一种检测黄芪桂枝五物汤物质基准中六种成分含量的方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，涉及一种检测黄芪桂枝五物汤物质基准中六种成分含量的方法。


背景技术：

2.黄芪桂枝五物汤由黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣五味中药材制成，主要用于治疗以肢体麻木，自汗浮肿为特征的疾病。适用于肌肉疏松，虚胖，皮肤缺乏弹性，腹部松软，下肢多有浮肿的患者，一般会伴有乏力，头晕，胸闷，气短，心悸等症状。
3.经典名方的物质基准是经典名方复方制剂的研究与开发中的关键环节，承接了经典名方的古法制备工艺和现代制剂工艺，含量测定是控制物质基准质量的主要方法。目前没有针对黄芪桂枝五物汤物质基准进行多成分含量测定的报道或专利，大多是黄芪桂枝五物汤汤剂或颗粒的多成分含量测定。
4.文献(hplc法同时测定黄芪桂枝五物汤中6种有效成分的含量[j].沈阳药科大学学报,2022,39(7):791-797)报道了黄芪桂枝五物汤汤剂同时测定六种成分含量的方法，以上六种成分具体是黄芪、桂枝、白芍中所含的芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸和刺芒柄花素。
[0005]
中国专利cn 109521106 a公开了一种同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，所述四种成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素，该方法包括将待测样品用提取溶剂30～80％甲醇提取，提取液过滤后直接上高效液相色谱仪进行检测的步骤。以上专利能同时检测出黄芪桂枝五物颗粒中四种物质的含量，但同时测定的指标成分较少，难以全面表征黄芪桂枝五物颗粒物质基准的质量。
[0006]
因此，有必要探索一种重复性、稳定性、精密度高，专属性强的检测黄芪桂枝五物汤物质基准中各成分含量的方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种重复性、稳定性、精密度高、专属性强的可同时检测黄芪桂枝五物汤物质基准中六种成分含量的方法。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009]
提供了一种检测黄芪桂枝五物汤物质基准中六种成分含量的方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、混合对照品溶液的制备、阳性样品溶液的制备、hplc检测；所述六种成分为芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素。
[0010]
进一步地，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：
[0011]
(1)取黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣煎煮；
[0012]
(2)将步骤(1)中得到的煎煮液过滤，滤液浓缩、冻干，即得黄芪桂枝五物汤物质基准样品；
[0013]
(3)取步骤(2)中得到的样品，加入甲醇，称重、超声、补重、过滤，取续滤液，即得供
试品溶液。
[0014]
进一步地，步骤(1)中所述黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣的重量比为8-9：8-9：8-9：16-17：6-8。
[0015]
进一步地，步骤(1)中所述煎煮包括以下步骤：加水1100-1300ml，煮至出液350-450ml；优选地，加水1200ml，煮至出液400ml。
[0016]
进一步地，步骤(3)中所述样品、甲醇的用量比为0.5-1.5g：20-30ml。
[0017]
进一步地，所述hplc检测中流动相为乙腈和甲酸溶液，所述甲酸溶液中甲酸的体积分数为0.1％-0.3％。
[0018]
进一步地，所述hplc检测的梯度洗脱程序为：0-7min，5％
→
12％乙腈；7-20min，12％
→
19％乙腈；20-30min，19％
→
30％乙腈；30-45min，30％
→
70％乙腈；45-50min，70％乙腈。
[0019]
进一步地，所述hplc检测中流速为0.5-1.5ml
·
min-1
，柱温为20-30℃，进样量为15-25μl，检测波长为250-280nm。
[0020]
进一步地，所述混合对照品溶液的制备包括以下步骤：取芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素对照品，加入甲醇溶解，即得混合对照品溶液。
[0021]
进一步地，所述混合对照品溶液中芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素的重量比为1.1-1.2：6.0-6.1：0.07-0.08：0.02-0.03：0.10-0.11：0.2-0.3。
[0022]
上述步骤中所用到的甲醇体积分数均为50％。
[0023]
在具体的实施方式中：
[0024]
(1)供试品溶液的制备：
[0025]
根据《金匮要略》原文记载，进行处方考证，根据考证结果及国家中医药管理局发布的《古代经典名方关键信息表(7首方剂)》，将一两折算为13.8g，大枣一枚为3g。取黄芪41.4g、桂枝41.4g、白芍41.4g、生姜82.8g、大枣36g，加水1200ml，煮至出液400ml，200目尼龙滤布趁热滤过，70℃减压浓缩，冻干，即得黄芪桂枝五物汤物质基准样品。精密称取冻干粉约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加体积分数为50％甲醇25ml，称重，超声(功率250w，频率40khz)30分钟，补重，滤过，取续滤液，即得。
[0026]
(2)混合对照品溶液的制备：
[0027]
取芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素对照品适量，精密称定，置于量瓶中，用体积分数为50％甲醇溶解稀释并定容，得浓度分别为1.168、6.044、0.07320、0.02861、0.1012、0.2463mg
·
ml-1
的混合对照品溶液。
[0028]
(3)阴性样品溶液的制备：
[0029]
按供试品溶液的制备方法，分别制备缺黄芪、缺桂枝、缺白芍、缺生姜的阴性样品溶液。
[0030]
(4)hplc检测：
[0031]
thermo hypersil gold c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；以乙腈(a)-0.2％甲酸溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-7min，5％
→
12％a；7-20min，12％
→
19％a；20-30min，19％
→
30％a；30-45min，30％
→
70％a；45-50min，70％a)；流速1.0ml
·
min-1
，柱温25℃，进样量
20μl，检测波长分别为250nm(0-35min，检测芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷)、280nm(35-50min，检测肉桂酸、6-姜辣素)。
[0032]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0033]
(1)本发明采用hplc波长切换法同时测定黄芪桂枝五物汤物质基准中六种有效成分的含量，其操作简便、结果可靠、精密度高、专属性强，适用于经典名方黄芪桂枝五物汤复方制剂研发的质量控制；
[0034]
(2)本发明选取的六种指标成分分别来自黄芪、桂枝、白芍、生姜，涵盖了黄芪桂枝五物汤处方中五味药材的其中四味，能够更加全面表征黄芪桂枝五物汤物质基准的质量。
附图说明
[0035]
图1为洗脱条件(1)的色谱图；
[0036]
图2为洗脱条件(2)的色谱图；
[0037]
图3为混合对照品色谱图，图中的色谱峰代表成分：1.芍药内酯苷、2.芍药苷、3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4.芒柄花苷、5.肉桂酸、6.6-姜辣素；
[0038]
图4为黄芪桂枝五物汤物质基准色谱图，图中的色谱峰代表成分：1.芍药内酯苷、2.芍药苷、3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4.芒柄花苷、5.肉桂酸、6.6-姜辣素；
[0039]
图5为黄芪阴性对照色谱图，图中的色谱峰代表成分：1.芍药内酯苷、2.芍药苷、5.肉桂酸、6.6-姜辣素；
[0040]
图6为桂枝阴性对照色谱图，图中的色谱峰代表成分：1.芍药内酯苷、2.芍药苷、3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4.芒柄花苷、6.6-姜辣素；
[0041]
图7为白芍阴性对照色谱图，图中的色谱峰代表成分：3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4.芒柄花苷、5.肉桂酸、6.6-姜辣素；
[0042]
图8为生姜阴性对照色谱图，图中的色谱峰代表成分：1.芍药内酯苷、2.芍药苷、3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、4.芒柄花苷、5.肉桂酸；
[0043]
图9为空白溶剂色谱图；
[0044]
图10为a.芍药内酯苷、b.芍药苷、c.毛蕊异黄酮葡萄糖苷、d.芒柄花苷、e.肉桂酸、f.6-姜辣素线性回归图。
具体实施方式
[0045]
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
[0046]
实施例
[0047]
1.实验方法考察
[0048]
1.1指标成分的选择
[0049]
通过文献研究发现，毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为黄芪中异黄酮类成分的代表，具有抗氧化、保护血管内皮和改善心肌的作用；芒柄花苷也有较强的抗氧化活性；肉桂酸是桂枝的重要活性成分，能够控制小鼠炎性发展，降低骨与软骨组织损伤，对类风湿关节炎有治疗作用；芍药苷和芍药内酯苷均能抗炎镇痛；6-姜辣素不仅可以改善大鼠成肌细胞糖脂代谢紊乱，还能改善糖脂代谢紊乱大鼠的脂肪组织胰岛素抵抗。结合2020年版《中国药典》中黄芪桂枝五物汤5味饮片含量测定的成分，最终选定上述6种与黄芪桂枝五物汤药效相关的活
性成分作为指标成分。
[0050]
1.2检测波长的选择
[0051]
通过分别对6种成分进行全波长扫描，发现芍药内酯苷和芍药苷的最大吸收波长为232nm，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素的最大吸收波长分别为249、251、277和281nm。因毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷的最大吸收波长接近250nm，且芍药内酯苷和芍药苷在250nm检测波长下峰型和分离度较好，而肉桂酸和6-姜辣素最大吸收波长接近280nm。综合考虑选择波长切换法进行含量测定，各成分的检测波长分别为250nm(芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷)和280nm(肉桂酸、6-姜辣素)。
[0052]
1.3物质基准提取溶剂和方式的选择
[0053]
黄芪桂枝五物汤物质基准为水提液制成的冻干粉，其中水溶性成分含量较大，因此选取稀乙醇、乙醇、甲醇和50％甲醇分别进行提取，结果发现以50％甲醇为提取溶剂的色谱峰峰型好，峰面积大。考察超声、回流、振摇提取，发现超声提取效率最高，故选择超声为提取方式。
[0054]
1.4流动相的选择
[0055]
本研究分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2％甲酸水溶液、乙腈-0.2％甲酸水溶液、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液六种流动相系统。结果表明，流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液时峰型和分离度较好。
[0056]
1.5柱温的选择
[0057]
本研究在其他色谱条件保持不变的情况下，分别考察了柱温为25、30、35℃时的色谱峰。结果表明，柱温为25℃时各峰能够基线分离，干扰较小，保留时间适宜。
[0058]
1.6洗脱条件的选择
[0059]
本研究在其他色谱条件保持不变的情况下，对梯度洗脱的洗脱条件进行了优化选择选择。分别试验了两种洗脱条件如下：
[0060]
(1)以乙腈(a)-0.2％甲酸溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-24min，5％
→
32％a；24-35min，32％
→
70％a；35-45min，70％a)(见图1)；
[0061]
(2)以乙腈(a)-0.2％甲酸溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-24min，5％
→
30％a；24-37min，30％
→
70％a；37-45min，70％a)(见图2)。
[0062]
结果根据色谱图发现，图1中，芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸都未达到基线分离；图2中，芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂酸的分离度有改善，但仍未达到基线分离。
[0063]
2.实验方法
[0064]
2.1材料
[0065]
2.1.1仪器
[0066]
ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国thermo fisher公司)；ae200型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；dgj-10c型真空冷冻干燥机(上海博登生物科技有限公司)；kq-300da型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；gm-0.5a型隔膜真空泵(天津津腾实验设备有限公司)。
[0067]
2.1.2试剂与试药
[0068]
芍药内酯苷(批号：rs03831020，纯度：94.8％)、芒柄花苷(批号：st08800220，纯度：95.0％)均购自上海诗丹德生物技术有限公司，芍药苷(批号：110736-201943，纯度：
95.1％)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，纯度：97.6％)、肉桂酸(批号：110786-201604，纯度：98.8％)、6-姜辣素(批号：111833-202007，纯度：99.3％)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸(色谱纯，美国tedia公司)；屈臣氏纯净水；其他试剂为分析纯。
[0069]
黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣饮片均购自广东慧达康制药有限公司，经检验，饮片均符合《中华人民共和国药典》2020年版一部项下规定。
[0070]
2.2色谱条件
[0071]
thermo hypersil gold c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；以乙腈(a)-0.2％甲酸溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-7min，5％
→
12％a；7-20min，12％
→
19％a；20-30min，19％
→
30％a；30-45min，30％
→
70％a；45-50min，70％a)；流速1.0ml
·
min-1
，柱温25℃，进样量20μl，检测波长分别为250nm(0-35min，检测芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷)、280nm(35-50min，检测肉桂酸、6-姜辣素)。
[0072]
2.3混合对照品溶液的制备
[0073]
取芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素对照品适量，精密称定，置于量瓶中，用50％甲醇溶解稀释并定容，得浓度分别为1.168、6.044、0.07320、0.02861、0.1012、0.2463mg
·
ml-1
的混合对照品溶液。
[0074]
2.4供试品溶液的制备
[0075]
取黄芪41.4g、桂枝41.4g、白芍41.4g、生姜82.8g、大枣36g，加水1200ml，煮至出液400ml，200目尼龙滤布趁热滤过，70℃减压浓缩，冻干，即得黄芪桂枝五物汤物质基准样品。精密称取冻干粉约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇25ml，称重，超声(功率250w，频率40khz)30分钟，补重，滤过，取续滤液，即得。
[0076]
2.5阴性样品溶液的制备
[0077]
按“2.4”项下供试品溶液的制备方法，分别制备缺黄芪、缺桂枝、缺白芍、缺生姜的阴性样品溶液。
[0078]
3.方法学考察
[0079]
3.1专属性考察
[0080]
精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，并记录色谱图。结果表明，各成分均能基线分离，阴性样品无干扰，专属性良好。见图3-图9。
[0081]
3.2线性关系考察
[0082]
分别精密吸取混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml，用50％甲醇定容至10ml量瓶中，得系列混合对照品溶液。按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积。分别以峰面积为纵坐标(y)，以对照品浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。得到6种成分的回归方程见表1，线性回归图见图10。
[0083]
表1黄芪桂枝五物汤物质基准中6种成分的线性关系考察
[0084]
成分回归方程r线性范围(mg
·
ml-1
)芍药内酯苷y＝82.8295x-0.05101.00000.02921～0.4674芍药苷y＝80.9016x 2.07380.99990.1511～2.417毛蕊异黄酮葡萄糖苷y＝1357.6812x 0.36040.99990.001830～0.02928
芒柄花苷y＝1431.6235x-0.00201.00000.0007154～0.01145肉桂酸y＝2737.1591x-0.05011.00000.002529～0.040476-姜辣素y＝195.7257x-0.00951.00000.006157～0.09851
[0085]
3.3精密度试验
[0086]
精密吸取混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，计算芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素峰面积的rsd分别为0.44％、0.18％、0.21％、0.16％、0.06％、0.07％，保留时间的rsd分别为0.06％、0.07％、0.06％、0.02％、0.03％、0.02％。结果表明仪器精密度良好。
[0087]
3.4稳定性试验
[0088]
取同一供试品溶液，分别于制备后的第0、2、4、8、12、24h进样，分别记录峰面积，结果芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素峰面积的rsd分别为0.30％、0.44％、0.46％、0.83％、0.07％、0.22％。表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
[0089]
3.5重复性试验
[0090]
取同一批次黄芪桂枝五物汤物质基准冻干粉，按“2.4”项下平行制备6份供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，结果芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素的平均含量分别为3.764、16.16、0.2256、0.08535、0.2865、0.6014mg
·
g-1
，rsd分别为0.74％、0.30％、0.70％、0.25％、0.39％、0.33％。表明本方法重复性良好。
[0091]
3.6加样回收率试验
[0092]
精密称取已知6种成分含量的黄芪桂枝五物汤物质基准冻干粉约0.5g各6份，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素对照品溶液适量，按“2.4”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，计算各成分的回收率。结果芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、肉桂酸和6-姜辣素的平均加样回收率分别为99.74％、99.71％、101.29％、100.51％、100.40％、98.73％，rsd分别为1.15％、0.96％、0.70％、0.43％、0.32％、0.46％。表明本方法准确性良好。结果见表2。
[0093]
表2黄芪桂枝五物汤物质基准中6种成分的加样回收试验结果(n＝6)
[0094]
[0095][0096]
3.7样品的含量测定
[0097]
分别称取3批黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣饮片样品，按“2.4”项下制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行测定，结果见表3。
[0098]
表3 3批黄芪桂枝五物汤物质基准中6种成分的含量(mg
·
g-1
，n＝2)
[0099]
样品芍药内酯苷芍药苷毛蕊异黄酮葡萄糖苷芒柄花苷肉桂酸6-姜辣素s13.86816.570.22760.085320.28620.5985s23.87516.590.22580.085450.28650.5988s33.85616.610.23020.085750.28740.6011
[0100]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，
均不脱离本发明技术方案的实质和范围。