一种防治缺血性脑卒中的碳纳米颗粒（碳点/纳米类成分）

一种防治缺血性脑卒中的碳纳米颗粒(碳点/纳米类成分)
技术领域
1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)在防治缺血性脑卒中药物制备中的应用。


背景技术：

2.血余炭是一种常见的传统中药，最早记载于距今2000年前的《五十二病方》之中。该中药以健康人的头发为原料，经洗发、烘干、煅烧后制成，具有收敛止血、化瘀、利尿的功效，主要用于吐血、衄血、血痢、血淋、妇女崩漏及小便不利等证。
3.脑梗死(又称“卒中”)是中国主要致死疾病之一，也是世界上致死率最高的三种疾病之一。卒中常分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其中缺血性脑卒中是主要类型，约占脑卒中疾病的85％。缺血性脑卒中就是指脑血管狭窄或闭塞，导致脑血流阻断而使脑组织发生缺血缺氧、软化甚至坏死，致使脑血管功能障碍，而当血供恢复时，过量的自由基和广泛的炎症反应导致再灌注会造成进一步损伤。缺血性脑卒中是一种常见病、多发病，具有较高的发病率、死亡率、致残率和复发率，不仅给患者带来身体和精神上的痛苦，也给家庭和社会带来巨大的负担。
4.目前，缺血性脑卒中的治疗策略通常包括溶栓、扩张和神经元保护。溶栓治疗是治疗缺血性脑卒中的有效方法。然而，随着溶栓治疗的开始，再灌注损伤是不可避免的。目前仍没有治疗再灌注损伤的有效药物。因此寻找一种安全高效、疗效稳定的药物成为当前临床的迫切需求。


技术实现要素：

5.术语界定：血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)为从血余炭中提取、分离、纯化得到的一种粒径小于10nm的新型纳米物质。
6.本发明涉及从血余炭中提取分离纯化出的碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)，该纳米粒子的粒径范围在1-10nm之间，主要由c，o，n等元素构成，优选的由c、n、o、s、p元素组成，优选的晶格间距为0.108nm；此纳米颗粒在医药领域的应用，主要用于防治缺血性脑卒中。
7.所述的物质含有或不含有药学上可用的辅料。
8.所述血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)来自血余炭。
9.所述的物质为药物、保健品、食品中的任意一种，所述的物质可制备成临床上可接受的其剂型为注射剂、注射用粉针、口服液体制剂和口服固体制剂。
附图说明
10.图1.(a)血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)低分辨透射电镜图，内部为粒径分布图；(b)血余炭碳纳米颗粒高分辨透射电镜图；(c)血余炭碳纳米颗粒红外光谱图；(d)血余炭碳纳米颗粒紫外吸收光谱图；(e)血余炭碳纳米颗粒荧光光谱图。
11.图2.(a)血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)的xps全扫描图谱；(b)血余炭碳纳米颗粒的c 1s图；(c)血余炭碳纳米颗粒的o 1s图；(d)血余炭碳纳米颗粒的n 1s图。
12.图3.血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)对大鼠神经功能缺损评分、梗死体积的影响(a)mcao造模后24h大鼠脑组织代表性ttc染色。以神经功能缺损评分以中位数(范围)表示，在mcao后24小时进行评估。(b)mcao后24小时梗死体积百分比的统计分析(c)血余炭碳纳米颗粒对神经功能缺损评分的影响。(d)he染色的脑切片。(e)皮层神经元的超微结构，透射电镜，20kv.。(f)伊文思蓝染色显示血脑屏障的通透性。(g)血余炭碳纳米颗粒对mnss评分的影响。柱状图显示再灌注24h后缺血半球皮质中il-6(h)和tnf-α(i)的水平。
13.图4.大鼠脑缺血(0-120min)和再灌注(0-24h)时纹状体透析液氨基酸含量的变化(n＝6，均值
±
标准差)，图依次为asp，asn，glu，gln，tau，gly，gaba，5-ht，*p＜0.05，**p＜0.01
14.图5.血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)的镇静效果图。(a)对睡眠潜伏期的影响；(b)总睡眠时间；(c)血余炭碳纳米颗粒腹腔注射小鼠直肠温度变化(n＝10)；(d)从给药开始每小时测量不同组的直肠温度。各组给药后1、2、3、4h直肠温度变化(δ)。*p＜0.05，**p＜0.01。
15.图6.(a)血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)治疗脑组织的维恩图；(b)go和meta分析血余炭碳纳米颗粒治疗脑内显著改变的基因；(c)差异表达基因的热图(n＝3个生物学独立的样本)；(d)ipa富集分析与神经递质相关基因的特征基因表达通路。
16.图7.不同浓度的血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)孵育48小时(a)、72小时(b)后raw 264.7的细胞活力。(c.d)鸡胚脉络膜尿囊血管试验。
具体实施方式
17.下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1：血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)的制备及表征
19.将血余炭以10倍量的去离子水煎煮3次后，以0.22μm微孔滤膜过滤并浓缩。然后以去离子水为透析介质，将该浓缩液以1000da透析膜透析3天，取出袋内溶液，离心，去除沉淀，即为血余炭纳米粒子(纳米颗粒/碳量子点/碳点/纳米类成分)溶液。
20.血余炭纳米粒子(纳米颗粒/碳量子点/碳点/纳米类成分)的表征见图1和图2：透射电镜图中显示该纳米粒子为近球形，于水中具有良好的分散性，其粒径大小集中分布在1nm～10nm之间，且晶格间距为0.108nm。另外光谱研究表明，荧光图谱显示血余炭碳纳米颗粒具有显著荧光，最大激发和发射波长分别在386nm和444nm。红外图谱显示血余炭纳米粒子含有羟基、羰基、氨基等多种活性基团，该结果也进一步被xps图谱所证实。根据显示，峰位顶点位于284.5ev、399.7ev和531.7ev处分别对应c1s、n1s和o1s，并且这三种元素所占比
例分别65.95％、7.98％和24.76％。进一步扫描获取的高分辨c1s、n1s和o1s谱图显示c-c/c＝c，c-o/c-n等化学键的存在，验证了该碳点中羟基、氨基、羰基等活性基团的存在。
21.实施例2：血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)治疗缺血性脑卒中作用的研究
22.2.1实验动物
23.本实验采用spf级雄性sd大鼠(体重210.0
±
10.0g)为实验对象，并于温度(24.0
±
1.0)、相对湿度55-65％条件下适应性饲养7天，此期间保证动物能够自由饮水、进食。
24.实验动物给药、造模和取材：将90只sd级大鼠称重后按照随机数字表法分为五组：手术组、空白对照组以及高、中、低给药组，每组18只。实验期间，手术组和空白组在造模前6小时和1小时均腹腔注射生理盐水；高、中、低给药组分别在造模前6小时和1小时腹腔注射4，2，1mg/kg的血余炭碳点。造模成功1h后，空白组和给药组进行再灌注。手术组除未插入细丝外，均进行相同的操作步骤。再灌注24h后，使用0-4等级评分表来评估每组大鼠的行为，然后将每组大鼠随机分成三个亚组。第一个亚组评估大鼠的血脑屏障通透性；第二个亚组通过ttc染色法测定大鼠的脑梗死面积；第三个亚组用he染色法和透射电镜观察脑组织，通过elisa法测定il-6和tnf-α水平，用液相色谱-质谱法测定大脑皮质中asp、glu、tau、gly、5-ht和gaba的含量。
25.2.2血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)对大鼠缺血性脑卒中损伤的影响
26.图3a显示了不同分组大鼠造模成功后脑部梗死情况。与假手术组相比，模型组中代表脑缺血性梗死的白色部位面积更大，说明造模成功。不同剂量的给药组治疗后，大鼠脑部白色区域面积显著减小；图3b显示了血余炭纳米成分预处理对mcao诱导的梗死体积的影响。与对照组相比，三种不同剂量的给药组均显著降低了大鼠脑部梗死面积；图3d和图3e共同说明了血余炭给药组大鼠的脑组织完整性、炎症渗出和水肿程度较模型组明显改善，接近正常组。图3f说明了血余炭给药组大鼠的血脑屏障渗透性较模型组有明显的降低，同时图3h和3i表明血余血余炭碳纳米颗粒具有抗炎的活性。
27.2.3血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)改善神经功能评分
28.为评价血余炭碳纳米颗粒治疗效果，采用0～4分制评定神经功能(正常，0分；最大损伤分数，4分)。药物组神经功能缺损评分明显高于假手术组。与对照组相比，用血余炭碳纳米颗粒(1mg/kg)预处理的大鼠神经系统评分明显降低(对照组为2.89
±
0.68，1mg/kg给药组为2.11
±
0.68，p＜0.05，图3c)。(2，4mg/kg)血余炭碳纳米颗粒预处理组大鼠神经功能障碍明显低于对照组(4mg/kg给药组1.72
±
0.58，2mg/kg给药组1.89
±
0.68，p＜0.01，图3c)。
29.血余炭碳纳米颗粒各剂量组大鼠神经系统严重程度评分(mnss)均较对照组明显降低(3g)。
30.2.4血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)对缺血性脑卒中大鼠脑内神经递质的影响
31.如图4所示，血余炭碳纳米颗粒预给药组大鼠脑组织中兴奋性神经递质天冬氨酸(asp)，天冬酰胺(asn)，和谷氨酰胺(gln)in(409.57μg/g
±
287.40μg/g，12.68μg/g
±
12.75
μg/g，259.3μg/g
±
132.95μg/g)含量对照组(997.14μg/g
±
127.90μg/g，43.93μg/g
±
7.75μg/g，788.9
±
141.55μg/g)相比显著降低。抑制性神经递质，例如牛磺酸(tau)和甘氨酸(gly)与对照组相比也显著降低(728.64μg/g
±
92.28μg/g，181.98μg/g
±
15.2μg/g).但是5-ht(183.09μg/g
±
73.16μg/g)与对照组(110.14
±
51.36μg/g)相比显著升高。
32.2.5血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)的镇静作用
33.小鼠给予戊巴比妥钠(45mg/kg，腹腔注射，i.p.)后2-5分钟内出现右倾反射丧失。血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)可以降低戊巴比妥钠的睡眠潜伏期，但是与对照组无显著差异(图5a)。与对照组相比，血余炭碳纳米颗粒中、高剂量组可以显著延长戊巴比妥钠导致的睡眠总时间(图5b)，显示了一定的镇静作用。血余炭碳纳米颗粒可以显著降低小鼠的肛温(图5c)，各组给药后1、2、3、4h直肠温度变化与阳性对照药安定的变化无显著差异(图5d)。
34.2.6转录组测序
35.为了探索crci-cds神经保护作用的分子机制，我们在术后24小时分别用对照组、模型和血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)给药小鼠的神经细胞进行rna测序(rna-seq)。通过go、metascope和ipa富集分析，研究了显著改变的表达基因。我们发现了几个与兴奋性和抑制性神经递质相关的通路的变化，这些通路可能参与降低神经兴奋性毒性，如glu受体，包括nrsn2(在图6中突出显示)。此外，参与神经再生的基因，包括creb3(camp反应结合蛋白)和serf2，均上调。这些数据表明，血余炭碳纳米颗粒下调神经兴奋释放炎症介质。
36.2.7血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)安全性评价
37.图7表示不同浓度的血余炭碳纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点/纳米类成分)孵育48小时(a)、72小时(b)后raw 264.7的细胞活力，结果对细胞具有一定的轻微作用，无显著性，说明血余炭碳纳米颗粒的安全浓度范围比较大。(c.d)鸡胚脉络膜尿囊血管试验，经血余炭碳纳米颗粒处理的鸡尿囊膜未见血管出血、充血和凝固现象，说明血余炭碳纳米颗粒不是刺激性物质。