血液凝固时间测定方法与流程

1.本发明涉及一种血液凝固时间测定方法。


背景技术：

2.血液凝固检查是通过在患者的血液样本中添加规定的试剂来测定血液凝固时间等，从而用于诊断患者的血液凝固能力的检查。作为血液凝固时间的典型的例子，有凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶时间等。能够利用血液凝固检查调查患者的止血能力、纤溶能力。血液凝固能力的异常主要导致凝固时间的延长。例如凝固时间的延长是由于抗凝药剂的影响、参与凝固的成分的减少、先天性血液凝固因子的缺乏、获得性的阻碍凝固反应的自身抗体等造成的。
3.近年来，进行血液凝固检查的自动测量的自动分析装置被广泛使用，能够简便地实施血液凝固检查。例如在某种自动分析装置中，对可在血液样本中添加试剂而得到的混合液照射光，基于得到的光量的变化测量该血液样本的凝固反应。例如在测量散射光量的情况下，从向血液样本添加试剂开始经过一定程度的时间的时刻，通过进行凝固，使散射光量急剧地上升，其后，凝固反应接近结束，并且散射光量饱和，而达到平稳。能够基于这样的散射光量的时间的变化测定血液凝固时间。
4.作为利用自动分析装置的凝固时间的算出方法，使用百分率法、微分法等几种方法(参照专利文献1)。在基于散射光量算出凝固时间的情况下，对于百分率法，典型的是，算出测量的散射光量达到其最大值的恒定比例的时刻为止的时间作为凝固时间。百分率法不仅可以对正常样本，还可以对低纤维蛋白原样本、乳糜样本、溶血样本等异常样本进行相当准确的凝固时间计算。另一方面，在基于百分率法的自动分析中，需要将样本的测量时间设定得较长，以使得即使利用低纤维蛋白原样本等凝固能力低的异常样本也能够检测出最大散射光量，因此分析需要耗费时间。
5.对于微分法，典型的是，算出散射光量的微分值达到峰或者其恒定比例的时刻为止的时间作为凝固时间。然而，利用低纤维蛋白原样本等凝固能力低的异常样本，有时散射光量的微分值也看不到清晰的峰。并且，异常样本中，有时产生2种以上的微分值的峰。有时使用基于通过微分值曲线的拟合制作的单峰的曲线来算出凝固时间的方法，但拟合有时损害关于样本的凝固能力的正确的信息。
6.并且，分析装置中的测光数据中包含由装置、试剂、样本的状态等引起的各种噪声，这些也可能带来了凝固时间的误检。对于血液样本的自动分析，要求除去噪声的不良影响来算出有可靠性的凝固时间。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1：日本特开平6－249855号公报。


技术实现要素：

10.本发明涉及一种血液凝固时间测定方法，能够正确地测定表示各种血液凝固反应曲线的血液样本的凝固时间。
11.即，本发明提供以下的技术方案。
12.〔1〕一种血液凝固时间测定方法，包括：
13.取得关于被测样本的凝固反应p(i)以及作为该反应p(i)的微分值的反应速度v(i)，其中，i表示测量点；
14.以v(i)与最大反应速度之比作为指标，算出计算起点te；以及
15.算出p(tc)＝p(te)
×
n％(0＜n＜100)的时间tc，将该tc确定为血液凝固时间。
16.〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述最大反应速度是目前为止取得的v(i)的最大值。
17.〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，上述最大反应速度是目前为止取得的v(i)的在从超过阈值vs后到最新的测量点为止的期间的最大值。
18.〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，在v(i)达到最大反应速度后，将成为该最大反应速度的s％(s为5～95的范围的规定值)的时间作为计算起点te而算出。
19.〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，在v(i)达到最大反应速度后，并且最大值连续宽度k(i)超过阈值ks的情况下，v(i)成为该最大反应速度的s％(s为5～95的范围的规定值)的时间作为计算起点te而算出，
20.该最大值连续宽度k(i)是i中的v(i)在达到最大反应速度后为恒定值并持续的时间或者测量点数。
21.〔6〕根据〔4〕或〔5〕所述的方法，其中，在峰宽度w(i)超过阈值ws的情况下，v(i)成为该最大反应速度的s％(s为5～95的范围的规定值)的时间作为计算起点te而算出，
22.该峰宽度w(i)是最新的i与v(i)达到最大反应速度前且v(i)为该最大反应速度的x％的点之间的时间跨度或者测量点数，
23.x大于等于1且小于100。
24.〔7〕一种凝固因子浓度的测定方法，包括：
25.基于利用上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法测定的被测样本的血液凝固时间来测定该被测样本的凝固因子浓度。
26.〔8〕根据〔7〕所述的方法，其中，上述凝固因子为纤维蛋白原。
27.根据本发明的方法，能够正确地测定表示包含正常样本、异常样本的各种血液凝固反应曲线的血液样本的凝固时间。并且，在利用自动分析装置实时地分析大量的样本的情况下，本发明的方法与以往的百分率法相比，能够使每1个样本的分析时间缩短化，可提高分析效率。
附图说明
28.图1是凝固反应曲线的例子。
29.图2是本发明的血液凝固时间测定方法的一个实施方式的基本流程。
30.图3是反应p(i)和反应速度v(i)。左为正常样本，右为缺乏fviii的样本。
31.图4是vmax的确定方法的概念图。s1～s6在时间序列示出从反应初期时刻(t1)到
vmax确定时刻(tt)为止取得的v(i)。
32.图5是v(i)与vp(i)、w(i)和k(i)的关系。a～d：正常样本，e～h：缺乏fviii的样本。
33.图6是测定的te、tc和利用百分率法的aptt的例子。a：aptt最小样本，b：aptt最大样本。图中，p(i)(上)和v(i)(下)是成为pmax的时刻(菱形)，与基于pmax的利用百分率法的aptt(三角形)、te
40
和te
20
(四边形)以及tc
40
和tc
20
(圆形)一并示出。
34.图7是tc5相对于利用百分率法的aptt的一次回归直线。
35.图8是tc5～tc
95
相对于利用百分率法的aptt的一次回归直线的斜率(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
36.图9是针对24个样本的tc5～tc
95
相对于对照(利用百分率法的aptt)的误差。表中的由灰色表示的单元表示tc与对照之差在对照的
±
5％以内(a)和
±
3％以内(b)。
37.图10中a：tc
0.5
相对于利用百分率法的aptt的一次回归直线。b～d：tc
0.5
～tc5相对于利用百分率法的aptt的一次回归直线的斜率(b)、截距(c)以及相关系数(d)。
38.图11是针对24个样本的tc
0.5
～tc5相对于对照(利用百分率法的aptt)的误差。表中的由灰色表示的单元表示tc与对照之差在对照的
±
1％以内。
39.图12是被测定的te、tc和利用百分率法的pt的例子。a：pt最小样本，b：pt最大样本。在图中，p(i)(上)和v(i)(下)与成为pmax的时刻(菱形)、基于pmax的利用百分率法的pt(三角形)、te
40
和te
15
(四边形)、以及tc
40
和tc
15
(圆形)一并示出。
40.图13是tc5相对于利用百分率法的pt的一次回归直线。
41.图14是tc5～tc
95
相对于利用百分率法的pt的一次回归直线的斜率(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
42.图15是针对23个样本的tc5～tc
95
相对于对照(利用百分率法的pt)的误差。表中的由灰色表示的单元表示tc与对照之差在对照的
±
5％以内(a)和
±
3％以内(b)。
43.图16是被测定的te、tc与利用百分率法的凝固时间的例子。a：[fbg]最小样本，b：[fbg]最大样本。图中，p(i)(上)和v(i)(下)与基于累计值比的计算起点(菱形)、基于该计算起点的利用百分率法的凝固时间(三角形)、te
75
和te
30
(四边形)、以及tc
75
和tc
30
(圆形)一并示出。
[0044]
图17是基于tc
30
的[fbg]运算值的相对于利用百分率法的[fbg]运算值的一次回归直线。
[0045]
图18是基于tc5～tc
95
的[fbg]运算值的相对于利用百分率法的[fbg]运算值的一次回归直线的倾度(a)、截距(b)以及相关系数(c)。
[0046]
图19是针对20个样本(10个样本
×
2次测定)成分的fbg浓度系列样本数据的基于tc5～tc
95
的[fbg]运算值的相对于期待值的误差。表中的由灰色表示的单元表示运算值与期待值的误差在
±
10％以内(a)和
±
5％以内(b)。
[0047]
图20是样本a(上)和b(下)的p(i)和v(i)(左)以及将p(i)和z(i)(中)与z(i)放大的图(右)。
[0048]
图21是实施例1(aptt)、实施例2(pt)以及实施例3(fbg)中使用的样本中的vmax(a)、kmax(b)以及wmax(c)的分布。各图中，点线表示vs(a)、ks(b)以及ws(c)的固定值，实线表示函数vs(a)、函数ks(b)以及函数ws(c)。
[0049]
图22是实施例1中aptt最小的样本(a)和最大的样本(b)中的v(t)与vs(上)、k(t)
与ks(中)以及w(t)与ws(下)的关系。
具体实施方式
[0050]
在血液凝固检查中，在血液样本中添加规定的试剂，测量其后的血液凝固反应，根据凝固反应测定血液凝固时间。在以下的本说明书中，存在将血液样本称为样本的情况。血液凝固反应的测量可使用一般的手段、例如测量散射光量、透射度、吸光度等的光学手段、或者测量血浆的粘度的力学手段等。正常样本的凝固反应曲线依赖测量手段，但基本上显示s形状。例如基于正常样本的散射光量的凝固反应曲线通常在从添加试剂后经过一定程度的时间的时刻因凝固的进行急剧地上升，其后，凝固反应接近结束，并且达到平稳。另一方面，具有凝固异常的异常样本的凝固反应曲线表示曲线的上升时间的延迟、缓慢的上升等因异常原因导致的各种形状。多种多样的异常样本的凝固反应曲线不易利用自动分析装置正确测定凝固时间。
[0051]
以往的一般的血液凝固时间测定中，取得至少到凝固反应结束为止的数据，基于取得的数据算出凝固时间。例如有在基于散射光量算出凝固时间的情况下，将散射光量饱和的时刻判断为凝固反应结束后，从添加试剂时刻开始到凝固反应结束时刻为止期间，凝固反应曲线达到最大速度或者其1/n的时刻确定为凝固时间的方法(微分法)；达到凝固反应结束时刻的散射光量的1/n的时刻确定为凝固时间的方法(百分率法，参照专利文献1)等。然而，由于上述的异常样本的凝固反应曲线的异常的形状、噪声，引起凝固反应速度的峰、凝固反应结束的误检，例如有时在反应速度的峰、反应结束过早的时刻进行探测。这样的误检会导致算出不正确的凝固时间。
[0052]
在自动分析装置中，为了高效地分析大量样本，因此期望针对一个样本取得需要的数据后，迅速地结束测量，开始接下来的样本的测量。然而，这种方法中，在上述过早的时刻的凝固反应结束的误检会导致过早的测量结束，存在丢失需要的数据的风险。另一方面，如果将每一个样本的凝固反应测量时间固定为充分长的时间，则能够防止因凝固反应结束的误检导致的数据丢失。然而，这种方法对于大量的样本而言测量时间不必要地变长，因此降低整体的分析效率。
[0053]
本发明能够防止由上述的凝固反应曲线的异常的形状带来的凝固时间的误检，并测定正确的凝固时间。另外，根据本发明，对于包含正常样本、异常样本的各种血液样本，能够应用各凝固时间测定所需的最低限度的凝固反应测量时间，因此能够使每1个样本中的分析时间缩短。
[0054]
〔血液凝固时间测定方法〕
[0055]
1.凝固反应测量
[0056]
本发明涉及一种血液样本的血液凝固时间测定方法。本发明的血液凝固时间测定方法(以下，也称为本发明的方法)测量将试剂混合而得的被检血液样本的凝固反应。基于该测量中得到的凝固反应的时间序列数据，测定血液凝固时间。作为本发明的方法中测定的血液凝固时间的例子，可举出凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、纤维蛋白原(fbg)浓度测定中的凝固时间等。在以下的本说明书中，主要作为凝固时间可例举出活化部分凝血活酶时间(aptt)，对本发明的方法进行说明。对于本领域技术人员而言，也可以实施本发明的方法向其他的凝固时间(例如凝血酶原时间(pt))的变更。
[0057]
在本发明的方法中，作为被检血液样本，优选使用被测人的血浆。该样本中可添加有凝固检查中通常使用的抗凝固剂。例如在使用加入有柠檬酸钠的采血管进行采血后，通过离心分离而得到血浆。
[0058]
在该被测样本中添加凝固时间测定试剂，开始血液凝固反应。可测量添加试剂后的混合液的凝固反应。使用的凝固时间测定试剂可结合测定目的任意地选择。用于测定各种凝固时间的试剂有市售(例如，aptt试剂coagpia aptt－n；积水医疗株式会社制)。凝固反应的测量只要使用一般的手段、例如测量散射光量、透射度、吸光度等的光学手段、或者测量血浆的粘度的力学手段等即可。凝固反应的反应开始时刻典型的是可定义为在样本中混合试剂而开始凝固反应的时刻，其他的时刻也可以定义为反应开始时刻。继续凝固反应的测量的时间例如可以是从样本与试剂混合的时刻起数十秒～7分钟左右。该测量时间可以是任意确定的固定的值，但也可以是到检测各样本的凝固反应的结束的时刻为止。另外，在本发明的方法中，可在凝固反应的完成前，在确定样本的凝固时间的时刻，结束该样本的测量，开始后续的样本的测量。可在该测量时间的期间以规定的间隔反复进行凝固反应的进行状况的测量(光学性检测的情况下测光)。例如可以以0.1秒间隔进行测量即可。该测量中的混合液的温度是通常的条件，例如30℃～40℃，优选为35℃～39℃。另外，测量的各种条件可根据被测样本、试剂、测量手段等适当地设定。
[0059]
上述的凝固反应测量中的一系列的操作可以使用自动分析装置进行。作为自动分析装置的一个例子，可举出血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)。或者，一部分的操作也可以利用手动操作进行。例如，能够由人来制备被测样本，其后的操作可以利用自动分析装置进行。
[0060]
图1表示测量数据的一个例子。图1的横轴表示氯化钙液的添加(反应开始时刻)后的经过时间(凝固反应时间)，纵轴表示散射光量。随着时间的经过，进行混合液的凝固反应，因此散射光量增加。在本说明书中，将示出这样的凝固反应量相对于凝固反应时间的变化的曲线称为凝固反应曲线。
[0061]
图1所示的基于散射光量的凝固反应曲线通常为s状。另一方面，基于透射光量的凝固反应曲线通常为反向s状。在以下的本说明书中，对使用了基于散射光量的凝固反应曲线的数据解析进行说明。
[0062]
2.数据解析
[0063]
以下，参照图2所示的本发明的血液凝固时间测定方法的一个实施方式的基本流程，对本发明进行说明。
[0064]
在本发明的方法中，利用分析装置，依次取得从反应开始时刻开始的凝固反应的测量数据r(i)(散射光量的测光值)。其中，“i”表示测量点编号。例如如果测量(测光)间隔为0.1秒，则r(i)表示测量开始0.1
×
i秒后的测量值。
[0065]
测量数据r(i)中包含测光时的噪声、与测光刚开始后出现的反应无关的变动，因此相对于该测量值，利用公知的方法进行平滑化处理。并且，在将凝固反应以散射光量进行测光的情况下，进行减去来自反应前的反应液的散射光量的零点调整处理。因此，取得的测量数据r(i)依次进行平滑化和零点调整，取得反应p(i)(步骤1)。测量数据的平滑化处理中可使用与噪声除去相关的各种公知方法中的任一种。例如，作为平滑化处理，可举出滤波处理或者通过差值、后述的区间内平均斜率的运算等求出微分值后将其积分的处理等。零点
调整中，例如，可以以测量开始时刻的值为0的方式调整平滑化的测量值。进而可以针对测量数据r(i)进行初始变动除去处理。初始变动除去处理只要从测光开始时刻到预先确定的初始变动除去时间为止的全部的值成为0即可。基本上，如图3所示，反应p(i)构成平滑化和零点调整而得的凝固反应曲线。
[0066]
根据求出的反应p(i)取得反应速度v(i)(步骤2)。v(i)通过将p(i)一阶微分而得到。微分处理可以任意的方法进行实施，例如可通过区间内平均斜率值的计算来进行。在区间内平均斜率值的计算中，可利用各测量点i的前后的恒定数的测量点，例如从i－k到i k为止的2k 1个测量点。例如可利用第i－2、i－1、i、i 1、i 2的5点的测量点。平均斜率值是指将这些多个测量点近似直线时的斜率值。直线近似的运算方法中可利用最小平方法等常规方法。这些测量点的平均斜率值可视为测量点i中的一阶微分值。以下的本说明书中，有时将p(i)和v(i)分别仅记为p和v。
[0067]
参照图3，对关于aptt为正常的正常样本和作为aptt延长的例子的第viii因子(fviii)缺乏样本(以下为延长样本)的反应p、反应速度v各个形状的相对差异进行说明。图3中左表示正常样本，右表示延长样本。横轴换算为从反应开始时刻起的时间。正常样本(左)中，反应p的上升点快，上升的斜率大，并且反应速度v的峰顶的位置高，形状几乎是左右对称的。然而，延长样本(右)中，反应p的上升点慢，上升的斜率小，并且反应速度v的峰顶的位置低(该例子中比正常样本的6分之1小)，形状为左右非对称，并且峰不是单峰，而是双峰性形状。
[0068]
本发明的方法中，使用上述的反应p(i)、反应速度v(i)的值来计算凝固时间tc。在本发明的方法中，p(i)和v(i)的取得可与凝固反应测量步骤一并进行。
[0069]
首先，基于目前为止取得的v(i)，确定最大反应速度vmax(步骤3)。vmax最单纯地表示目前为止取得的v(i)的最大值。另一方面，确定vmax时，需要排除在凝固反应初期观察到的来自测量设备的噪声、初始反应异常(所谓的早期反应)的影响。因此优选地vmax是v(i)超过用于除去噪声的规定的阈值后的最大峰的峰顶的值。
[0070]
优选地在本发明的方法中在依次取得的v(i)的峰具有规定的宽度时，将该峰的峰顶的值确定为vmax。图4中示出vmax的确定方法的一个实施方式的概念图。图4中，s1～s6的时间序列中表示从反应初期时刻(t1)到vmax确定时刻(tt)为止取得的v(i)。各图的v(i)中，取得的数据由实线表示，未取得的数据由虚线表示，最终v(i)形成具有峰顶(vmax)的曲线。
[0071]
·
s1表示凝固反应刚上升后的时刻t1为止的v(i)。t1的v(i)(＝v(t1))为速度阈值vs以下。vs是用于除去初始噪声的速度阈值。在v(i)超过vs时，开始vmax的探索。
[0072]
·
s2表示凝固速度达到上升中的时刻t2为止的v(i)。vp为临时的峰，v(i)表示从超过vs后到最新的测量点为止的v(i)的最大值。vp由时间t的函数vp(t)或者测量点的函数vp(i)表示。t2的v(i)(＝v(t2))超过vs，是t2的时刻的v(i)的最大值(即，vp(t2)＝v(t2))，但没有达到峰顶。
[0073]
·
s3是表示v(i)达到峰顶的时刻t3为止的v(i)。vp(t3)＝v(t3)。
[0074]
·
s4表示v(i)越过峰顶而开始减少的时刻t4为止的v(i)。t4的v(i)的最大值vp(t4)还是峰顶的状态(＝v(t3))。k是最大值连续宽度，表示vp为恒定值即为峰顶(＝v(t3))并持续的时间的跨度(或者测量点数)。k由时间t的函数k(t)或者测量点的函数k(i)表示，
例如，图中k(t4)表示时刻t4的k，相当于从峰顶的时刻t3到t4为止的时间跨度。时刻t4的k(i)是在k(t4)乘以凝固反应测量的测量频度(测量点数/秒)而得的值。
[0075]
·
s5表示v(i)进一步减少的时刻t5为止的v(i)。到t5的时刻为止，vp持续为峰顶v(t3)，k(t5)超过最大值连续宽度阈值ks(即k(t5)＞ks)。此时，vp(t5)(＝v(t3))确定为临时的最大值vmax0。
[0076]
·
s6表示vmax的检测结束点tt的v(i)。tt是在检测vmax0后，k(i)＞ks的状态下v(i)减少到规定值为止的点(时刻或者测量点)。tt是作为在s6中v(i)减少到vmax0的50％的时刻被规定，但可以任意地设定。优选地，tt是v(i)为vmax0的40～95％的点。在达到tt的点，vmax0被确定为真正的最大值vmax，满足v(i)＝vmax的时间被确定为最大值时间vmaxt。另一方面，在检测vmax0后，v(i)不减少到该规定值而再次上升并超过vmax0的情况下，k(i)复位为0，再次执行s2～s5，检测到新的vmax0。
[0077]
表1表示s1～s5的v(i)的状态。
[0078]
[表1]
[0079]
反应状态s1s2s3s4s5s6时间：t(秒)t1t2t3t4t5ttv(i)是否超过vs？否是是是是是临时的峰vp(i)-v(t2)v(t3)v(t3)v(t3)v(t3)最大值连续宽度：k(i)-11(t4-t3)xf 1(t5-t3)xf 1(tt-t3)xf 1k(i)是否超过ks？-否否否是是vmax0
‑‑‑‑
v(t3)v(t3)vmax
‑‑‑‑‑
v(t3)
[0080]
f：凝固反应测量的测量频率(测量点数/秒)
[0081]
在v(i)在测量时间内不超过速度阈值vs的情况下，判定为没有凝固反应。另外，虽然在测量时间内v(i)超过了vs，但在最大值连续宽度k没有超过阈值ks的情况下，判定为凝固反应未终止。另外，在检测到vmax0后，在无法检测到检测结束点tt而没有确定vmax的情况下，判定凝固反应未终止。
[0082]
在其它的一个实施方式中，可以以v(i)的峰宽度w作为基础来确定vmax。峰宽度w是最新的点与在其以前且vp以前v(i)为临时的峰vp的x％高度的点之间的宽度(时间、或者测量点数)。x可以为大于等于1且小于100，但优选为40～95。x优选为比后述的计算起点te的计算中使用的参数s大，但也可以与s相同或者比其小。更详细而言，在测定的凝固时间为aptt的情况下，优选为x＝41～80，在凝固时间为pt的情况下，优选为x＝40～95。在本说明书中，峰宽度w根据作为基准的x，有时称为“x％峰宽度”。在本方法中，与上述的步骤相同地，v(i)超过vs后，依次检测vp，求出时间t的峰宽度w(t)或者测量点i的峰宽度w(i)。在峰宽度w超过峰宽度阈值ws时，vp被确定为临时的最大值vmax0，其后在达到tt(定义与上述相同)的点，vmax0被确定为真正的最大值vmax，满足v(i)＝vp的时间被确定为最大值时间vmaxt。或者，更单纯地也可以将tt中的vp设为真正的最大值vmax。其中，在峰宽度w在测量时间内不超过阈值ws的情况下，判定凝固反应未终止。
[0083]
在速度阈值vs、最大值连续宽度阈值ks、峰宽度阈值ws中，可以分别使用预先确定的固定值。例如在包含正常样本和各种异常样本的参照样本集团中进行凝固时间测量，使
用得到的该集团的v(i)的数据，可以设定适当的vs、ks、ws。例如vs被设定成比由该参照样本集团的测量数据求出的各样本的vmax的中的最小的vmax还要小的值。对于ks、ws，按照上述的步骤求出关于该参照样本集团的各样本中的最大值连续宽度k和峰宽度w，可以基于求出的k、w将适当的值作为ks或ws设定。优选地，ks设定成比针对各样本求出的k(i)的最大值(以下也称为kmax)中的最小值小的值，ws设定成比针对各样本求出的w(i)的最大值(以下也称为wmax)中的最小值还要小的值。
[0084]
或者，速度阈值vs、最大值连续宽度阈值ks、峰宽度阈值ws可以为时间t、测量点i的函数。即使在将vs、ks、ws作为t、i的函数的情况下，只要与上述相同地基于由参照样本集团的各样本求出的vmax、ks、ws的值设定函数即可。例如vs可以设定成函数，该函数由在将由各样本求出的vmax相对于vmaxt制成曲线的图表上作为一直显示比vmax小的值的曲线表示。同样地，ks、ws分别可以设定为函数，该函数由将各样本求出的kmax和wmax相对于vmaxt制成曲线的图表上作为一直显示比kmax和wmax小的值的曲线表示。在优选的实施方式中，函数vs、ks、ws例如可以按照后述的参考例1所述的步骤进行计算，可以按照下式求出。
[0085]
vs＝b (a
÷
t2)
[0086]
ks＝b’ (a
’×
t2)
[0087]
ws＝b” (a
”×
t2)
[0088]
[a、a’、a”、b、b’、b”为系数，t为时间(秒)]
[0089]
或者，将上式的t换算为i，可以将vs、ks、ws作为测量点i的函数求出。通过将vs、ks、ws设为可变值，从而即使在异常样本中经常看到的反应速度v(i)小的情况或者成为二峰性的情况下，也能够适当地检测vmax。
[0090]
图5中示出了v(i)与vp(i)、w(i)和k(i)之间的关系。图5a～d表示aptt为正常的正常样本中的v(i)与vp(i)、w(i)和k(i)的v(i)之间的关系。图5e～h表示异常(fviii缺乏)样本中的v(i)与vp(i)、w(i)和k(i)的v(i)之间的关系。各图中，v(i)在vmax之后直到成为vmax的70％的时刻(检测结束点tt)由一点划线表示，其之后由点线表示，并且vp(i)、w(i)以及k(i)由实线表示。w(i)使用70％峰宽度。如图5a～d所示，正常样本的v(i)表示单峰性的峰，vp(i)中v(i)增加至达到峰(vmax)，其后为恒定。w(i)增加到检测结束点tt，其后为恒定。k(i)增加到检测结束点tt。另一方面，如图5e～h所示的异常样本的v(i)表示包含大量小峰的大致双峰性的峰，第二高的峰成为最大值vmax。vp(i)中通过使v(i)达到更高峰而阶段状地增加，v(i)达到vmax后为恒定。w(i)增加到检测结束点tt，其后为恒定。k(i)每次出现更高的v(i)的峰，都复位成0，由此出现与v(i)峰对应的k(i)的峰。
[0091]
由于确定了vmax，因此在vmaxt后的时刻确定v(i)为vmax(100％)的s％的点te(步骤4)。te是基于v(i)的相对于最大反应速度vmax的比(以下，也称为“最大速度比”)算出的、被视为凝固反应进行了相当程度的时刻(或者测量点)。这里，s％相当于最大速度比，是vmaxt＜te。s可以由比0大且小于100的范围确定，优选为s＝1～95，更优选为5～95。s越小，越有凝固时间的测定精度提高的趋势，但需要的测量时间变长。在测定的凝固时间为aptt的情况下，进一步优选为s＝5～40，进一步优选为s＝5～20，在凝固时间为pt的情况下，进一步优选为s＝5～40，进一步优选为s＝5～15。在本发明的方法中，te作为凝固时间的计算起点使用。
[0092]
接下来，使用直到te为止取得的p(i)，确定p(i)为p(te)的n％(p(tc)＝p(te)
×
n％)的时刻tc(步骤5)。得到的tc作为凝固时间来确定。n可以为0＜n＜100，但优选为10～70，更优选为20～60。
[0093]
如后述的实施例所示，基于本发明的方法中算出的最大速度比的凝固时间tc与利用作为以往一般的方法的百分率法(例如，将p(i)达到其最大值pmax的恒定比例为止的时间作为凝固时间进行计算的方法)得到的凝固时间具有高相关性。因此，利用本发明的方法，可以以良好的精度确定被测样本的凝固时间。并且，在本发明的方法中，通过检测反应速度v(i)的实际峰的工序(上述的步骤3)，不易受到测量噪声、早期反应等的影响，能够进行可靠性更高的凝固时间测定。
[0094]
并且，在本发明的方法中，在反应速度v(i)达到最大反应速度vmax后，能够在达到规定的阈值(vmax
×
s％)时确定凝固时间。因此，在本发明的方法中，可以不像以往的百分率法那样在凝固反应达到稳定之前持续测量。并且，即使在通过自动分析装置分析多个样本的情况下，也可以根据本发明的方法，不需要像以往的百分率法那样为了凝固能力低的异常样本而设定较长的测量时间。因此，根据本发明，可以使样本的分析时间缩短化或者最佳化，能够提高分析的效率。
[0095]
3.凝固因子浓度测定
[0096]
通常的血液中包含凝固第i～第xiii因子等凝固因子，这些凝固因子的异常、缺乏导致凝固能力的异常。通常被测样本的凝固因子浓度可以使用针对凝固因子的专用试剂并基于由该被测样本制备的测定试样的凝固时间来进行测定。因此，使用通过本发明的方法测定的该测定试样的凝固时间，能够测定该被测样本的凝固因子浓度。通常凝固因子浓度基于表示凝固时间与凝固因子浓度的关系的标准曲线进行测定。因此，通过对预先制成的标准曲线，照射利用本发明的方法测定的测定试样的凝固时间，从而能够算出该被测样本的凝固因子浓度。作为本发明的方法中测定的凝固因子的优选的例子，可举出第i因子(纤维蛋白原)、第viii因子、第ix因子等。
[0097]
在利用本发明的方法的用于测定凝固因子浓度的凝固时间的计算中，用于确定基于最大速度比的计算起点te的v(i)的阈值(“vmax
×
s％”)优选是由vmax的1～95％(即s＝1～95)的范围设定的规定值，是在更优选为vmax的5～95％(即s＝5～95)，进一步优选为vmax的20～95％(即s＝20～95)，进一步优选为vmax的30～75％(即s＝30～75)的范围设定的规定值。另外，在用于确定vmax的x％峰宽度w中，优选使用75％峰宽度～95％峰宽度，其中，x优选为比s大，但也可以与s相同或者比其小。
[0098]
4.对其它的凝固反应测量法的应用
[0099]
以上，将基于散射光量的凝固反应测量的情况作为例子，说明了本发明的血液凝固时间测定方法。然而，如果为本领域技术人员，则能够将本发明的方法应用于使用了其它的凝固反应测量法(例如基于透射度、吸光度、粘度等的血液凝固反应测量法)的血液凝固时间测定方法。例如由基于透射光量的反s状的凝固反应曲线得到的反应p(i)对于基于上述的散射光量，正负是相反的。在这样的情况下，在上述的步骤1～4中，p(i)和v(i)的符号反转，例如确定最小反应速度vmin代替最大反应速度vmax等对于本领域技术人员是显而易见的。
[0100]
实施例
[0101]
以下，举出实施例，对本发明进一步详细进行说明，本发明并不限于这些实施例。
[0102]
实施例1凝固时间(aptt)测定
[0103]
1.方法
[0104]
1.1)试样
[0105]
作为被测样本，使用了正常血浆9个样本和aptt延长的异常血浆15个样本的合计24个样本。正常血浆使用了clinisys associates,ltd.制的正常供体血浆(normal donor plasma)。就异常血浆而言，作为缺乏凝固因子的血浆(factor deficient plasma)、缺乏第fviii因子的血浆、缺乏第fix因子的血浆、缺乏第fxi因子的血浆以及缺乏第fxii因子的血浆使用了各2个样本，狼疮抗凝物阳性血浆(lupus anticoagulant plasma)使用了2个样本，以及含未分级的肝素的血浆(anticoagulant plasma)使用了5个样本(均为clinisys associates,ltd.制)。
[0106]
1.2)试剂
[0107]
作为aptt试剂，使用coagpia aptt－n(积水医疗株式会社制)。
[0108]
1.3)凝固反应测量
[0109]
凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。将样本50μl分注到比色皿(反应容器)后，在37℃加热45秒钟，接着，在比色皿中添加加热到约37℃的aptt试剂50μl，进而在经过171秒后，添加氯化钙液50μl而开始凝固反应。反应在维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的测量(测光)是通过将以波长660nm的led光作为光源的光照射到比色皿，以0.1秒间隔对90度侧方散射光的散射光量进行测光而进行。最大测量时间为360秒(数据数3600个，0.1秒间隔)。
[0110]
1.4)反应p(i)和反应速度v(i)的取得
[0111]
对于来自各样本的测光数据进行包含除去噪声的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整处理，制成反应p(i)。由p(i)算出了一阶微分值v(i)。
[0112]
1.5)aptt测定(百分率法)
[0113]
通过百分率法，测定各样本的aptt。即，在测量时间内，将p(i)达到最大值pmax的时刻确定为凝固反应结束点，将凝固反应结束点的达到散射光量的50％的时刻确定为aptt。将被测样本的种类和数量以及各种类的样本中的aptt的最小值和最大值示于表2。
[0114]
[表2]
[0115][0116]
1.6)基于最大速度比的凝固时间tc的计算
[0117]
根据由各样本得到的v(i)，检测出最大反应速度vmax。在最大值连续宽度k(i)超
过最大值连续宽度阈值ks后，将达到检测结束点tt(v(i)达到vmax的70％的时刻)时的临时的最大值vmax0确定为vmax。速度阈值vs是基于后述的参考例1的步骤得到由以下的式表示的函数。ks为2.2。
[0118]
vs(i)＝－83 (158214
÷
i2)[i为测量点]
[0119]
确定成为v(i)＝vmax
×
s％的时间te(s＝0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90以及95)。确定成为p(tc)＝p(te)
×
50％的时间tc，作为凝固时间。将针对各s确定的te和tc根据对应的s，以下分别称为tes、tcs。例如s＝5时的te和tc分别称为te5、tc5。
[0120]
图6中示出了测定的te、tc和利用百分率法得到的aptt的例子。图6a、b中分别一并示出了利用百分率法的aptt为最小(27.2秒)和最大(14.2秒)的样本的p(i)(上)和v(i)(下)、成为pmax的时刻(菱形)、基于pmax的利用百分率法的aptt(三角形)、te
40
和te
20
(四边形)以及tc
40
和tc
20
(圆形)。图6a、b中的任一者示出了由圆形标记的tc
40
和tc
20
与由三角标记的基于pmax的利用百分率法(以往方法)的aptt接近，反映出aptt。另外，图6a、b中的任一者示出了p(i)为最大值pmax的时间约为360秒，并且pmax的时间与te
40
和te
20
的时间差在图6a中约为320秒，在图6b中约为140～160秒。通过基于最大速度比求出te、tc，从而与以往的基于pmax的百分率法相比，能够早140秒以上算出aptt。
[0121]
2.tc的精度评价
[0122]
2.1)相关性解析
[0123]
评价利用百分率法的aptt与基于最大速度比的aptt(tc)的相关性。对于各s＝5～95时的tc(tc5～tc
95
)，进行与利用百分率法的aptt的一次回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。
[0124]
图7中示出了相对于针对24个样本的利用百分率法的aptt的tc5的一次回归直线。tc5与利用百分率法的aptt具有高相关性。对利用百分率法的aptt与tc的相关性进行评价。对于各s＝5～95时的tc(tc5～tc
95
)，进行与利用百分率法的aptt的一次回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。图8中示出了tc5～tc
95
相对于利用百分率法的aptt的一次回归直线的斜率、截距以及相关系数。在tc5～tc
95
之间，回归直线的斜率为0.86～1.00，截距为-0.1～1.6，相关系数为0.992～1.000(图8a～c)。可确认基于最大速度比的aptt测定法具有满足厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数0.9以上且回归直线式的斜率0.9～1.1”的性能。
[0125]
2.2)测定的正确性
[0126]
将针对24个样本的tc5～tc
95
与对照(利用百分率法的aptt)进行比较。图9ab的表的各行表示各样本的tc(从左到tc5～tc
95
)。在tc与对照之差落入对照的
±
5％以内(图9a)和
±
3％以内(图9b)的情况下，由灰色表示。全部的样本的tc5～tc
40
为
±
5％以内的误差，与对照一致，全部的样本的tc5～tc
20
为
±
3％以内的误差，与对照一致。
[0127]
3.tc的精度评价－2
[0128]
按照与2.1)相同的步骤，对于各tc
0.5
～tc5，进行与利用百分率法aptt的一次回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。图10a中分别示出了相对于24个样本的利用百分率法的aptt的tc
0.5
的一次回归直线，图10b～d中示出了tc
0.5
～tc5的相对于百分率法aptt的一次回归直线的斜率、截距以及相关系数。tc
0.5
～tc5均相对于利用百分率法的
aptt具有非常高的相关性。图11是按照与2.2)相同的步骤对24个样本的tc
0.5
～tc5和对照(利用百分率法的aptt)进行比较而得的表，在tc与对照之差落入对照的
±
1％以内的情况下，由灰色表示。全部的样本的tc
0.5
～tc5为
±
1％以内的误差，与对照一致。
[0129]
实施例2凝固时间(pt)测定
[0130]
1.方法
[0131]
1.1)试样
[0132]
作为被测样本，使用了正常血浆9个样本和pt延长的异常血浆14个样本的合计23个样本。正常血浆使用健康人血浆。异常血浆使用给予了抗凝药华法林的患者血浆，使用了表示血中华法林浓度的pt－inr值为1到2的5个样本、2到3的5个样本、以及3到4的4个样本。
[0133]
1.2)凝固反应测量
[0134]
凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。在将样本50μl分注到比色皿(反应容器)后，在37℃下加热45秒钟，接着，在比色皿中添加加热到约37℃的凝血活酶液100μl而开始凝固反应。反应在维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的测量(测光)将以波长660nm的led光作为光源的光照射到比色皿，以0.1秒间隔对90度侧方散射光的散射光量进行测光而进行。最大测量时间为300秒(数据数量为3000个，0.1秒间隔)。
[0135]
1.3)反应p(i)和反应速度v(i)的取得
[0136]
对于从各样本的测光数据进行包含除去噪声的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整处理，制成反应p(i)。由p(i)算出了一阶微分值v(i)。
[0137]
1.4)pt测定(百分率法)
[0138]
利用百分率法，测定各样本的pt。将在测量时间内p(i)达到最大值pmax的时刻确定为凝固反应结束点，将达到凝固反应结束点的散射光量的45％的时刻确定为pt。将被测样本的种类和数量以及各种类的样本中的pt的最小值和最大值示于表3。
[0139]
[表3]
[0140][0141]
1.5)基于最大速度比的凝固时间tc的计算
[0142]
根据由各样本得到的v(i)，按照与实施例1相同的步骤检测出最大反应速度vmax。速度阈值vs是按照后述的参考例1的步骤，由下式表示的函数。ks为0.8。
[0143]
vs(i)＝－148 (51935
÷
i2)[i为测量点]
[0144]
确定成为v(i)＝vmax
×
s％的时间te、以及成为p(tc)＝p(te)
×
45％的时间tc(s＝5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90以及95)，得到tc5～tc
95
。
[0145]
图12中示出测定的te、tc和利用百分率法的pt的例子。图12a、b中分别一并示出了利用分率法的pt为最小(9.5秒)和最大(51.6秒)的样本的p(i)(上)和v(i)(下)、成为pmax的时刻(菱形)、基于pmax的利用百分率法的pt(三角形)、te
40
和te
15
(四边形)以及tc
40
和tc
15
(圆形)。图12a、b中的任一者示出了由圆形标记的tc
40
和tc
15
与由三角标记的、基于pmax的利用百分率法(以往方法)的pt接近，反映pt。另外，图12a、b中的任一者中p(i)为最大值pmax的时间约为300秒，并且pmax的时间与te
40
和te
15
的时间差在图12a中约为285秒，在图12b中约为240～250秒。通过基于最大速度比求出te、tc，从而与以往的基于pmax的百分率法相比，能够早240秒以上算出pt。
[0146]
2.tc的精度评价
[0147]
2.1)相关性解析
[0148]
按照与实施例1的2.1)相同的步骤，对于各tc5～tc
95
，进行与利用百分率法测定的pt的一次回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。
[0149]
图13示出了相对于关于23个样本的利用百分率法的pt的、tc5的一次回归直线。tc5与利用百分率法的pt具有高相关性。评价利用百分率法的pt与tc的相关性。对于各s＝5～95时的tc(tc5～tc
95
)，进行利用百分率法的pt的一次回归分析，求出回归直线的斜率、截距以及相关系数。图14中示出了tc5～tc
95
的相对于百分率法pt的一次回归直线的斜率、截距以及相关系数。在tc5～tc
95
之间，回归直线的斜率为0.91～1.00，截距为0.0～0.2，相关系数全部为1.000(图14a～c)。可确认基于最大速度比的pt测定法具有满足厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数0.9以上，并且回归直线式的斜率0.9～1.1”的性能。
[0150]
2.2)测定的正确性
[0151]
将23个样本的tc5～tc
95
与对照(利用百分率法的pt)进行比较。图15ab的表的各行表示各样本的tc(从左起tc5～tc
95
)。在tc与对照之差落入对照的
±
5％以内(图15a)和
±
3％以内(图15b)的情况下，由灰色表示。全部的样本的tc5～tc
40
为
±
5％以内的误差，与对照一致，全部的样本的tc5～tc
15
为
±
3％以内的误差，与对照一致。
[0152]
实施例3纤维蛋白原浓度测定
[0153]
1.方法
[0154]
1.1)试样
[0155]
在除去人纤维蛋白原的血浆(affinity biologicals inc.制的fibrinogen deficient human plasma，产品名：fg deficient plasma)中添加人纤维蛋白原(enzyme research laboratories制的human fibrinogen，产品名：fib 2)而制成纤维蛋白原浓度([fbg])为980mg/dl的样本(样本10)。作为用于制成标准曲线的标准样本，将样本10和生理食盐水以容量比1：9、7：3和10：0进行混合，制备纤维蛋白原浓度([fbg])分别为98mg/dl、686mg/dl以及980mg/dl的三种样本。另外，将样本10和上述人纤维蛋白原除去血浆以容量比从1：9到10：0混合，制备纤维蛋白原浓度([fbg])阶段性不同的10个浓度系列样本(表4)。
[0156]
[表4]
[0157]
样本稀释比率[fbg](mg/dl)11∶99822∶819633∶729444∶639255∶5490
66∶458877∶368688∶278499∶18821010∶0980
[0158]
1.2)凝固反应测量
[0159]
纤维蛋白原测定试剂使用附属于coagpiafbg(积水医疗株式会社制)的凝血酶试剂和样本稀释液。凝固反应测量使用血液凝固自动分析装置cp3000(积水医疗株式会社制)进行。将样本10μl和样本稀释液90μl分注于比色皿，在37℃加热45秒钟后，在比色皿中添加加热到约37℃的凝血酶试剂50μl，开始凝固反应。反应在维持约37℃的状态下进行。凝固反应的测量将以波长660nm的led光作为光源的光照射到比色皿，通过以0.1秒间隔测量90度侧方散射光的散射光量进行。最大测量时间为300秒(数据数3000个，0.1秒间隔)。凝固反应的测量对于3个标准样本和10个浓度系列样本，分别各进行2次。
[0160]
1.3)反应p(i)和反应速度v(i)的制作
[0161]
对于来自各样本的测光数据进行包含除去噪声的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整处理，制成反应p(i)。由p(i)，算出一阶微分值v(i)。
[0162]
1.4)利用百分率法的纤维蛋白原浓度的计算
[0163]
低纤维蛋白原样本的反应曲线具有直至测量的最后持续地缓慢上升的情况，因此将反应曲线的最大值pmax作为百分率法的计算起点是不适当的。因此，在本实施例中，基于反应p(i)的累计值比z(i)(参照专利文献1)来确定百分率法的计算起点。累计值比z(i)反映p(i)的变化的趋势。即z(i)在p(i)上升的反应初期较大，但随着p(i)近似稳定，渐渐地接近1。本实施例中，通过以下的式子由p(i)算出z(i)，将z(i)比阈值zs小的时刻作为百分率法的计算起点。zs为1.05。
[0164]
z(i)＝{p(i 1) p(i 2) ... p(i m)}/{p(i-m) p(i-m 1) ... p(i-1)}
[0165]
(m＝20)
[0166]
利用百分率法，测定3个标准样本和浓度系列10个样本的凝固时间。即将上述计算起点的p(i)设为100％时，将p(i)达到63％的时刻确定为凝固时间。各样本的凝固时间基于2次凝固反应测量分别测定2次。对于由3个标准样本测定的凝固时间，算出2次测定的平均值，将该平均值的对数相对于该标准样本的[fbg](mg/dl)的对数制成曲线，制成利用百分率法的标准曲线。根据制成的标准曲线，算出各浓度系列样本的纤维蛋白原浓度(利用百分率法的[fbg]运算值，mg/dl)。
[0167]
1.5)基于最大速度比的纤维蛋白原浓度的计算
[0168]
根据由各样本得到的v(i)，按照与实施例1相同的步骤检测最大反应速度vmax。速度阈值vs是按照后述的参考例1的步骤由下式表示的函数。ks为1.1。
[0169]
vs(i)＝19 (9357
÷
i2)[i为测量点]
[0170]
确定成为v(i)＝vmax
×
s％的时间te以及成为p(tc)＝p(te)
×
63％的时间tc(s＝5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90以及95)、tc5～tc
95
。对于10个浓度系列样本，分别计算tc5～tc
95
各2次，得到20个样本部分的数据。并且，对3个标准样本分别计算tc5～tc
95
各2次，算出2次测定的平均值。将该平均值的对数相对于该标准样本的
[fbg](mg/dl)的对数制成曲线，制成基于tc的标准曲线。根据制成的标准曲线，算出各浓度系列样本的纤维蛋白原浓度(基于最大速度比的[fbg]运算值，mg/dl)。
[0171]
图16中表示被测定的te、tc与利用百分率法的凝固时间的例子。图16a、b中一并示出了[fbg]为最小(98mg/dl)和最大(980mg/dl)的样本的p(i)(上)和v(i)(下)、基于累计值比的计算起点(菱形)、基于该计算起点的利用百分率法的凝固时间(三角形)、te
75
和te
30
(四边形)以及tc
75
和tc
30
(圆形)。图16a、b中任一者示出了由圆形标记的tc
75
和tc
30
与由三角标记的利用百分率法(以往方法)的凝固时间接近，反映凝固时间。
[0172]
2.基于tc的纤维蛋白原浓度测定的精度评价
[0173]
2.1)相关性解析
[0174]
图17中表示基于浓度系列样本的数据(n＝10
×
2)的、相对于利用百分率法的[fbg]运算值的、tc
30
的[fbg]运算值(mg/dl)的一次回归直线。基于tc
30
的[fbg]运算值与利用百分率法的[fbg]运算值具有高相关性。图18中表示由tc5～tc
95
算出的[fbg]运算值的、相对于利用百分率法的[fbg]运算值的一次回归直线的斜率、截距以及相关系数。在tc5～tc
95
之间，回归直线的斜率为0.97～1.06，截距为-27.1～32.0，相关系数为0.992～0.999(图18a～c)。可确认到基于最大速度比的纤维蛋白原浓度测定法带来与基于百分率法的标准的方法相同的结果，因此具有满足厚生劳动省的体外诊断用医药品承认基准“与对照测定方法比较，相关系数0.9以上，并且回归直线式的斜率0.9～1.1”的性能。
[0175]
2.2)测定的正确性
[0176]
将关于浓度系列样本的数据(表4的10个样本
×
2)的基于tc5～tc
95
的[fbg]运算值与期待值(表4中示出的样本的fbg浓度)进行了比较。图19ab的表的各行表示各样本的tc(从左到tc5～tc
95
)。在tc与期待值的误差落入
±
10％以内(图19a)和
±
5％以内(图19b)的情况下，由灰色表示。全部的样本的tc
20
～tc
95
为
±
10％以内的误差，与期待值一致，全部的样本的tc
30
～tc
75
为
±
5％以内的误差，与期待值一致。
[0177]
实施例4正确性评价
[0178]
将本方法的基于最大速度比的凝固时间测定法的正确性与专利文献1所记载的方法(使用反应p(i)的累计值比z(i)的凝固时间测定法)进行比较。z(i)是第1测量区间的p(i)的累计值和与该第1区间相邻的第2测量区间的p(i)的累计值之比，反映出p(i)的变化的趋势。z(i)在p(i)上升的反应初期较大，但随着p(i)趋于稳定，逐渐接近1。专利文献1所记载的方法中，z(i)小于阈值zs后，将满足规定的值的时刻确定为凝固时间。基于z(i)的凝固时间测定法作为不仅能够正确地测定正常样本而且能够正确地测定低纤维蛋白原样本等的异常样本的凝固时间的、可靠性高的凝固时间测定方法而公开。本实施例中，将基于最大速度比的本方法的凝固时间测定法的正确性通过与使用累计值比的凝固时间测定法的比较而进行了评价。
[0179]
1.方法
[0180]
1.1)试样
[0181]
样本a：以未分级的肝素浓度成为0.9iu/ml的方式在正常血浆中添加了含未分级的肝素的样本(aptt 139.0秒)。
[0182]
样本b：实施例1中使用的含肝素的血浆中的、aptt为最大(126.2秒)的样本。
[0183]
1.2)凝固反应测量
[0184]
与实施例1相同。
[0185]
1.3)反应p(i)、反应速度v(i)以及累计值比z(i)的制作
[0186]
对来自各样本的测光数据进行包含除去噪声的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整处理，制成反应p(i)。由p(i)算出一阶微分值v(i)。利用下述式算出反应p(i)的累计值比z(i)。
[0187]
z(i)＝{p(i 1) p(i 2) ... p(i m)}/{p(i-m) p(i-m 1) ... p(i-1)}(m＝20)
[0188]
图20中示出2个样本a(上)和b(下)的、将p(i)和v(i)(左)、以及p(i)以及z(i)(中)和z(i)放大的图(右)。样本a中，测量开始后，v(i)中没有看到清楚的峰(初始峰)，但z(i)中看到了多个初始峰。推测这些初始峰反映在反应容器(比色皿)中样本和试剂的混合液混合时的浊度的干扰。样本b中，测量刚开始后，v(i)和z(i)都可观察到被推测是反映了初始反应异常(所谓的早期反应)的初始峰。在任一情况下，v(i)的初始峰与z(i)的初始峰相比小，并且与凝固反应开始(p(i)的上升)后出现的峰(反应峰)相比很小。由此可知，v(i)的反应峰能够与初始峰容易地区分。另一方面，z(i)的初始峰比反应峰大，因此，可知为了正确地识别z(i)的反应峰，需要设定不会误检出初始峰的判定基准。因此，基于最大速度比的本方法与使用累计值比的方法相比，对测定噪声具有耐性，明确能够测定更正确的凝固时间。
[0189]
参考例1 vs、ks、ws的确定
[0190]
对基于参照样本集团的数据算出速度阈值vs、最大值连续宽度阈值ks、峰宽度阈值ws的步骤进行说明。作为参照样本集团，使用实施例1中使用的24个样本(以下为aptt组)、实施例2中使用的23个样本(以下为pt组)、或者实施例3中使用的20个样本成分的数据(以下为fbg组)。并且，作为精度管理用试样使用的coagpia用control p－n(积水医疗株式会社制)的control p－n i和control p－n ii也包含在各组的参照样本集团中。
[0191]
1.1固定值vs的设定步骤
[0192]
对于参照样本集团的各样本，求出测量期间中的反应速度v(i)的最大值vmax。根据各样本求出得到的vmax中的最小值，将该最小的vmax的50％设为vs。求出的vs中，aptt组为36，pt组为107，fbg组为17。
[0193]
1.2函数vs的设定步骤
[0194]
1)将control p－n i和control p－nii分别作为“正常control”和“异常control”使用。正常control是aptt和fbg浓度位于基准范围内的中央附近。异常control是aptt超过基准范围而延长，fbg浓度是比基准范围低的值。应予说明，基准范围是指现有的健康者集团的aptt或者fbg浓度分布的中央部95％(不包括两侧2.5％的分布)的范围。
[0195]
2)使用正常control和异常control的测量数据求出函数式的系数。将正常control的最大速度时间vmaxt设为x1，将最大速度vmax设为y1，异常control也相同地将vmaxt设为x2，将vmax设为y2。
[0196]
3)由于算出比参照样本集团中的vmax小的vs，因此在x1和x2乘以系数c(优选为50％≤c≤90％)而得到p1和p2。在本参考例中将c设定为60％。
[0197]
4)将函数式设为y＝b a
÷
x2，由在式的x和y中代入p1和y1、p2和y2的联立方程式求出a和b。
[0198]
5)由求出的a和b，根据vs＝b a
÷
i2计算vs。对于aptt组、pt组以及fbg组求出的vs的计算式如下所示。
[0199]
aptt组：vs(i)＝－83 (158214
÷
i2)
[0200]
pt组：vs(i)＝－148 (51935
÷
i2)
[0201]
fbg组：vs(i)＝19 (9357
÷
i2)
[0202]
其中，由上式求出的vs小于由1.1.求出的固定值的情况下，为vs＝固定值。
[0203]
图21a表示从左起aptt组、pt组以及fbg组的vmax的分布和算出的vs。vmax相对于vmaxt制成曲线。图中圆圈表示正常control的数据，三角表示异常control的数据。点线表示固定值的vs，实线表示函数vs。图中，函数vs以时间t(秒)的函数表示。任一组中如果vmaxt大，则vmax有变小的趋势，结果是函数vs由随着时间减少的曲线表示，最终置换为固定值的vs。
[0204]
2.1 ks的设定步骤
[0205]
k(i)的最大值(kmax)根据检测结束点tt、即v(tt)/vmax0比的值变化。tt变大(v(tt)/vmax0比变小)和k(i)由于远离vmaxt，因此kmax变大，tt变小(v(tt)/vmax0比变大)和k(i)靠近vmaxt，因此kmax变小。使用参照样本集团的测量数据，将v(tt)/vmax0比(％)的设定从50％到90％以10％的刻度进行改变，调查kmax的分布。如表5所示，kmax的分布的最小值和最大值受到v(tt)/vmax0比的影响，可确认到上述的趋势。
[0206]
[表5]
[0207]
aptt组kmax
[0208]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％kmax最小值5.34.53.72.92.0kmax最大值35.431.723.112.88.6
[0209]
pt组kmax
[0210]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％kmax最小值2.11.81.41.10.7kmax最大值9.47.66.14.53.0
[0211]
fbg组kmax
[0212]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％kmax最小值2.82.21.81.40.9kmax最大值14.811.910.38.44.0
[0213]
图21b表示从左开始aptt组、pt组以及fbg组的v(tt)/vmax0比设定为70％时的kmax的分布和计算的ks。kmax相对于vmaxt绘制曲线。根据这些结果可知kmax依赖反应速度峰的时间、甚至凝固时间，即如果凝固时间变大，则kmax也变大，如果凝固时间小，则kmax也变小。这样，有kmax依赖时间的趋势，因此表示可以将ks作为时间或者测量点的函数。根据图中的数据，可以求出计算式：ks(t)＝常数b 系数a
×
t2(图中的实线)。常数b为ks的固定值(图中的点线)，作为最小的kmax的60％的值设定，在aptt组中为2.2秒，在pt组中0.8秒，在fbg组中为1.1秒。系数a适当地设定为不与kmax的分布重叠，任一组均为0.0004。
[0214]
3.1 ws的设定步骤
[0215]
在w(i)的最大值(wmax)中可看到与kmax相同的趋势、即依赖时间的趋势。如表6所示，wmax的分布的最小值和最大值是将v(tt)/vmax0比(％)的设定值从50％到90％以10％
的刻度改变，调查wmax的分布。
[0216]
[表6]
[0217]
aptt组wmax
[0218]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％wmax最小值7.96.85.74.53.2wmax最大值102.791.881.963.629.9
[0219]
pt组wmax
[0220]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％wmax最小值3.93.42.72.11.4wmax最大值13.611.39.37.55.4
[0221]
fbg组wmax
[0222]
v(tt)/vmax0比(％)50％60％70％80％90％wmax最小值4.13.53.12.72.0wmax最大值27.823.620.717.310.6
[0223]
图21c表示从左起aptt组、pt组以及fbg组中的v(tt)/vmax0比设定为70％时的wmax的分布和计算的ws。wmax相对于vmaxt制成曲线。显示出如果vmaxt变大，则wmax也变大，如果vmaxt小，则wmax也变小。根据图中的数据，可求出计算式：ws(t)＝常数b 系数a
×
t2(图中的实线)。常数b为ws的固定值，作为最小的wmax的60％的值设定，aptt组中为3.4秒，pt组中为1.6秒，fbg组中为1.9秒。系数a适当地设定成不与wmax的分布重叠，在任一组中为0.0005。
[0224]
参考例2
[0225]
图22表示关于实施例1中aptt为最小的样本(a)和最大的样本(b)的、vmax检测过程中的、反应速度v(t)和速度阈值vs(上)、最大值连续宽度k(t)和ks(中)以及峰宽度w(t)和ws(下)的关系。图22中，v(t)由实线表示vmax后成为vmax的70％的时刻(检测结束点tt)，其后由点线表示。w(t)表示70％峰宽度。vs基于上述的参考例1根据下式进行计算，其中，计算值小于36时为36。ks、ws使用下述固定值。
[0226]
vs(t)＝－83 158214
÷
t2[t为时间(秒)]
[0227]
ks＝2.2
[0228]
ws＝3.4
[0229]
如图22上所示，基于上式的vs(一点划线)在反应初期时非常大，但随着时间减少。表示通过设定这样变动的vs，能够防止来自于早期反应、反应初期的噪声等的初始峰的误检。并且，如图22中所示，由细点线表示的k(t)在a图中表示超过阈值ks的尖锐的一个三角形，b图中与v(t)的峰出现对应地上下变动，超过阈值ks(一点划线)。如图22下所示，由细点线表示的w(t)在a图和b图这两者中随着时间增加，超过阈值ws(一点划线)，v(t)超过vmaxt而达到vmax的70％时成为最大值wmax。wmax在a图中峰形状尖锐，因此为5.7秒，在b图中峰形状为双峰性的宽度宽的形状，因此为82秒。在a和b中的任一情况下，在检测结束点tt，k(t)超过ks，w(t)超过ws。根据这些结果，表示不仅如a所示v(t)达到vmax的具有一个峰的情况，而且如b所示即使在反应速度v达到vmax前出现前峰的情况下，也通过使用k(t)或者w
(t)而能够正确地检测出vmax。