paenibacillus polymyxapyq1[j].journal of bioscience and bioengineering,2020,130(3):283-289.)， pseudomonas rhodesiae pyq4亦曾在专利中出现(周文文,汪旖清.一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌pyq4及其多糖制备方法和应用[p]zl201811481048.3, 授权日2020-05-29.)。各菌株的初始浓度范围为(1.0～9.0)
×
107cfu/ml。
[0046]
表1部分菌株对马拉色菌的抑制作用
[0047][0048]
注：
“‑”
表示没有抑制作用，“ ”表明有抑制作用。
[0049]
结果发现只有多粘类芽孢杆菌jwyb12具有抑制马拉色菌的能力，且效果比较显著。
[0050]
涂布计数结果显示，多粘类芽孢杆菌的原菌液的浓度是8.5
×
107cfu/ml。不同浓度的多粘类芽孢杆菌jwyb12对马拉色菌的抑制作用如表2和图2所示。
[0051]
原菌液的抑菌圈直径最大，直径为12.75
±
1.09mm。根据原菌液的浓度，当该多粘类芽孢杆菌的菌悬液浓度在1.7
×
104cfu/ml到8.5
×
107cfu/ml之间时，该菌对马拉色菌的抑制作用随着菌悬液浓度的增大而增大。而且可以发现当菌悬液浓度大于1.7
×
105cfu/ml时，抑制效果是好于阳性对照(1g/l酮康唑)的。
[0052]
表2多粘类芽孢杆菌对限制马拉色菌的抑制作用
[0053][0054]
马拉色菌的过度繁殖，常导致花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病，因此，利用本发明的多粘类芽孢杆菌可以制备马拉色菌抑制剂并作为洗化产品，或作为预防、缓解、治疗上述皮肤疾病的药物。此外，基于本发明多粘类芽孢杆菌的发酵液，或基于发酵液的下游菌液制品也同样具有制备马拉色菌抑制剂并作为洗化产品，或作为预防、缓解、治疗上述皮肤疾病的药物的应用前景。此外，本发明的多粘类芽孢杆菌为常见的生防菌，因此安全性较高；且该多粘类芽孢杆菌的生长繁殖较为容易，生产成本较低、工艺简单，因此在上述应用中的应用前景乐观。
[0055]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为本发明的保护范围。