连接粘附分子样蛋白JAML在结直肠癌中的应用的制作方法

连接粘附分子样蛋白jaml在结直肠癌中的应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤预后评估技术领域，具体涉及连接粘附分子样蛋白jaml在结直肠癌中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.恶性肿瘤是当今世界人类和医学界面临的一大问题，其高死亡率严峻威胁着人类健康卫生事业的发展。多数恶性肿瘤早期发展较为隐匿，早期常无明显特异性症状，不易引起重视。因此，目前多数恶性肿瘤的早期诊断率仍较低。恶性肿瘤的预后与病理分期、组织类型及治疗手段等密切相关。恶性肿瘤的传统治疗主要包括手术切除、放疗和化疗。手术切除是治疗早期癌症的有效方法。但是大多数癌症发现时已是进展期或发生远处转移，失去手术治疗的机会，而传统放、化疗治疗效果欠佳，患者预后差，生存率较低。近年来，肿瘤分子靶向药物研究取得一定进展，但大多应用范围较窄，疗效有限。深入研究探索肿瘤发生、发展的分子机制对于肿瘤早期诊断、研制新的靶向治疗药物、提高患者生存质量有着十分重要的意义。
4.越来越多的研究表明，黏附、降解、运动、血管形成等复杂步骤促进肿瘤细胞浸润和转移。粘附分子参与了肿瘤转移的过程。近年来，免疫球蛋白超家族的连接粘附分子(junctional adhesion molecule, jam)在肿瘤发生和进展中的作用引起了广泛关注。目前研究发现，肿瘤发生与jam蛋白表达水平升高有关，而jam蛋白表达水平升高与预后不良有关。其机制可能与肿瘤细胞在局部浸润和转移扩散过程中向间质迁移和穿越血管壁的能力增强有关。
5.连接粘附分子样蛋白(junctional adhesion molecular like protein, jaml)是jams的新成员，它包括两个胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜片段和一个胞浆尾。已发现jaml在中性粒细胞、单核细胞、一些t细胞和急性早幼粒细胞白血病细胞中表达。jaml介导各种免疫细胞和内皮/上皮细胞的粘附和迁移过程，最终调节炎症反应。虽然近年来已经发现jaml在创面愈合和动脉粥样硬化过程中有确切的作用，但对其在肿瘤特别是结直肠癌(colorectal cancer, crc)中的作用研究甚少。


技术实现要素：

6.基于上述现有技术的不足，本发明提供连接粘附分子样蛋白jaml在结直肠癌中的应用。本发明通过研究发现，jaml在结直肠癌细胞中表达显著升高，且与肿瘤淋巴结转移以及肿瘤病理分期密切相关，是结直肠癌患者不良预后的生物标志物，因此可以通过检测jaml的表达来达到帮助判断结直肠癌恶性程度及患者预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。
7.本发明的第一个方面，提供检测jaml表达的物质在制备结直肠癌相关检测产品中的应用。
8.具体的，本发明通过研究发现，jaml在crc细胞中的表达情况与淋巴结转移情况、病理分期有关，与细胞分化程度无明显相关性。即crc有淋巴结转移且转移淋巴结个数越多越易出现jaml高表达，肿瘤分期较高时更易出现jaml高表达。同时，利用单因素生存分析的方法分析了jaml表达情况与crc患者生存期的关系，结果发现crc患者中jaml高表达与较差的总生存期（os）显著相关。
9.本发明的第二个方面，提供一种用于评估结直肠癌进展的系统，所述系统包括：i）分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自jaml表达水平的检测物质，以及；ii）评估模块，所述评估模块包含：根据i）中确定的所述jaml表达水平判断所述受试者的结直肠癌进展情况；所述受试者的结直肠癌进展情况包括但不限于受试者总生存期和结直肠癌病理特征进展情况。
10.所述结直肠癌病理特征至少包括结直肠癌的tnm分期以及淋巴结转移情况等。
11.本发明的第三个方面，提供一种用于评估结直肠癌进展的方法，所述方法包括：a）从受试者分离待测样本；b）在所述受试者的待测样本中检测上述jaml表达水平判断所述受试者结直肠癌进展情况。
12.本发明的第四个方面，提供上述jaml作为靶点在结直肠癌治疗和/或筛选结直肠癌药物中的应用。
13.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：上述技术方案选取结直肠癌作为研究病种，探讨jaml是否在结直肠癌细胞中表达：应用免疫组织化学染色方法，检测结直肠癌细胞中jaml的表达情况，并分析jaml表达与患者预后的关系。研究发现，jaml在结直肠癌细胞中表达显著升高，且与肿瘤淋巴结转移以及肿瘤病理分期密切相关，是结直肠癌患者不良预后的生物标志物。为临床上结直肠癌的防治提供重要的科学依据，因此具有良好的临床应用价值和社会效益。
附图说明
14.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
15.图1是本发明实施例中结直肠癌组织染色镜检图，左侧为20
×
，右侧为40
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16.图2是本发明实施例中结直肠癌癌旁组织染色镜检图，左侧为20
×
，右侧为40
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17.图3是本发明实施例中jaml在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况统计图；****代表p《0.0001。
18.图4是本发明实施例中jaml表达与淋巴结转移情况统计图。
19.图5是本发明实施例中jaml表达与结直肠癌的tnm分期统计图。
20.图6是本发明实施例中结直肠癌患者jaml表达情况与其总生存期相关图；*代表p《0.05。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
23.本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测jaml表达的物质在制备结直肠癌相关检测产品中的应用。
24.其中，所述检测jaml表达的物质可以是采用诸如elisa、抗体、染色剂、胶体金试纸条、蛋白芯片等现有检测待测样本中jaml相关蛋白表达情况的物质。
25.所述待测样本为人源样本，更具体的，所述待测样本为结直肠癌组织或细胞。
26.所述结直肠癌相关检测产品包括jaml免疫组织化学检测试剂盒，其至少可用于判断结直肠癌恶性程度以及结直肠癌患者预后情况。
27.具体的，本发明通过研究发现，jaml在crc细胞中的表达情况与淋巴结转移情况、病理分期有关，与细胞分化程度无明显相关性。即crc有淋巴结转移且转移淋巴结个数越多越易出现jaml高表达，肿瘤分期较高时更易出现jaml高表达。同时，利用单因素生存分析的方法分析了jaml表达情况与crc患者生存期的关系，结果发现crc患者中jaml高表达与较差的总生存期（os）显著相关。
28.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于评估结直肠癌进展的系统，所述系统包括：i）分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自jaml表达水平的检测物质，以及；ii）评估模块，所述评估模块包含：根据i）中确定的所述jaml表达水平判断所述受试者的结直肠癌进展情况；所述受试者的结直肠癌进展情况包括但不限于受试者总生存期和结直肠癌病理特征进展情况。
29.所述结直肠癌病理特征至少包括结直肠癌的tnm分期以及淋巴结转移情况等。
30.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于评估结直肠癌进展的方法，所述方法包括：a）从受试者分离待测样本；b）在所述受试者的待测样本中检测上述jaml表达水平判断所述受试者结直肠癌进展情况。
31.本发明的又一具体实施方式中，提供上述jaml作为靶点在结直肠癌治疗和/或筛选结直肠癌药物中的应用。
32.所述结直肠癌药物为预防和/或治疗结直肠癌的药物。
33.本发明的又一具体实施方式中，所述筛选结直肠癌药物的方法包括：1）采用候选物质处理表达和/或含有所述jaml的体系；设置不采用候选物质处理
的平行对照；2）完成步骤1）后，检测体系中所述jaml的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述jaml的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的结直肠癌药物。
34.本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
35.所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。
36.所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机颗粒、以及细菌或病毒、噬菌体、黏粒或质粒载体。
37.所述药物还可与其他预防和/或治疗结直肠癌的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
38.所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。
39.本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
40.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
41.实施例本实施例通过免疫组织化学染色方法研究jaml在结直肠癌细胞及癌旁正常腺体细胞中是否有表达。步骤：（1）将50例结直肠癌及对应癌旁组织切成4μm石蜡切片，60摄氏度烤片约1h。
42.（2）将切片放入二甲苯中浸泡10min，取出后放入另一缸二甲苯中浸泡10min，进行脱蜡。
43.（3）将切片按顺序放入无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇中分别浸泡5min，进行水化。
44.（4）将切片放入柠檬酸钠修复液中，置于微波炉中，高火5min，中低火10min，进行抗原修复。
45.（5）自然冷却后，用pbs冲洗3次，放于3%过氧化氢溶液中浸泡10min，封闭内源性过氧化物酶。
46.（6）用pbs冲洗3次，将整个组织用山羊血清覆盖，避免非特异性染色。
47.（7）半小时后，擦掉多余的血清，用稀释后的jaml一抗覆盖整个组织，放到保湿盒
中置于4摄氏度冰箱中过夜。
48.（8）次日将切片取出复温至室温，pbs冲洗3次，滴加反应增强剂，室温孵育20min。
49.（9）pbs冲洗3次，滴加二抗，室温孵育20min。
50.（10）用pbs冲洗3次，滴加dab显色液，显色时间为1min左右。
51.（11）在光学显微镜下观察显色情况，并用自来水及时终止染色。
52.（12）将切片放入苏木素中染色6s，进行细胞核着色。
53.（13）将切片按顺序放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中分别浸泡5min，进行脱水。
54.（14）依次放入两缸二甲苯中分别浸泡1min，进行透明。
55.（15）封片，于光学显微镜下观察染色情况。
56.根据染色沉着程度和阳性细胞比例进行评分。强度评分代表阳性肿瘤细胞的平均染色强度(0=无染色；1=浅黄色；2=棕黄色；3=褐色)。比例评分代表阳性染色肿瘤细胞的比例分数(0=0；1=25%以下；2=25-50%；3=50-75%；4=大于75%)。最终评分为强度评分与比例评分的乘积。每张切片随机选取5个视野，分别计分，最终取平均分：阳性≥8分；阴性《6分。
57.应用免疫组织化学染色实验，检测结直肠癌细胞及癌旁正常腺体细胞中jaml的表达情况。
58.结果如图1-3所示，在光镜下jaml的正常阳性表达为棕黄色，主要表达在在肿瘤细胞的胞质或胞膜上，少量表达在在间质的免疫细胞上，在癌旁的正常肠腺体细胞中几乎不会表达。在50例结直肠癌组织肿瘤组织中，有42例患者的jaml表达为阳性，阳性率为84%。在50例对应癌旁组织正常腺体组织中，有0例患者的jaml表达为阳性，阳性率为0。这证明：jaml在结直肠癌肿瘤组织中的表达显著增高。
59.为探讨jaml的表达情况与crc临床预后的关系，使用卡方检验分析了jaml在crc组织中的表达情况与细胞分化、局部淋巴结受累和病理分期等预后因素的相关性。结果如图4-5所示，jaml在crc细胞中的表达情况与淋巴结转移情况（p《0.05）、病理分期（p《0.05）有关，与细胞分化程度无明显相关性。即crc有淋巴结转移且转移淋巴结个数越多越易出现jaml高表达，肿瘤tnm分期较高时更易出现jaml高表达。
60.之后利用单因素生存分析的方法分析了jaml表达情况与crc患者生存期的关系，如图6所示，结果发现crc患者中jaml高表达与较差的os显著相关。
61.综上所述，jaml是crc患者不良预后的生物标志物，可能在肿瘤进展中发挥关键作用。本研究发现的jaml在结直肠癌细胞中的显著高表达对于肿瘤早期诊断、研制新的靶向治疗药物、提高患者生存质量有着十分重要的意义。
62.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。