同时检测食品中4种禁用色素的液相色谱串联质谱方法与流程

1.本发明涉及一种同时检测食品中4种禁用色素的液相色谱串联质谱方法，属于仪器检测技术领域。


背景技术：

2.在现代食品加工业中通常加入各种色素以提高食品的色泽，增加食欲，食品加工中食用色素的使用十分普遍，天然色素存在成本高、着色力差、稳定性差等缺点，合成色素色彩鲜艳、稳定性好，价格便宜，广受食品生产厂的青睐。
3.合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、色调多、成本低的特点，故应用广泛。合成色素是以苯、甲苯和萘等化工产品为原料，经过一系列有机反应而制成，合成得色素因混有中间产物而具有一定毒性或致癌性。因此，各国对人工合成色素在食品中允许使用的品种、范围和添加量作了严格的规定，gb/t 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》明确规定在我国允许添加的食用色素的范围和用量。
4.由于法规允许使用的合成色素的种类和涉及的食品范围有限，一些不法食品生产者受利益驱动，会超量超范围地使用，甚至使用不可用于食品中对人体有害的色素和染料，导致色素使用过程中添加过量、违规添加等现象时有发生，某些色素过量摄入会危害健康，因此，食品中色素的分析测定显得尤为重要。
5.曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿在我国属于禁用色素，被不法商家用于固体糖果类和液体饮料类食品中，目前还没有一种可以同时检测上述四种禁用色素的快速准确的检测方法。


技术实现要素：

6.本发明提供一种同时检测食品中4种禁用色素的液相色谱串联质谱方法，本发明所述的四种禁用色素是曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿。
7.本发明所述的一种同时检测食品中4种禁用色素的液相色谱串联质谱方法，其主要技术原理是：食品经碱化甲醇溶液提取，经离心、过滤后，用lc/ms/ms测定，采用阴性样品基质标准曲线，外标法定量。
8.进一步的，具体包括下列步骤：
9.(一)样品前处理
10.称取样品5g置于50ml离心管中，加碱化甲醇提取液提取液定容至50ml，涡旋混匀30s，振荡提取1.5h，4℃下5000r/min离心3min，取1ml上清液过0.22μm滤膜，观察滤膜的颜色，若有吸附，取3-5次后的滤液，然后置于进样小瓶中，供lc/ms/ms分析。
11.(二)lc-ms/ms检测
12.(1)色谱条件如下：
13.a)色谱柱：porshell 120，ec-c18，3.0mm
×
100mm，填料粒径2.7μm；
14.b)流动相：a相：水(0.025％的甲酸 2mm的乙酸铵)，b相：乙腈；
15.c)流速：0.4ml/min；
16.d)柱温：35℃；
17.e)进样量：5μl
18.f)梯度洗脱程序如下：
19.时间(min)a相[％]b相[％]0.0080200.5080201.0070304.0050505.005957.005958.008020
[0020]
(2)质谱条件
[0021]
a)离子源：电喷雾(ajs esi)离子源；
[0022]
b)扫描模式：负离子扫描；
[0023]
c)检测方式：多反应监测(mrm)；
[0024]
c)喷雾电压(capillary)：-3000v；
[0025]
d)离子源温度(gas temp)：300℃；
[0026]
e)气流速度(gas flow)：7l/min；
[0027]
f)雾化气(nebulizer)：40psi；
[0028]
g)鞘气温度(sheath gas temp)：350℃；
[0029]
h)鞘气流量(sheath gas flow)：11l/min；
[0030]
i)其他质谱条件：
[0031][0032][0033]
(3)定性测定
[0034]
按照上述液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和基质标准工作溶液，如果样品的质
量色谱峰保留时间与标准品一致，所有选择离子均应出现，则根据定性选择离子对的种类及其相对丰度比，对其进行阳性确证；定性时，其相对丰度允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物；
[0035][0036]
(4)定量测定
[0037]
以程序进样方式，取6点阴性样品基质标准工作液各5μl自动进样；以化学工作站建立标准工作液的响应值与相当于样品中4种色素含量的线性方程，并对样液的质谱数据进行处理。
[0038]
本发明所述的阴性样品基质具体配置与步骤(一)样品前处理相同，具体步骤为：取无色素的糖果或饮料，加入碱化甲醇提取液，按照上述分析步骤操作。
[0039]
进一步的，本发明所述碱化甲醇提取液的配置方法为：分别量取100ml甲醇、900ml水、200μl氨水混匀。
[0040]
目前关于色素检测的方法比较多，大部分的食用色素都有相关的检测报道，但是同时检测曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿的没有报道，
[0041]
中国期刊论文《固相萃取-高效液相色谱法同时测定食品中12种合成色素》中，报道了12种色素的检测步骤，12种合成色素是柠檬黄、亮黑、日落黄、诱惑红、坚牢绿、丽春红2r、荧光素钠、丽春红3r、专利蓝、金黄粉、荧光桃红、孟加拉玫瑰红；其中包括了本发明的三种。
[0042]
与本发明的区别在于，一是前处理方式不同；二是检测方式不同，目前没有任何文献资料和标准检测这四种色素的方法，申请人在探索创建这四种色素检测方法的初期，也曾尝试过传统的液相色谱法，但色谱法杂质干扰多，选择性差。最终本发明采用液相色谱-质谱的方法。
[0043]
本方法采用阴性样品基质做标准曲线，有效的消除了质谱法中遇到的基质效应，使定量结果更准确。
[0044]
有益效果：
[0045]
本发明的方法操作简便、定性定量能力较强，可作为检测固体糖果类和液体饮料类食品中4种色素含量的可靠方法。
附图说明
[0046]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0047]
图1是曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿4种色素标准品的选择离子流图(浓度500μg/kg)，图中从上到下以此是曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿的选择离子流图。
[0048]
图2是曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿4种色素的线性曲线(浓度20～500μ
g/kg)a；图中从上到下以此是曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿的线性曲线。
具体实施方式
[0049]
实施例1
[0050]
1.实施例以糖果和饮料为例，提供曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿的液相色谱串联质谱测定方法。
[0051]
2.本实施例检测方法的原理
[0052]
糖果和饮料经10％的碱化甲醇溶液提取，经离心、过滤后，lc/ms/ms测定，采用阴性样品基质标准曲线，外标法定量。
[0053]
3.试剂和材料
[0054]
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
[0055]
3.1甲醇：色谱纯。
[0056]
3.2氨水：优级纯。
[0057]
3.3提取液：分别量取100ml甲醇(3.1)、900ml水、200μl氨水(3.2)，混匀。
[0058]
3.4曙红b标准物质：纯度≥99.6％，sigma-aldrich。
[0059]
3.5荧光桃红标准物质：纯度≥90％，sigma-aldrich。
[0060]
3.6荧光素钠盐标准物质：纯度≥98.5％，fluka。
[0061]
3.7坚牢绿标准物质：纯度≥85％，sigma-aldrich。
[0062]
3.8曙红b标准储备液(1.0mg/ml)：准确称取0.0250g曙红b标准物质(3.4)于25ml容量瓶中，用提取液(3.3)溶解并定容至刻度。混匀后转移至储液瓶中，于4℃保存。
[0063]
3.9荧光桃红标准储备液(1.0mg/ml)：准确称取0.0250g荧光桃红标准物质(3.5)于25ml容量瓶中，用提取液(3.3)溶解并定容至刻度。混匀后转移至储液瓶中，于4℃保存。
[0064]
3.10荧光素钠盐标准储备液(1.0mg/ml)：准确称取0.0250g荧光素钠盐标准物质(3.6)于25ml容量瓶中，用提取液(3.3)溶解并定容至刻度。混匀后转移至储液瓶中，于4℃保存。
[0065]
3.11坚牢绿标准储备液(1.0mg/ml)：准确称取0.0250g坚牢绿标准物质(3.7)于25ml容量瓶中，用提取液(3.3)溶解并定容至刻度。混匀后转移至储液瓶中，于4℃保存。
[0066]
3.12混合中间液(10μg/ml)：分别准确移取500μl曙红b标准储备液(3.8)、荧光桃红标准储备液(3.9)、荧光素钠盐标准储备液(3.10)和坚牢绿标准储备液(3.11)于50ml容量瓶中，用提取液(3.3)稀释定容至刻度。混匀后转移至储液瓶中,于4℃保存。
[0067]
3.13四种色素基质标准工作曲线配制
[0068]
3.13.1 20ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)2μl于进样小瓶中，加入998μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0069]
3.13.2 50ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)5μl于进样小瓶中，加入995μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0070]
3.13.3 80ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)8μl于进样小瓶中，加入992μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0071]
3.13.4 100ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)10μl于进样小瓶中，加入990μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0072]
3.13.5 200ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)20μl于进样小瓶中，加入980μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0073]
3.13.6 500ng/ml：准确移取混合中间液(3.12)50μl于进样小瓶中，加入950μl阴性样品基质溶液，混匀。
[0074]
4.仪器和设备
[0075]
4.1称量天平：sartorius bs423s，感量为0.001g。
[0076]
4.2液相色谱-串联质谱仪：配有esi源。
[0077]
4.3混匀器：model m37610-26。
[0078]
4.4振荡仪。
[0079]
4.5冷冻离心机：≥5000r/min。
[0080]
4.6 milli-q高纯水制备仪。
[0081]
4.7聚丙烯离心管：50ml。
[0082]
4.8微孔过滤膜：0.22μm。
[0083]
4.9注射器：1ml。
[0084]
5.分析步骤
[0085]
称取样品5g(精确至0.001g)于50ml离心管中，加提取液定容至50ml，涡旋混匀30s，振荡提取1.5h，4℃下5000r/min离心3min，取1ml上清液过0.22μm滤膜(观察滤膜的颜色，若有吸附，取3-5次后的滤液)于进样小瓶中，供lc/ms/ms分析。
[0086]
6.测定
[0087]
6.1色谱条件
[0088]
a)色谱柱：porshell 120，ec-c18，3.0mm
×
100mm，填料粒径2.7μm。
[0089]
g)流动相：a相：水(0.025％甲酸 2mm乙酸铵)，b相：乙腈。
[0090]
h)流速：0.4ml/min
[0091]
i)柱温：35℃
[0092]
j)进样量：5μl
[0093]
k)梯度
[0094]
时间(min)a相[％]b相[％]0.0080200.5080201.0070304.0050505.005957.005958.008020
[0095]
6.2质谱条件
[0096]
a)离子源：电喷雾(ajs esi)离子源；
[0097]
b)扫描模式：负离子扫描；
[0098]
c)检测方式：多反应监测(mrm)；
[0099]
c)喷雾电压(capillary)：-3000v；
[0100]
d)离子源温度(gas temp)：300℃；
[0101]
e)气流速度(gas flow)：7l/min；
[0102]
f)雾化气(nebulizer)：40psi；
[0103]
g)鞘气温度(sheath gas temp)：350℃；
[0104]
h)鞘气流量(sheath gas flow)：11l/min；
[0105]
i)其他质谱条件
[0106][0107]
6.3定性测定
[0108]
按照上述液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和基质标准工作溶液，如果样品的质量色谱峰保留时间与标准品一致，所有选择离子均应出现，则根据定性选择离子对的种类及其相对丰度比，对其进行阳性确证。定性时，其相对丰度允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。
[0109][0110]
6.4定量测定
[0111]
以程序进样方式，取6点阴性样品基质标准工作液(3.17)各5μl自动进样。以化学工作站建立标准工作液的响应值与相当于样品中4种色素含量的线性方程，并对样液的质谱数据进行处理。
[0112]
曙红b、荧光桃红、荧光素钠盐和坚牢绿4种色素的线性曲线分别为：
[0113]
曙红b：y＝17.924887*x 48.480923，r2＝0.99977279。
[0114]
荧光桃红：y＝11.934608*x-157.997751，r2＝0.99511909。
[0115]
荧光素钠盐：y＝241.920109*x-2413.302600，r2＝0.99809118。
[0116]
坚牢绿：y＝0.664732*x-8.897029，r2＝0.99716672。
[0117]
6.5结果计算
[0118]
以外标法定量，按下式计算：
[0119][0120]
式中：
[0121]
x—试样中色素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)
[0122]
c—待测样液中色素的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/l)
[0123]
m—称取试样的质量，单位为克(g)
[0124]
v—被测样液总体积，单位为毫升(ml)
[0125]
k—样液稀释倍数
[0126]
计算结果保留三位有效数字，最终结果应扣除空白值。
[0127]
实施例2溶剂空白实验和样品添加实验
[0128]
对实施例1提供的方法进行溶剂空白实验和样品添加实验。
[0129]
2.1溶剂空白
[0130]
不加试样，用与样品相同的方法进行处理。
[0131]
2.2样品添加实验
[0132]
称取5g待测样品，加入混合提取液150、250、500μl，用与样品相同的方法进行处理。按阴性样品基质标准曲线进行定量，计算回收率，回收率在80～110％之间。
[0133]
具体数据如下：
[0134][0135]
本方法检出限为200μg/kg。
[0136]
用串联质谱仪进行分析时，基质效应会对定量结果产生一定影响，故采用阴性样品基质标准进行定量。
[0137]
实施例3不确定度评估
[0138]
1.a类不确定度评估
[0139]
应用质控样品结果(添加回收)作为数据源进行a类不确定度预评估；具体办法如下：
[0140]
在均匀样品基体下，平行做6次同一添加水平的添加回收实验，计算n(n≥6)次结果平均值的标准偏差作为总的重复实验(随机)变化的标准不确定度，其相对不确定度分量u为
[0141]
以荧光桃红为例，对同一样品进行6次添加回收测定(添加水平为300μg/kg)，结果见表1：
[0142]
表1测定结果
[0143][0144]
其相对不确定度分量
[0145]
2.b类不确定度评估
[0146]
实验室设有中央空调常年温控，同时实验室禁止开窗，常年在相同地方工作，故可忽略环境温度及气压的影响，因此在其他不确定度来源中可仅考虑参考物质的纯度、稀释过程、称量过程、测定仪器响应中可能的非线性这些不确定度的分量。
[0147]
实验过程中所使用的容量瓶和移液枪，均是经过校准符合a级或1级标准的；考虑到实际工作中不能保证每次均使用同一容量瓶和移液枪，因此在进行不确定度评估时，采用jjg646-2006《移液器检定规程》和jjg 196-2006《常用玻璃量器检定规程》给出的最大容量允差进行评估。
[0148]
2.1标准物质的纯度偏差引入的不确定度分量u
rel
(cs)
[0149]
实验所用标准物质证书提供的标准物质纯度的最大偏差为
±
0.5％，则其值引入的不确定度分量
[0150]
2.2标准物质称量过程引起的不确定度分量u
rel
(ms)
[0151]
称量标准物质使用的天平感度为0.0001g(编号200937le0058)，称样量为0.0250g；天平校准证书给出u
rel
＝0.26mg(k＝2)，则标准物质称量过程引入的相对不确定度分量
[0152]
2.3标准物质稀释过程引入的不确定度分量
[0153]
2.3.1标准储备液定容过程引入的不确定度分量u
rel
(v1)
[0154]
实验中使用的25ml单标线容量瓶体积示值允差为
±
0.03ml，服从三角分布，容量
瓶引起的标准不确定度分量为其相对不确定度分量
[0155]
2.3.2标准中间液配制过程引入的不确定度分量u
rel
(v2)
[0156]
实验中使用的1ml移液枪在0.5ml检定点处的最大容量允差为
±
1.0％，服从三角分布，其值引起的相对不确定度分量为50ml单标线容量瓶体积示值允差为
±
0.10ml，服从三角分布，容量瓶引起的标准不确定度分量为其值引起的相对不确定度分量为将以上不确定度合成，则u
rel
(v2)＝0.41％。
[0157]
2.3.3标准工作曲线配制过程引入的不确定度分量u
rel
(v3)
[0158]
实验过程中配制了20.0、50.0、80.0、100.0、200.0、500.0ng/ml标准工作液。
[0159]
表2：不同浓度标准溶液配制过程引入的不确定度
[0160][0161]
将以上不确定度合成，则u
rel
(v3)＝7.69％。
[0162]
2.4待测样品称量过程引入的不确定度分量u
rel
(m)
[0163]
称量待测样品使用的是感度0.001g天平(编号200837le0089)，样品称样量为5g；天平校准证书给出u
rel
＝0.74mg(k＝2)，则样品称量过程引入的相对不确定度分量为
[0164]
2.5样品定容引入的不确定度分量u
rel
(v4)
[0165]
本方法样品经处理后用50ml尖底离心管定容至50ml；依据jjg 10-2005《专用玻璃量器检定规程》，50ml尖底离心管在5-50ml容量处的最大容量允许误差为
±
1.0ml，服从三角分布，其值引起的标准不确定度分量为其相对不确定度分量为
[0166]
2.6检测仪器引起的不确定度分量u
rel
(e)
[0167]
检测时使用的仪器为agilent 1260/6460液相色谱-质谱联用仪，经校准，校准证书给出u
rel
＝2％(k＝2)；仪器引起的不确定度分量
[0168]
3.计算合成标准不确定度
[0169]
将表3中的各相对标准不确定度合成，则u
rel
＝7.69％。
[0170]
表3：相对标准不确定度来源汇总表
[0171][0172]
4.计算扩展不确定度
[0173]
选择95％的包含区间，包含因子为2，则扩展不确定度为u
rel
＝15.38％(k＝2)。
[0174]
5.曙红b、荧光素钠盐和坚牢绿不确定度评定
[0175]
曙红b、荧光素钠盐和坚牢绿不确定度评定参照荧光桃红不确定度评定程序。
[0176]
选择95％的包含区间，包含因子为2，则曙红b扩展不确定度为u
rel
＝15.98％(k＝2)。
[0177]
选择95％的包含区间，包含因子为2，则荧光素钠盐扩展不确定度为u
rel
＝16.08％(k＝2)。
[0178]
选择95％的包含区间，包含因子为2，则坚牢绿扩展不确定度为u
rel
＝15.70％(k＝2)。
[0179]
实施例4检测方法的具体应用
[0180]
利用实施例1所述的方法，对申请人主管业务中从进出口商品糖果饮料以及市场出售的饮料糖果样品中多批次抽检样品，在大批量检测过程中，进行了4种色素的检测，有效的排除了不含这四种色素的阴性样品，也及时的发现了数例阳性样品样品。例如：一种姜糖含有荧光素钠盐，菠菜汁饮料中含有少量坚牢绿。对国内市场食品安全风险监控和进出
口食品安全做出了贡献。
[0181]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。