7.0)溶液和0.1mol/l na3po
4-na2so4(ph6.7)缓冲液，或0.2mol/l na3po4(ph 7.0)缓冲液，或0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液；柱温为35℃或25℃，进样量为10μl，高效液相色谱检测器为紫外检测器，检测波长为214nm，或220nm，或230nm，或254nm，或280nm；(5)根据标准曲线获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
6.优选地，所述的离心脱脂条件为：样品经7000g离心20min。
7.优选地，所述的样品稀释倍数为4倍。
8.优选地，所述的动态高压微射流处理方式为40mpa处理两次。
9.优选地，所述的色谱柱为c18柱(4.6mm
×
250mm)。
10.优选地，所述的高效液相色谱分析流动相为0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液。
11.优选地，所述的高效液相色谱分析最佳检测波长为280nm。
12.优选地：柱温为：25℃。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.本发明采用动态高压微射流处理，破坏乳样品中酪蛋白和乳清蛋白之间，以及蛋白质和其它成份之间的非特异性结合，同时实现几种活性乳清蛋白的定量分析；本发明提供的方法无需对酪蛋白进行沉淀处理，操作方便简单；本发明提供的方法灵敏度高、重现性好、确证能力强，为评价原料乳及巴氏杀菌乳的品质提供快速稳定检测方法，并为相关乳制品的开发提供数据支撑。
附图说明
15.图1是本发明的技术流程图；
16.图2是α-乳白蛋白标准曲线图；
17.图3是β-乳球蛋白标准曲线图；
18.图4是乳铁蛋白标准曲线图；
19.图5是实施例1色谱图；
20.图6是实施例2色谱图；
21.图7是实施例3色谱图；
22.图8是实施例4色谱图。
具体实施方式
23.以下结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
24.此外，除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
25.实施例1
26.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析乳清蛋白含量的方法，如图1所示，包括如下步骤：
27.(1)准确称取乳样品100.00克，在4℃条件下经7000g离心20min，分离去除乳样品中脂肪等杂质；
28.(2)由步骤(1)得到的样品取中间清液，加入去离子水稀释4倍；
29.(3)将由步骤(2)得到的样品进行动态高压微射流处理，在40mpa压力下处理2次。
30.(4)步骤(3)处理后的处理液，采用孔径为0.22μm的水系滤膜进行过滤，随后进行高效液相色谱分析，色谱柱为c18柱(4.6mm
×
250mm)，所述的流动相为0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液，柱温为25℃，进样量为10μl，高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测波长为280nm。
31.检测结果如图5所示，再根据标准曲线图2至图4，获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。三个乳清蛋白一次性检出，加标回收率在90％～110％之间。
32.实施例2
33.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析乳清蛋白含量的方法，如图1所示，包括如下步骤：
34.(1)准确称取乳样品100.00克，在4℃条件下经5000g离心20min，分离去除乳样品中脂肪等杂质；
35.(2)由步骤(1)得到的样品取中间清液，加入去离子水稀释2倍；
36.(3)将由步骤(2)得到的样品进行动态高压微射流处理，在60mpa压力下处理2次。
37.(4)步骤(3)处理后的处理液，采用孔径为0.22μm的水系滤膜进行过滤，随后进行高效液相色谱分析，色谱柱为c18柱(4.6mm
×
250mm)，所述的流动相为0.1mol/l nano3(ph 7.0)溶液和0.1mol/l na3po
4-na2so4(ph 6.7)缓冲液，柱温为25℃，进样量为10μl，高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测波长为220nm。
38.根据标准曲线图2至图4，获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
39.检测结果如图6所示，该实施条件下没有检测到乳铁蛋白的色谱峰。
40.实施例3
41.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析乳清蛋白含量的方法，如图1所示，包括如下步骤：
42.(1)准确称取乳样品100.00克，在4℃条件下经2000g离心20min，分离去除乳样品中脂肪等杂质；
43.(2)由步骤(1)得到的样品取中间清液，加入去离子水稀释4倍；
44.(3)将由步骤(2)得到的样品进行动态高压微射流处理，在60mpa压力下处理2次。
45.(4)步骤(3)处理后的处理液，采用孔径为0.22μm的水系滤膜进行过滤，随后进行高效液相色谱分析，色谱柱为c18柱(4.6mm
×
250mm)，所述的流动相为0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液，柱温为25℃，进样量为10μl，高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测波长为214nm。
46.根据标准曲线图2至图4，获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
47.检测结果如图7所示，该实施条件下没有检测到乳铁蛋白的色谱峰。
48.实施例4
49.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析乳清蛋白含量的方法，如图1所示，包括如下步骤：
50.(1)准确称取乳样品100.00克，在4℃条件下经11000g离心20min，分离去除乳样品中脂肪等杂质；
51.(2)由步骤(1)得到的样品取中间清液，加入去离子水稀释6倍；
52.(3)将由步骤(2)得到的样品进行动态高压微射流处理，在20mpa压力下处理2次。
53.(4)步骤(3)处理后的处理液，采用孔径为0.22μm的水系滤膜进行过滤，随后进行高效液相色谱分析，色谱柱为gel 2000swxl300 mm
×
7.8nm，所述的流动相为0.1mol/l nano3(ph 7.0)溶液和0.1mol/l na3po
4-na2so4(ph 6.7)缓冲液，柱温为35℃，进样量为10μl，高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测波长为280nm。
54.检测结果如图8所示，根据标准曲线图2至图4，获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。乳铁蛋白未检出，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白加标回收率低于70％。
技术特征：
1.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析活性乳清蛋白含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)准确称取乳样品100.00克，在4℃条件下经5000g离心20min，或7000g离心20min，或9000g离心20min，或11000g离心20min脱脂；(2)由步骤(1)得到的样品取中间清液，用去离子水稀释2倍，或4倍，或6倍；(3)将由步骤(2)得到的样品进行动态高压微射流处理：进行20mpa处理一次，或20mpa处理两次，或20mpa处理三次，或40mpa处理一次，或40mpa处理两次，或40mpa处理三次，或60mpa处理一次，或60mpa处理两次，或60mpa处理三次；(4)过0.22μm水系滤膜，进行高效液相色谱分析，色谱柱为gel 2000swxl，规格为300mm
×
7.8nm，或c18柱，规格为4.6mm
×
250mm，所述的流动相为0.1mol/lnano3溶液和0.1mol/l na3po
4-na2so4缓冲液，或0.2mol/l na3po4缓冲液，或0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液，其中，nano3的ph为7.0，na3po
4-na2so4的ph为6.7，na3po4的ph为7.0；柱温为35℃或25℃，进样量为10μl，高效液相色谱检测器为紫外检测器，检测波长为214nm，或220nm，或230nm，或254nm，或280nm；(5)根据标准曲线获得样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的最佳离心脱脂条件为：样品经7000g离心20min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品稀释倍数最佳为4倍。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的最佳动态高压微射流处理方式为：40mpa处理两次。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的最佳色谱柱为c18柱，规格为4.6mm
×
250mm。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱分析流动相最佳为0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的高效液相色谱分析最佳检测波长为280nm。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，最佳柱温为：25℃。
技术总结
本发明涉及一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析活性乳清蛋白含量的方法，属于检测分析技术领域；以高效液相色谱技术为基础，结合动态高压微射流技术对样品进行前处理，破坏酪蛋白和乳清蛋白之间，以及蛋白质和其它成份之间的非特异性结合，进而采用高效液相色谱法进行测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分对固定相和流动相的分配系数的差别进行分离，同时实现几种活性乳清蛋白的定量分析，建立一种快速简便、准确的检测活性乳清蛋白含量的方法。乳清蛋白含量的方法。乳清蛋白含量的方法。
技术研发人员：俞兰秀 黄彩娟 杨郁荭
受保护的技术使用者：卡士乳业（深圳）有限公司
技术研发日：2022.08.12
技术公布日：2022/12/16
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