一种提高桑黄菌丝体中黄酮含量的方法

1.本发明属于真菌栽培技术领域，涉及一种提高桑黄菌丝体中黄酮含量的方法，具体是一种在桑黄菌丝液体发酵过程中加入适量的乙酸而提高菌丝体中黄酮含量的方法。


背景技术：

2.桑黄(phellinus igniarus)是一种珍贵的药用真菌。黄酮是桑黄主要药用成分之一，是含量丰富且具有重要功效的次级代谢产物，其具有抗癌，抗氧化，降血脂，扩张血管的作用。研究表明，桑黄子实体和菌丝体中的黄酮类化合物等活性物质可以起到阻断自由基链反应及消除自由基的作用，从而达到抗氧化、延缓衰老的功效。黄酮类化合物还具有扩张血管、保护肝脏、调节激素、降低血脂血糖、提高免疫力和抗菌抗病毒等作用。人类大肠癌细胞cx-1的生长可以被桑黄的黄酮提取物明显抑制，且随浓度增大抑制作用愈明显。桑黄黄酮具有较强的清除ros的能力，并能修复被ros损伤的神经细胞。已有研究表明桑黄中含有的黄酮类物质具有良好的抗氧化能力，能有效地清扫自由基，阻止脂质的过氧化。由于黄酮有多种药用活性，所以提高桑黄黄酮含量具有重要意义。
3.由于野生桑黄量很少，不能满足市场需求，人工栽培的方法生产桑黄子实体应运而生。目前，大多通过桑黄液体发酵来生产桑黄液体种子液，然后用于子实体栽培。但是许多研究者发现菌丝体和子实体的化学成分没有多大差距，因此通过液体发酵获得黄酮类活性物质是最佳选择。桑黄菌丝体液体发酵所得黄酮类活性物质的含量并不理想，因此通过优化发酵技术来提高黄酮类活性物质含量显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种提高桑黄菌丝体中黄酮含量的方法，以解决桑黄菌丝体液体发酵所得黄酮类活性物质含量较低的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.乙酸在提高桑黄菌丝体黄酮含量中的应用。
7.作为一种优选技术方案：向桑黄液体发酵培养基中加入乙酸进行处理以提高桑黄菌丝体中黄酮的含量。所述的乙酸在桑黄液体发酵培养基中的添加浓度为：7-10mm；优选为9.50mm。
8.作为一种优选技术方案，所述乙酸处理的时间为24-95h，优选为24-90h，最优选为85.56h。
9.所述的乙酸配制成乙酸溶液，然后通过滤器过滤除菌后加入到桑黄液体发酵培养基中。
10.一种提高桑黄菌丝体中黄酮含量的发酵方法，向桑黄液体发酵培养基中加入乙酸进行处理以提高桑黄菌丝体中黄酮的含量。
11.优选的，该方法具体为：将桑黄菌种活化后制备种子液，将种子液接种入桑黄液体发酵培养基中发酵培养，发酵过程中向所述的桑黄液体发酵培养基中添加乙酸进行乙酸处
理以提高桑黄菌丝体中黄酮的含量。
12.上述菌种活化的过程为：将保存在pda固体培养基的桑黄菌种接入cym固体培养基上，然后放入28℃培养箱中生长；
13.上述制备种子液的过程为：将活化好的桑黄，用打孔器打小孔接入cym液体培养基中，放入150rpm，28℃摇床中培养5～10天。
14.上述的方法，其所述的乙酸在桑黄液体发酵培养基中的添加浓度为7-10mm；优选为9.50mm。
15.上述的方法，其所述乙酸处理的时间为24-95h，优选为24-90h，最优选为85.56h。
16.上述将种子液接种入桑黄液体发酵培养基中发酵培养的过程为：将种子液用打种机粉碎，然后接入桑黄液体发酵培养基中发酵培养，发酵过程中向桑黄液体发酵培养基中加入乙酸溶液处理一定时间，以此提高桑黄菌丝体中黄酮类含量。
17.上述提高桑黄菌丝体中黄酮含量的发酵方法，具体包括如下步骤：
18.(1)菌种活化：将保存在pda固体培养基的桑黄菌种接入cym固体培养基上，然后放入28℃培养箱中生长。
19.(2)种子液制备：将活化好的桑黄，用打孔器打小孔接入cym液体培养基中，放入150rpm，28℃摇床中培养7天。
20.(3)发酵处理：将种子液用打种机粉碎，然后接入cym液体培养基中发酵培养，发酵过程中向cym液体培养基中加入乙酸溶液处理，以此提高桑黄菌丝体中黄酮含量。
21.上述的pda固体培养基的配方为：1l培养基中含去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g；其制备方法为本领域技术人员公知的。
22.上述的cym固体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％、酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o0.05％、kh2po40.46％、琼脂2％，其余用水补足100％。
23.上述的桑黄液体发酵培养基为cym液体培养基。上述的cym液体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％、酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o0.05％、kh2po40.46％，其余用水补足100％。
24.本发明的有益效果：
25.黄酮含量对于优质桑黄来说是一个重要指标，通过在桑黄菌丝液体培养基中加入适量乙酸可以有效提高菌丝黄酮的含量，当乙酸处理浓度为9.50mm时，处理时间85.56h，总黄酮含量较对照组增加30.4％。黄酮不单单是一种物质，包含多种黄酮类物质，不同物质对应功能也不同，并且通过hplc法分析黄酮类化合物中的重要活性黄酮类物质，结果表明：当乙酸处理浓度为9.50mm时，处理时间85.56h，异槲皮苷，芦丁，水仙苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，槲皮素，樱花素含量较对照组分别提高68.6％，75％，65％，73％，57％，87％。
附图说明：
26.图1为芦丁标准曲线。
27.图2为六种重要黄酮类物质标品hplc色谱图。
28.图3为乙酸处理组和对照组桑黄菌丝黄酮hplc指纹图谱。
29.图4为不同浓度乙酸对桑黄菌丝体生物量和黄酮含量的影响。
30.图5为不同时间乙酸处理对桑黄菌丝生物量和黄酮含量影响。
具体实施方式：
31.下面结合实例对本发明做进一步详细说明：
32.实施例1
33.(1)菌种活化：将保存在pda固体培养基的桑黄菌种接入cym固体培养基上，然后放在28℃培养箱中活化两周左右。
34.(2)种子液制备：在活化的桑黄菌种菌落边缘用打孔器打10个直径为5mm的小孔，然后用接种针接入到cym液体培养基中，并在温度28℃，转速为150r/min摇床中培养制备种子液，发酵7天。
35.(3)发酵处理：将发酵好的桑黄菌丝种子液用粉碎机破碎，然后接入到100ml cym液体培养基中，按体积百分含量计，每瓶接入3ml的量，放入28℃，转速150r/min摇床中发酵培养。发酵至第4天时，在培养基中加入不同浓度乙酸，使培养基乙酸处理浓度为7，10，13，16，19(mm)。所述的乙酸配制成乙酸溶液，然后通过滤器过滤除菌后加入到桑黄液体发酵培养基中，再处理3天(即72h)。
36.(4)将处理好的菌丝和对照组菌丝收样烘干，然后磨成粉末，通过nano
2-al(no3)3法测定，并与图1标准曲线比对分析，获得总黄酮含量。
37.(5)不同浓度乙酸处理对桑黄菌丝黄酮含量影响如表1所示。
38.按重量百分含量计，所述cym液体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％、酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o0.05％、kh2po40.46％，其余用水补足100％。
39.所述的pda固体培养基的配方为：1l培养基中含去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g；其制备方法为本领域技术人员公知的。
40.所述的cym固体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％、酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o0.05％、kh2po40.46％、琼脂2％，其余用水补足100％。
41.实施例2
42.(1)菌种活化：将保存在pda固体培养基的桑黄菌种接入cym固体培养基上，然后放在28℃培养箱中活化两周左右。
43.(2)种子液制备：在活化的桑黄菌种菌落边缘用打孔器打10个直径为5mm的小孔，然后用接种针接入到cym液体培养基中，并在温度28℃，转速为150r/min摇床中培养制备种子液，发酵7天。
44.(3)发酵处理：将发酵好的桑黄菌丝种子液用粉碎机破碎，然后接入到100ml cym液体培养基中，按体积百分含量计，每瓶接入3ml的量，放入28℃，转速150r/min摇床中发酵培养。发酵至第4天时，在培养基中接入一定体积乙酸，使培养基乙酸处理浓度为10(mm)，分别再处理24h，48h，72h，96h，120h。
45.(4)将处理好的菌丝和对照组菌丝收样烘干，然后磨成粉末，通过nano
2-al(no3)3法测定，并与图1标准曲线比对分析，获得总黄酮含量。
46.(5)不同时间乙酸处理对桑黄菌丝黄酮含量影响如表2所示。
47.所述培养基的配方同实施例1。
48.对比例1
49.(1)菌种活化：将保存在pda固体培养基的桑黄菌种接入cym固体培养基上，然后放在28℃培养箱中活化两周左右。
50.(2)种子液制备：在活化的桑黄菌种菌落边缘用打孔器打10个直径为5mm的小孔，然后用接种针接入到cym液体培养基中，并在温度28℃，转速为150r/min摇床中培养制备种子液，发酵7天。
51.(3)发酵处理：将发酵好的桑黄菌丝种子液用粉碎机破碎，然后接入到100ml cym液体培养基中，按体积百分含量计，每瓶接入3ml的量，放入28℃，转速150r/min摇床中发酵7天。发酵至第4天时在培养基中接入一定体积无菌水作为对照。
52.(4)将处理好的菌丝和对照组菌丝收样烘干，然后磨成粉末，通过nano
2-al(no3)3法测定，并与图1标准曲线比对分析，获得总黄酮含量。
53.(5)桑黄菌丝总黄酮含量如表1所示。
54.所述培养基的配方同实施例1。
55.实施例3
56.(1)由于乙酸处理浓度和乙酸处理时间都会影响黄酮含量，于是通过曲面响应法优化处理最佳条件。通过design expect8.0软件进行分析。
57.(2)曲面响应设计的实验参数
58.根据乙酸单因素试验，表明乙酸的浓度和处理时间都对桑黄黄酮有影响。基于浓度和时间两个因素来进行曲面响应设计，优化乙酸处理的最佳条件。本试验中试验因素有2个即浓度和时间，所以采用中心组合设计法(central composite design,ccd)。其桑黄黄酮含量为因变量(y)，而乙酸处理时间和浓度为自变量(x)。
59.(3)曲面响应设计试验的分析方法
60.本试验使用design expert 8.0.软件分析试验数据，用如下二次多项式数学模型进行拟合：
[0061][0062]
其中,y是响应值即桑黄黄酮含量，β
k0
为截距,β
ki
为因素线性效应系数,β
kii
为因素的二次效应系数，β
kij
为因素之间交互作用的系数。下列为编码公式：
[0063][0064]
xi为编码后的变量，ui是变量实际值，u
i0
是变量中心点的实际值，
△
ui是变量的梯度。
[0065]
(4)优化的结果如表3所示。
[0066]
实施例4
[0067]
(1)分别准确称取0.2g乙酸处理的菌丝粉末，放入10ml离心管中，用移液枪加入4ml 70％乙醇，放入超声仪中超声2h，之后，以转速5000r/min，离心10min。离心后，放入真空干燥箱中抽滤，至液体完全蒸干。然后加入600μl甲醇溶解，放入超声仪中超声30-60h。然后再通过有机滤膜(0.22μm)过滤。
[0068]
(2)色谱柱：shim-pack gist c18 5μm(4.6i.d.
×
250mm)。流动相：a：0.4％醋酸溶液，b：甲醇。洗脱程序：0-4min，40％b；4-9min，40-55％min；9-30min；55％b；30-40min，55％-70％b；40-50min，70％b；50-60min，70％-40％b；流速：1ml/min，检测波长：362nm，柱
温：30℃，进样量：5μl。
[0069]
(3)准确称取2mg的异槲皮苷，芦丁，水仙苷，山萘酚-3-o-芸香糖苷，槲皮素，樱花素，溶于甲醇中，经有机滤膜(0.22μm)过滤，通过色谱条件方法分析，得到混合标品hplc色谱图，如图2。
[0070]
(4)通过hplc法分析乙酸处理组和对照组菌丝黄酮指纹图谱变化，结果如图3。
[0071]
表1不同浓度乙酸对桑黄菌丝黄酮含量影响
[0072][0073]
表2不同时间乙酸处理对桑黄菌丝黄酮含量影响
[0074][0075]
表3曲面响应优化结果
[0076]