一种养殖水体光合细菌的快速检测方法

1.本发明属于农业水产养殖检测技术领域，特别涉及一种养殖水体光合细菌的快速检测方法。


背景技术：

2.我国水产养殖的方式具有集约化、高密度的特点，大量残饵和水产动物排泄物进入水体，导致养殖池塘水体中氨氮含量过高，藻类及其它微生物大量繁殖,形成富营养化污染,大量消耗水体溶解氧，水生生物呼吸困难、不摄食、昏迷，免疫防御功能受到抑制，严重时可导致大批死亡。光合细菌是地球上最早出现的具有原始光能合成体的原核生物，可吸收分解水中的氨(nh3)、氮(n2)、硫化氢(h2s)等有害物质以及鱼类产生的粪便和残饵，还可提高养殖水体中的溶解氧，对水体的ph值有一定的调节作用，具有很强的水质净化能力。然而光合细菌过多，当阳光充足时，水体容易富氧，厌氧细菌难以生存，硝化系统减弱，鱼虾容易烫尾或灼伤；当阳光不足时，光合作用不强，水体植物吸收氧气过多容易导致水体缺氧，虾鱼缺氧死亡。因此，在农业水产养殖领域，快速检测光合细菌含量具有重要的意义。
3.拉曼生物传感法是一种无需荧光的检测法。当光投射到特定材料上时会发生拉曼散射，拉曼散射会导致光波长的变化，不同被检分子对应着不同波长的变化，所以拉曼生物传感法相当于提供了不同分子的“指纹”信息，其灵敏度相当高、检测也很迅速。特别是可显著增强拉曼信号的sers(表面增强拉曼光谱)在检测水质中的应用非常广泛，已经成为了一种非常有效的细菌检测方法，具有检测浓度低、无损、检测速度快、准确性高和可在线检测等特点。比色生物传感法可以直接地观察到溶液颜色的变化，比其他分析方法操作简单、价格低廉，更加适合现场和实时检测。
4.微流控技术的快速发展，使其被广泛应用于各种生物传感器中用以检测细菌。生物传感器与微流控集成的检测系统能够在单一设备上进行样品的添加、分离、制备和分析，其具有成本低、检测时间短、多通量、自动化、便携性，多功能性和所需样品量小等多种优点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提出一种养殖水体光合细菌的快速检测方法，其特征在于，该方法是一种水产养殖水体光合细菌快速检测的sers和比色双模生物传感法；具体包括以下步骤：
6.步骤1，首先合成手性双金属磁性分子印迹聚合物fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips，合成au@agnps；
7.步骤2，在手性双金属磁性分子印迹聚合物的发夹结构h1和h2的poly a(聚腺嘌呤嵌段)末端修饰一种染料分子cy5，cy5提供拉曼检测信号；
8.步骤3，设计多通道自驱微流控芯片，在其反应检测区表面修饰并固定手性双金属磁性分子印迹聚合物(fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips)和金银纳米颗粒au@agnps，并
修饰h2o2、tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)
9.步骤4，针对不同种类的光合细菌，配置不同浓度的样品溶液作为待测液；
10.步骤5，对步骤4的待测液在步骤3中设计微流控芯片中测试，采集得到光合细菌样品的sers信号和颜色变化，建立sers信号与光合细菌浓度的关系模型，建立tmb颜色变化与光合细菌浓度的关系模型；
11.步骤6，采集水产养殖水体，获取含有光合细菌的待测液，依步骤5进行测试建模；
12.步骤7，根据上述测试建模结果，对sers和比色的双模生物传感法进行评估和性能优化。
13.所述步骤7中sers和比色的双模生物传感法对光合细菌的检测流程包括：
14.(1)基于杂交链反应的sers生物传感法，先制备手性双金属磁性分子印迹聚合物(fe3o4/go-mips和fe3o4/mofs/go-mips)和金银纳米颗粒(au@agnps)，其次将它们修饰并固定在多通道自驱微流控芯片的反应检测区；在发夹结构h1和h2的poly a嵌段末端修饰一种染料分子cy5，cy5提供拉曼检测信号；然后在有细菌时，所生成的多个poly a的hcr长链产物将会吸附到手性双金属磁性分子印迹聚合物表面，使得h1和h2上的染料分子cy5接近基底表面，因而产生增强的拉曼检测信号icy5，即可用于目标链的定量检测；
15.(2)同理，基于杂交链反应的比色生物传感法，在无目标链时，以手性双金属磁性分子印迹聚合物作为纳米酶，将催化底物h2o2氧化tmb，使生成的氧化产物oxtmb的量增加，使其由无色转变为明显蓝色，当有目标链时，所生成的多个poly a的hcr长链产物将会吸附到手性双金属磁性分子印迹聚合物表面上，进而增强tmb的氧化程度，使氧化产物oxtmb的特征峰增强，即增加oxtmb的量；在视觉上表现为蓝色变深，从而，通过染料分子cy5拉曼检测信号icy5变化和tmb产生的颜色变化，构建光合细菌检测模型，实现光合细菌的高灵敏度和高特异性的快速检测。
16.所述步骤3多通道自驱微流控芯片的设计
17.底层具有4-6个独立腔室的多通道自驱微流控，具体的腔室数量需要考虑光合细菌的种类以及扩展，每个腔室有不同类型微传感器，注入的溶液通过微通道流经每一个腔室，用巯基-马来酰亚胺基团硅烷化耦联法，对位于通道交叉处的4-6个腔室反应检测区进行表面修饰和手性双金属磁性分子印迹聚合物的固定，使芯片能同时检测多种光合细菌的含量。
18.本发明的有益效果是本发明将生物传感器与微流控集成的检测系统利用在单一设备上进行样品的添加、分离、制备和分析，实现光合细菌的高灵敏度和高特异性的快速检测、并能同时检测多种光合细菌的含量；具有成本低、检测时间短、多通量、自动化、便携性，多功能性和所需样品量小等多种优点。可以实现水产养殖水体光合细菌的快速准确的在线检测，为水体光合细菌含量异常提供预警。以实现养殖水体光合细菌的便捷、高灵敏度、快速定量的检测。
附图说明
19.图1为实施例的流程图。
20.图2为基于双平台的生物传感方法的原理图。
21.图3为多通道自驱微流控芯片的结构图。
具体实施方式
22.本发明提出一种养殖水体光合细菌的快速检测方法，该方法是一种水产养殖水体光合细菌快速检测的sers和比色双模生物传感法；具体包括以下步骤：
23.步骤1，首先合成手性双金属磁性分子印迹聚合物fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips，合成au@agnps；
24.步骤2，在手性双金属磁性分子印迹聚合物的发夹结构h1和h2的poly a(聚腺嘌呤嵌段)末端修饰一种染料分子cy5，cy5提供拉曼检测信号；
25.步骤3，设计多通道自驱微流控芯片，在其反应检测区表面修饰并固定手性双金属磁性分子印迹聚合物(fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips)和金银纳米颗粒，并修饰h2o2、tmb；
26.步骤4，针对不同种类的光合细菌，配置不同浓度的样品溶液作为待测液；
27.步骤5，对步骤4的待测液在步骤3中设计微流控芯片中测试，采集得到光合细菌样品的sers信号和颜色变化，建立sers信号与光合细菌浓度的关系模型，建立tmb颜色变化与光合细菌浓度的关系模型；
28.步骤6，采集水产养殖水体，获取含有光合细菌的待测液，依步骤5进行测试建模；
29.步骤7，根据上述测试建模结果，对sers和比色的双模生物传感法进行评估和性能优化。
30.下面结合附图和实施例对本发明予以进一步说明。
31.实施例一sers和比色的双模生物传感器的构建，
32.(1)手性双金属磁性分子印迹聚合物及其相关纳米复合材料的合成方法研究)，
33.如图1所示，利用共沉淀法合成磁性纳米材料fe3o4，然后，取均苯三甲酸溶于无水乙醇中配制成10mmol/l溶液；称取三水合硝酸铜溶于无水乙醇中制成10mmol/l溶液；将上述制备的巯基乙酸改性的fe3o4纳米球通过磁铁分离，加入cu(no3)2·
3h2o的乙醇溶液在振荡器中振荡15min，用磁铁分离，并用无水乙醇洗涤一次，用磁铁分离，加入均苯三甲酸的无水乙醇溶液在振荡器中振荡30min，用磁铁分离，无水乙醇洗涤一次，就得到了磁性复合材料fe3o4/mofs。
34.用hummers法制备了go，将0.2g go超声分散于45ml乙二醇中，将1.35g fecl3·
6h2o、1.0g peg4000和2.7g naac依次加入上述溶液中，50℃条件下搅拌4h后，将混合物转移至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃条件下反应8h，然后冷却至室温，用去离子水和乙醇洗涤2～3次，真空烘干后，就得到磁性复合材料fe3o4/go。
35.用上述制备fe3o4/mofs同样的方法，就得到了磁性复合材料fe3o4/mofs/go。
36.接着，将0.1g制备好的fe3o4/go或fe3o4/mofs/go超声分散于20ml的0.1mol/l tris-hcl缓冲溶液(ph＝8.5)中，搅拌均匀后向其中加入0.006g模板分子(nofx)，持续搅拌一定时间后，通过磁场分离产物，用甲醇-乙酸(9:1,v/v)溶液对模板分子进行洗脱，最终得到手性双金属磁性分子印迹聚合物fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips。
37.通过种子介导的方法合成了au@agnps。首先，将125μl(0.1mol/l)的haucl4稀释至50ml水中，加热至沸腾，搅拌并快速加入750μl(1％)柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌30min，获得金种子溶液。接着取3mlaunps作为种子溶液，加入450μl抗坏血酸溶液(0.1mol/l)，边搅拌边逐滴加入1.35mlagno3溶液(10mmol/l)。在此过程中，可观察到溶液的颜色由酒红色
变为橙色，表明金核的外层已成功地生长了一层银，最终得到au@agnps。
38.(2)手性双金属磁性分子印迹聚合物和相关纳米复合材料的表征
39.采用扫描电子显微分析技术(sem)与x射线衍射分析(xrd)技术，分析手性双金属磁性分子印迹聚合物及其相关纳米复合材料fe3o4、go、fe3o4/mofs、fe3o4/mofs/go、fe3o4/go、fe3o4/mofs/go、fe3o4/go-mips、fe3o4/mofs/go-mips、au@agnps的形态、尺寸、排布等微观结构特性。
40.(3)在手性双金属磁性分子印迹聚合物fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips的发夹结构h1和h2的poly a(聚腺嘌呤嵌段)末端修饰染料分子cy5
41.(4)微流控芯片的组装
42.如图3所示，微流控芯片由上下两层pdms片基组成，图中的波浪线和直线是微通道，圆圈是反应检测区；微流控芯片可以与固相基底结合，组装构建微流控芯片。髙分子聚合物材质具有良好的光学特性，表面易于改性且相对容易对其进行加工等优点，是制作微流控芯片较为常用的材质，选择pdms作为微流控芯片的原材料。微流控芯片组装具体实验步骤如下：
43.(1)将pdms模具放入75％的乙醇溶液中浸泡1h，然后再使用去离子水清洗，氮气吹干，重复三次。
44.(2)将芯片放入60℃的干燥箱中30min，去除微流控通道中残留的乙醇分子。
45.(3)将芯片放置到0.05％的pbst溶液中浸泡1h，后用去离子水清洗并用氮气吹干，重复三次。
46.(4)在芯片反应检测区表面修饰并固定手性双金属磁性分子印迹聚合物(fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips)和金银纳米颗粒，并修饰h2o2、tmb。
47.(5)将贴合好的芯片放入夹具中，用螺丝拧紧夹具，保证pdms芯片与基底完全贴合，避免后期实验过程中出现漏液现象。在pdms芯片的输入口、输出口处插入ep管，得到组装好的微流控芯片。
48.实施例二sers和比色的双模生物传感器对水产养殖水体光合细菌的快速检测方法流程
49.(1)合成手性双金属磁性分子印迹聚合物fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips，合成au@agnps。
50.(2)在手性双金属磁性分子印迹聚合物的发夹结构h1和h2的poly a(聚腺嘌呤嵌段)末端修饰染料分子cy5，cy5提供拉曼检测信号。
51.(3)设计多通道自驱微流控芯片，在其反应检测区表面修饰并固定手性双金属磁性分子印迹聚合物(fe3o4/go-mips或fe3o4/mofs/go-mips)和金银纳米颗粒，并修饰h2o2、tmb。。
52.(4)针对不同种类的光合细菌，配置不同浓度的样品溶液作为待测液。
53.(5)对步骤(4)的待测液在步骤(3)中设计的微流控芯片中测试，采集得到光合细菌样品的sers信号和颜色变化，建立sers信号与光合细菌浓度的关系模型，建立tmb颜色变化与光合细菌浓度的关系模型。
54.(6)采集水产养殖水体，获取含有光合细菌的待测液，依步骤(5)进行测试建模；
55.(7)根据上述测试建模结果，对sers和比色的双模生物传感法进行评估和性能优
化。
56.所述sers和比色的双模生物传感法对光合细菌的检测流程如下：
57.如图2所示，图中六边形代表go-mips，六边形下面的圆柱代表fe3o4；sers和比色的双模生物传感法对光合细菌的检测是利用上述两种手性双金属磁性分子印迹聚合物和金银纳米颗粒，构建基于杂交链反应的sers生物传感器。发夹结构h1的尾部具有结构域a*、b*，其与目标链(核酸引物)上的a、b域碱基互补配对。首先将发夹结构h1和发夹结构h2固定在金银纳米颗粒表面，h1在目标链的存在下会通过立足点介导的链置换反应而被打开，形成t h1复合物，并暴露发夹结构h1上的g、h、f、e、d、c结构域。发夹结构h2在t h1复合物上的g、h结构域的作用下发生链置换反应而被打开，形成t h1 h2复合物并暴露a、b、c、d、e、f结构域。该结构域与目标链的碱基一致，从而催化下一组发夹结构h1和h2发生杂交链反应。由于发夹结构h1和h2都具有poly a(聚腺嘌呤嵌段)，随着反应的进行，一条带有多个poly a的hcr长链产物生成。对于基于杂交链反应的sers生物传感法，h1和h2的poly a末端都修饰一种染料分子cy5，cy5提供拉曼检测信号。在有目标链时，生成多个poly a的hcr长链产物，使得h1和h2上的cy5产生拉曼检测信号(icy5)的变化，选择cy5在1467cm-1
处的特征峰作为拉曼信号，该拉曼峰归属于c＝n伸缩振动。
58.同理，对于基于杂交链反应的比色生物传感法，在无目标链时，手性双金属磁性分子印迹聚合物作为纳米酶，将催化底物h2o2氧化tmb，使生成的氧化产物oxtmb的量增加，使其由无色转变为明显蓝色。当有目标链时，生成多个poly a嵌段的hcr长链产物，进而增强或减弱tmb的氧化程度，使氧化产物oxtmb的特征峰增强或减弱(oxtmb的量增加或减少)，在视觉上表现为蓝色变深或变浅。从而，通过cy5拉曼检测信号(icy5)变化和tmb产生的颜色变化，构建核酸检测模型，实现核酸高灵敏的sers和比色的传感分析。
59.综上，本发明公开了一种水产养殖水体光合细菌快速检测的sers和比色的双模生物传感器装置和方法，可实现水体光合细菌的快速定量检测。