一种室内花生青枯菌接种方法

1.本发明属于植物细菌接种技术领域，尤其涉及一种室内花生青枯菌接种方法。


背景技术：

2.目前，青枯病是一种由青枯菌引起破坏性强的土壤传播疾病，在植物生长的苗期和成株期都会发生，发病的植株根部和茎基部维管束会开始变成黄褐色，破坏维管束输导组织，导致植株失水枯萎。
3.青枯病是危害花生品质和产量最为严重细菌性病害之一，尤其在我国长江流域及以南地区发病情况较严重，因此培育出抗病品种是防治青枯病最有效的手段。而花生青枯病的高效接种是加快对花生青枯病种质培养的和抗病机制研究的重要基础之一，是实现高效防控花生青枯病的关键手段。
4.田间病圃是最为传统的花生青枯病鉴定方法，由于此方法需在室外进行，容易受环境影响并且鉴定周期长。因此越来越多的研究者采用室内接种方法鉴定花生青枯病，如伤根灌菌法、注射法、针刺法等。但是这些方法存在着操作繁琐、难以控制人工创口面积、容易导致植物受到物理伤害等缺陷，导致接种效果不佳。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：鉴定周期长、操作繁琐、难以控制人工创口面积、容易导致植物受到物理伤害等缺陷，导致接种效果不佳。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种室内花生青枯菌接种方法。
7.本发明是这样实现的，一种室内花生青枯菌接种方法，所述室内花生青枯菌接种方法包括：
8.采用无菌剪刀蘸取青枯菌菌液剪去样品花生的倒2叶和倒3叶的4小叶中的对角线的两小叶，垂直于中脉半片小叶的2/3处，进而完成接种。
9.进一步，所述室内花生青枯菌接种方法包括以下步骤：
10.步骤一，在室内进行花生播种作为接种样品；
11.步骤二，收集致病力强的菌液，在实验室含ttc的cpg培养基上鉴定活化；
12.步骤三，用无菌剪刀蘸取菌液剪去样品花生的小叶，完成接种；通过剪叶快速将青枯菌接种到花生上。
13.步骤四，接种后在室内进行培养，控制室内温湿度和长日照培养接种后的样品花生。
14.进一步，所述步骤二中的菌液为青枯菌菌液。
15.进一步，所述步骤二中的菌液在含有ttc的cpg培养基以及培养箱中进行活化培养。
16.进一步，所述培养箱的温度为28℃。
17.进一步，所述步骤三中的样品花生生长周期为两周左右。
18.进一步，所述步骤三中，到7～8叶期为最佳接种时期。
19.进一步，所述步骤三中的接种菌液浓度达到od
600nm
≈0.1时进行接种。
20.进一步，所述步骤四中室内温度控制在28
±
2℃，湿度70％。
21.进一步，所述步骤四中的室内培养方法为：16h光照培养，8h暗培养。
22.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
23.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
24.本发明提供了一种简易、高效的花生青枯菌接种方法，通过少量的接种材料就可以完成高效的接种，为花生青枯病种质培养的和抗病机制研究提供理论依据，以此实现花生青枯病的高效防控。
25.本发明采用无菌剪刀蘸取青枯菌菌液剪去样品花生的倒2叶和倒3叶的4小叶中的对角线的两小叶，垂直于中脉半片小叶的2/3处，以此来完成接种。该技术提高了花生青枯病的接种速度和接种效率，有利于快速高效的鉴定花生对青枯病的抗性，加快了抗青枯病花生品种的筛选以及对青枯病致病机理的分析。
26.本发明提供了一种简捷、高效的花生接种青枯菌的室内接种方法，通过这种方法可以快速提高样品花生对青枯病的发病率，尤其是感病的样品花生发病率可达到100％。这种高效的接种方式可以为抗感花生品种筛选提供技术支持，进而为花生抗青枯病分子机制研究、抗病品种选育和青枯病的防控提供理论依据。
27.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
28.本发明提出了一种通过剪叶来完成花生接种青枯菌的方案，该方案简易、高效，接种效果好，接种感病品种的发病率可达100％。
29.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
30.(1)青枯病发病的部位主要是地上部分，本发明通过剪叶的方式接种青枯菌可以更加直观、快速的观察花生发病状态。
31.(2)本发明在人工控制条件下可对大批量花生材料快速地进行抗性鉴定，大大缩短鉴定时间及鉴定成本。
32.(3)本发明操作简单、快速，不像传统的接种方式繁琐且不易上手。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1是本发明实施例提供的室内花生青枯菌接种方法流程图。
35.图2(a)、图2(b)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株10天后的表型，bar＝4cm；图2(c)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株的病情指数，横坐标为接种后的天数，
纵坐标为病情指数；图2(d)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株的存活率，横坐标为接种后的天数，纵坐标为存活率，****p＜0.0001。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种室内花生青枯菌接种方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
38.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
39.如图1所示，本发明实施例提供的室内花生青枯菌接种方法包括以下步骤：
40.s101，在室内进行花生播种作为接种样品；
41.s102，收集致病力强的菌液，在实验室含ttc的cpg培养基上鉴定活化；
42.s103，用无菌剪刀蘸取菌液剪去样品花生的小叶，完成接种；
43.s104，接种后在室内进行培养，控制室内温湿度和长日照培养接种后的样品花生。
44.作为优选实施例，本发明实施例提供的室内花生青枯菌接种方法具体包括以下步骤：
45.s1、在室内进行花生播种作为接种样品；
46.s2、收集致病力强的青枯菌菌液，并在实验室含有ttc的cpg培养基上鉴定，鉴定成功后划线活化并放在28℃培养箱中培养，2～3天后就可挑取单菌落到cpg液体培养基中；
47.s3、在接种前一晚，挑取青枯菌单菌落加入到cpg液体培养基中，置于28℃，180rpm的摇床上培养至过夜，用分光光度计测定菌液od值，用无菌水将其配置到od
600nm
≈0.1后就可进行接种。用无菌剪刀蘸取菌液剪去样品花生的倒2叶和倒3叶的4小叶中的对角线的两小叶，垂直于中脉剪到半片小叶的2/3处；
48.s4、接种后在室内进行培养，培养条件控制在室内温度28
±
2℃左右，湿度70％左右，并且进行16h的光照培养，8h的暗培养。
49.通过本发明实施例提供的室内花生青枯菌接种方法接种青枯菌(接种过从各地分离出的青枯菌，都成功接种，说明此方法对青枯菌都通用。)，可以提高花生样品的发病率，感病花生样品的发病率可以达到100％，这种室内接种方法简易、高效，可以快速鉴定花生品种对青枯病的抗性，为花生青枯病种质培养的和抗病机制研究提高重要的理论依据，加快抗病品种的培育进程。
50.二、应用实施例。以303份花生品种为材料，采用剪叶法分别接种花生青枯菌菌株ha4-1和peafj1进行抗性鉴定。根据第一次重复的鉴定结果，本发明从中选择了112份花生品种做了三次重复鉴定，在接种ha4-1的花生中有高抗品种1份，中抗品种5份，中感品种44份，感病品种62份，接种peafj1的花生中有中抗品种3份，中感品种26份，感病品种83份。通过剪叶法大大缩短了花生青枯菌的接种以及鉴定时间，最短的鉴定时间仅十天左右，最长的鉴定时间三十天左右。
51.三、实施例相关效果的证据。采用剪叶法对抗病品种a165以及感病品种a281接种
菌株ha4-1，同时接种清水进行对照，进行20天的详细发病观察。结果表明(图2)，接种菌株ha4-1后第1天a281接种叶片开始发病，在接种后1～7天时，病情指数急剧上升，到接种后第10天时植株几乎全部死亡。而a165接种叶片在接种后第3天才出现发病现象，在接种6天后病情指数没有出现很大的变化，在接种后第10天发病的植株病情均在一级，在接种后第二十天仅部分植株死亡。因此证明剪叶法在抗、感花生品种均可以使用，并且可以快速通过表型对花生抗病情况进行鉴定。
52.图2.(a,b)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株10天后的表型，bar＝4cm；(c)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株的病情指数，横坐标为接种后的天数，纵坐标为病情指数；(d)为花生a281和a165剪叶法接种ha4-1菌株的存活率，横坐标为接种后的天数，纵坐标为存活率，****p＜0.0001。
53.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。