一种检测新型微载体在细胞中的残留的方法与流程

1.本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种检测新型微载体在细胞中的残留的方法。


背景技术：

2.细胞的大规模工业化培养技术对于生物制药、疫苗生产、细胞治疗等生物行业至关重要。其中，间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，具有较强的免疫调节作用，能促进造血恢复功能和修复损伤或病变的组织器官。它在骨、软骨、肌肉、神经等组织工程方面具有广阔的临床应用前景，因此越来越受到市场的的欢迎。目前间充质干细胞市场需求极大，然而普通体外二维培养间充质干细胞难以满足连续化大规模生产的各项标准和要求。因此要满足以后如此庞大的间充质干细胞市场需求，必须依赖微载体细胞培养技术。虽然这门新兴的细胞培养技术是未来医学、制药等领域的热门应用技术，但是目前还存在一些需要优化和改进的方面。其中，间充质干细胞在微载体上悬浮培养，并收获细胞后，细胞中微载体残留的检测就是一个需要优化和提高精确性的程序。
3.目前市面上微载体大多以糖类或高分子的实心球或者纳米纤维片装为主，收集细胞时，多使用胰酶等细胞消化液使细胞从微载体上脱落，然后清洗，过滤或者梯度离心的方式使细胞和未降解的微载体分离，进而收获细胞。目前这种方式收获细胞，弊端有四，其一，细胞消化液反应速度较快，在大规模细胞生产过程中难以准确控制反应时间，可能损伤细胞生理功能；其二，此方法无法将培养的细胞从微载体上完全消化下来，导致细胞回收率低；其三，由于微载体无法降解，因此细胞脱离微载体后，需要额外的梯度离心或者过滤的方法将微载体去除以获得细胞，增加了整个生产过程的成本和过程的复杂性；其四微载体颗粒若无法得到有效去除，其残留将导致后续细胞制品注射体内将引起血管堵塞或者异物排斥等安全性问题。
4.北京华龛生物科技有限公司根据市场需求，研发出可降解的三维微载体聚集体(cn201910079680.3，商品名为微载片)。北京华龛生物根据微载体的生化特性专门研发的裂解液可将微载体完全裂解成液态状，使细胞能够高效地从微载体上脱落并通过简单离心即可实现完全收获。该裂解液只针对微载体进行裂解，不伤害细胞，因此可实现温和高效收获细胞的目的。但是目前还缺乏定量/定性检测通过使用此类微载体(或相同成分微载体)培养和收获的细胞中微载体残留的方法，来帮助评估使用微载体方法生产细胞制剂用于细胞治疗的安全性。因此，开发出新的微载体残留的检测方法对应用微载体悬浮培养细胞非常重要。


技术实现要素：

5.本发明提供一种新的微载体残留检测方法，要求检测者对使用微载体(要求含有羟脯氨酸且可降解的微载体)培养后新鲜收获的细胞，快速进行微载体残留定量或定性检测，从而保障用于细胞治疗的细胞制剂在本项检测内容的安全性。本发明可以通过使用市
售试剂盒和新的测试方法，在使用微载体悬浮培养细胞并使用华龛微载体裂解液收获细胞后，可以应用该方法对于收获的细胞进行微载体残留检测，从而保障了细胞制剂在本项内容的安全性。
6.本发明提供了一种检测微载体在细胞中的残留的方法，包括检测样品中所述微载体的组成成分或所述组成成分的水解产物，确定所述微载体在细胞中的残留量；所述样品为采用所述微载体培养细胞后，使用微载体裂解液裂解所述微载体后所收获的细胞。
7.可选地，根据上述的方法，所述微载体的组成成分包括胶原蛋白、变性胶原蛋白和/或明胶。
8.可选地，根据上述的方法，所述微载体为北京华龛生物科技有限公司的3d微载片(以下简称为“微载片”)。
9.可选地，根据上述的方法，所述样品通过如下步骤制备：
10.(1)向包含培养细胞的所述微载体的培养体系中加入所述微载体裂解液，获得单细胞悬液；
11.(2)离心所述单细胞悬液，获得沉淀，例如离心为1500rpm，5min；
12.(3)采用清洗液清洗所述沉淀；
13.(4)采用所述清洗液将清洗后的沉淀混悬得到单细胞悬液；
14.(5)静置步骤(5)所得到的所述单细胞悬液；
15.(6)离心所述步骤(5)静置后的所述单细胞悬液，获得沉淀，例如离心为1500rpm，5min；
16.(7)重复步骤(3)-(6)2-5次后，获得的所述沉淀作为样品，例如重复步骤(3)-(6)2、3、4或5次。
17.清洗液可选择相同常见的、不含羟脯氨酸或不可产生羟脯氨酸成分的细胞培养缓冲液。例如，所述清洗液为pbs或生理盐水。所述pbs为ph 7.0-7.2，溶质为1.0581mm kh2po4、5.6002mm na2hpo4、154.0041mm nacl，溶剂为水的溶液。所述生理盐水为溶质为0.9g/l nacl，溶剂为水的溶液。
18.所述包含培养细胞的所述微载体的培养体系具体可为微组织，所述微组织可为采用所述微载体和完全培养基培养细胞所获得的。
19.可选地，根据上述的方法，步骤(3)中所述沉淀中的细胞数量与所述清洗液体积比为(0.5-5.0)
×
107个：1-10ml。
20.可选地，根据上述的方法，所述组成成分的水解产物为羟脯氨酸，所述方法包括水解所述样品获得游离的羟脯氨酸，采用氯胺t氧化所述游离的羟脯氨酸获得氧化产物，采用二甲氨基苯甲醛与所述氧化产物反应获得红色化合物，测量所述红色化合物在560nm处的吸光值。
21.可选地，根据上述的方法，所述方法还包括根据羟脯氨酸标准曲线计算所述羟脯氨酸的含量，再根据所述羟脯氨酸含量确定细胞中的微载体残留量；或根据微载体标准曲线计算细胞中的微载体残留量。
22.所述标准曲线可按照如下步骤制备：
23.按照梯度浓度配制羟脯氨酸或微载体标准溶液，水解所述标准溶液获得游离的羟脯氨酸，采用氯胺t氧化所述游离的羟脯氨酸获得氧化产物，采用二甲氨基苯甲醛与所述氧
化产物反应获得红色化合物，测量所述红色化合物在560nm处的吸光值，根据所述羟脯氨酸或微载体标准溶液的浓度和所述吸光值制备标准曲线。其中，可采用稀释液稀释所述羟脯氨酸或所述微载体配置所述标准溶液。稀释液应选用与上述制备样品中与清洗液相同的液体，可为与本发明用于在所述检测中不产生信号干扰、可维持细胞膜完整度的液体，例如pbs或生理盐水。
24.所述标准曲线的浓度范围，根据不同的微载体、微载体残留清洗方法，范围不同。可以根据不同细胞制剂的生产工艺和应用需求进行调整。比如，使用北京华龛生物科技有限公司的3d微载片(货号f01-100，此产品为华龛生物使用专利技术，201910079680.3，将微载体制成的聚集体)培养细胞，使用微载体裂解液3ddigest裂解微载片收获细胞，并使用pbs清洗细胞后，以1
×
107细胞为1个制剂单位时，标准曲线范围可设定为0.1μg/ml～10μg/ml。
25.可选地，根据上述的方法，所述水解所述样品获得游离的羟脯氨酸包括在所述样品中加入提取液，110-135℃，水解3-4h以获得所述游离的羟脯氨酸。所述提取液具体可为盐酸水溶液。
26.可选地，根据上述的方法，所述提取液为6mol/l盐酸水溶液，所述样品的细胞数量与所述提取液的体积比为(0.5-5)
×
107个∶0.4-4ml。
27.可选地，根据上述的方法，所述采用氯胺t氧化所述游离的羟脯氨酸获得氧化产物包括在所述游离的羟脯氨酸中加入氧化剂溶液(例如氯胺t水溶液和醋酸一柠檬酸钠缓冲液的混合溶液)，在室温下反应4-30min生成氧化产物，其中，包含所述游离的羟脯氨酸的溶液和氧化剂溶液的体积比为50-500∶50-500，例如所述游离的羟脯氨酸的溶液可为50-500μl，所述氧化剂溶液可为50-500μ1。
28.可选地，根据上述的方法，所述采用二甲氨基苯甲醛与所述氧化产物反应获得红色化合物，测量所述红色化合物在560nm处的吸光值包括在所述氧化产物中加入显色剂(例如艾氏试剂)50-500μl，60℃水浴锅中反应10-30min，室温后，转入96孔板中，使用酶标仪进行检测560nm处的吸光值。
29.可选地，根据上述的方法，所述微载体裂解液为北京华龛生物科技有限公司的3ddigest微载体裂解液，货号r001-500。
30.上文中，所述细胞具体可为贴壁细胞，例如脐带间充质干细胞。
31.实验证明：本检测方法能够定性或者定量检测三维微载体培养后，裂解微载体收获细胞中微载体残留量，可以应用该方法对于收获的细胞进行微载体残留检测，从而保障了细胞制剂的安全性。
附图说明
32.图1为实施例1中的羟脯氨酸残留检测的标准曲线。
33.图2为实施例1微载片培养细胞中羟脯氨酸残留检测结果。
34.图3为实施例2中的微载片残留检测的标准曲线。
35.图4为实施例3的羟脯氨酸残留检测结果。
36.图5为实施例4的羟脯氨酸残留检测结果。
37.图6为实施例6中的微载片残留检测的标准曲线。
具体实施方式
38.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
39.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.以下实施例中的定量试验，均设置三个重复数据，结果取平均值。
41.下述实施例中所涉及的3d微载片为北京华龛生物科技有限公司的3d微载片(货号f01-100)，含有羟脯氨酸等成分。
42.下述实施例中的微载体裂解液为北京华龛生物科技有限公司的3ddigest微载体裂解液(货号r001-500)，含有胶原酶类成分。
43.下述实施例中，所述试剂盒为北京索莱宝科技有限公司的羟脯氨酸(hyp)含量检测试剂盒(货号bc0255)。
44.下述实施例中所涉及的细胞为离体的人脐带间充质干细胞，为本领域常见细胞。
45.下述实施例中的pbs是ph7.0-7.2，溶质为1.0581mm kh2po4、5.6002mm na2hpo4、154.0041mm nacl，溶剂为水的溶液。
46.下述实施例中的提取液为6mol/l盐酸水溶液，即盐酸为溶质，水为溶剂的溶液；2x提取液为12mol/l盐酸水溶液。
47.实施例1、微载片残留检测法的建立及应用
48.1、待测样品制备
49.1.1 3d供试品制备
50.利用3d微载片培养离体的人脐带间充质干细胞，具体方法如下：(1)微载片准备：轻轻夹取10片3d微载片投入到125ml透气内置叶轮培养瓶(以下简称培养瓶)中，取10ml完全培养基沿培养瓶侧臂加样口加入到培养瓶中，使3d微载片分散于培养基中，待用；(2)细胞准备：准备5ml细胞悬液，密度为5
×
105个细胞/ml，待用；(3)细胞接种：将细胞悬液加入到培养瓶中，补加完全培养基，终体积为80ml，拧紧瓶盖；(4)细胞培养：将培养瓶转移到提前安装好的3d生物反应器搅拌台的瓶位中心，通过触屏控制器将搅拌速度设置为恒速40rpm，培养6天，即可得到微组织。
51.将三维培养后的微组织进行裂解，其中微组织饱和度为3
×
106个-8
×
106个细胞/片微载片，每片微载片使用3ml微载体裂解液。将微组织裂解至单细胞悬液时，立刻进行离心弃上清。使用pbs清洗细胞，1.2
×
107个细胞使用6ml pbs进行清洗，将细胞混悬至单细胞后，静置2min，1500rpm离心5min，尽可能弃掉上清；清洗共重复3次。取出清洗后1
×
107个细胞加入1ml的提取液，煮沸或110℃烘箱3小时消化至透明状，用10mol/l naoh溶液调节ph值至6～8范围内，5000rpm，离心30min，取上清加入去离子水定容至1ml，作为待测样品1。
52.1.2 2d供试品制备
53.消化普通培养瓶培养的细胞(未接触过3d微载片)，细胞消化后，取1.2
×
107个细胞使用6ml pbs进行清洗，将细胞混悬至单细胞后，静置2min，1500rpm离心5min，尽可能弃掉上清，清洗重复3次。取出1
×
107个细胞加入1ml的提取液，煮沸或110℃烘箱3小时消化至
透明状，用10mol/l naoh(约0.5ml)调节ph值至6～8范围内，并加入去离子水定容至1ml，5000rpm，离心30min，取上清作为待测样品2。
54.2、羟脯氨酸标准溶液的制备
55.将羟脯氨酸检测试剂盒所提供的标准品，采用pbs稀释成浓度7.5μg/ml、3.75μg/ml、1.875μg/ml、0.938μg/ml、0.469μg/ml的溶液。
56.3、测定
57.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。加样方法如表1所示。
58.表1微载片残留检测法加样操作
[0059][0060]
注：试剂一和试剂二均来自北京索莱宝科技有限公司的羟脯氨酸(hyp)含量检测试剂盒(货号bc0255)。
[0061]
4、微载片残留计算
[0062]
标准曲线的绘制：以标准溶液的浓度为x轴，δa标准(δa＝a标准管-a空白管)为y轴，绘制标准曲线，得到方程y＝0.03102*x 0.0002396。将样品δa(δa＝a测定管-a空白管)带入方程得到待测样品和待测样品的羟脯氨酸浓度分别为1.05和0.43μg/ml。可降解三维微载片培养收获细胞中羟脯氨酸残留量为0.62μg/ml；即1
×
107±
100个细胞中羟脯氨酸残留量为0.62μg。
[0063]
该实施例证明本检测方法能够定量检测三维微载片培养后，裂解微载片收获细胞中微载片残留量。
[0064]
实施例2、微载片残留检测法的微载片标准曲线制备方法
[0065]
1、将微载片用pbs制备成250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.906μg/ml浓度，加入等量2x提取液，然后煮沸或110℃烘箱3小时消化至透明状，用10mol/l naoh溶液调节ph值至6～8范围内，蒸馏水定容至1ml，5000rpm，离心30min，取上清进行检测。
[0066]
2、按照实施例1步骤3进行测定。
[0067]
3、微载片标准曲线的绘制：以微载片标准品的浓度为x轴，δa标准(δa＝a标准管-a空白管)为y轴，绘制标准曲线，得到方程y＝0.0033*x 0.0065。如图3。
[0068]
实施例3、微载片残留检测法的清洗次数对比
[0069]
1、按照实施例1制备微组织、裂解获得单细胞悬液，离心去除上清后，取3份3.0
×
107个细胞。其中一份作为“未清洗”样品。剩余两份分别添加5ml pbs进行清洗，将细胞混悬至单细胞后，静置2min，1500rpm离心5min，尽可能弃掉上清；其中一份清洗共2次制备成“清洗2次”样品，一份清洗共4次，制备成“清洗4次”样品。三份样品分别加入1ml的提取液，煮沸或110℃烘箱3小时消化至透明状，5000rpm，离心30min，用10mol/l naoh溶液调节ph值至6～8范围内，取上清作为待测样本。
[0070]
2、按实施例1中步骤3进行检测，测定a560吸光值。
[0071]
3、残留计算
[0072]
按照实施例1中制备hyp标准品并获得标准曲线的方程，y＝0.046*x 0.0055，将样品δa(δa＝a测定管-a空白管)带入方程中得到待测样品未清洗、清洗2次、清洗4次的hyp残留量分别为8.905、1.480、1.485μg/ml，如图4。
[0073]
结果显示清洗2次和4次的hyp残留量均比未清洗有大幅降低，清洗2次和4次没有明显差别。由于以hyp作为微载片残留检测的标定物，因此本实施例直接检测hyp的减少了代表了微载体的减少，因此本实施例说明通过清洗2次可以大幅度降低微载片的残留。
[0074]
实施例4、微载片残留检测法的清洗体积对比
[0075]
1、按照实施例1制备微组织、裂解获得单细胞悬液，离心去除上清后，取3份3.0
×
107个细胞，分别添加1、5、10ml pbs进行清洗，将细胞混悬至单细胞后，静置2min，1500rpm离心5min，尽可能弃掉上清；清洗共3次。弃除pbs后，分别向细胞样品加入1ml的提取液，煮沸或110℃烘箱3小时消化至透明状，5000rpm，离心30min，用10mol/l naoh溶液调节ph值至6～8范围内，取上清作为待测样本。
[0076]
2、按实施例1中步骤3进行检测，测定a560吸光值。
[0077]
3、微载片残留计算
[0078]
按照实施例1中制备hyp标准品并获得标准曲线的方程，y＝0.0386*x 0.0098，将样品δa(δa＝a测定管-a空白管)带入方程中得到1ml、5ml和10ml清洗的待测样品的hyp残留量分别为2.065、1.240、1.220μg/ml，如图5。
[0079]
由于以hyp作为微载片残留检测的标定物，因此本实施例直接检测hyp的减少了代表了微载体的减少，因此本实施例结果显示5ml和10ml的pbs清洗比1ml清洗效果较好。
[0080]
实施例5、微载片残留检测法的清洗液对比
[0081]
1、取1ml pbs、生理盐水和培养基(dmem/f12培养基)分别加入1ml的提取液，煮沸或110℃烘箱3小时消化至透明状，5000rpm，离心30min，用10mol/l naoh溶液调节ph值至6～8范围内，取上清作为待测样本。
[0082]
2、按实施例1中步骤3进行检测，测定a560吸光值。
[0083]
3、微载片残留计算
[0084]
按照实施例1中制备hyp标准品并获得标准曲线的方程，y＝0.0404*x 0.0173，将样品δa(δa＝a测定管-a空白管)带入方程中得到pbs、生理盐水和培养基的hyp含量分别为-0.119、-0.144、14.32μg/ml，如下表。pbs和生理盐水的结果为负值，可以认为不含hyp，而培养基含有14.32μg/ml的hyp，因此会干扰残留检测，不适合作为清洗液。
[0085]
表2 hyp检测结果
[0086][0087]
实施例6、氯胺t测定微载片残留检测法
[0088]
1、制备检测所需试剂：
[0089]
1.氯胺t水溶液：称取0.7g氯胺t溶于10ml水中，置于棕色瓶中暗处贮存。
[0090]
2.醋酸-柠檬酸钠缓冲液(ph 6.0)：称取37.5g二水合柠檬酸三钠(na3c6h5o7·
2h2o)、5.5g一水合柠檬酸(c6h8o7·
h2o)和57.0g三水合醋酸钠(ch3coona
·
3h2o)，加少量水溶解，再加入385ml异丙醇，用水稀释至1000ml。
[0091]
3.氧化剂溶液：临用前将1份氯胺t水溶液与4份醋酸一柠檬酸钠缓冲液混合，置棕色瓶中保存。
[0092]
4.艾氏试剂(显色剂)：称取17.6g对二甲氨基苯甲醛，加入21ml高氯酸溶解，再加74ml异丙醇，摇匀，临用前配制，置棕色瓶中保存。
[0093]
5.氢氧化钠溶液[c(naoh)＝6mol/l]：称取24.0g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100ml。
[0094]
6.甲基红指示剂：将0.1g甲基红，加0.05mol/l的氢氧化钠溶液7.4ml使溶解，再加水稀释至200ml。变色范围：ph4.2～6.3(红
→
黄)
[0095]
2、标准品制备：将微载片用pbs制备成250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.906μg/ml浓度，1ml置于具塞试管中，加入提取液4ml封口后置135℃烘箱中水解4h，取出冷却后打开封口，加入1滴甲基红指示剂使呈红色，用6mol/l氢氧化钠溶液中和至溶液呈微黄色，加水定容至4ml，0.22um过滤膜过滤后作为微载片标准溶液。
[0096]
3、3d供试品制备：按照实施例1准备微组织。将三维培养后的微组织进行裂解，其中微组织饱和度为3
×
106个-8
×
106个细胞/片微载片，每片微载片使用3ml微载体裂解液。将微组织裂解至单细胞悬液时，立刻进行离心，使用pbs清洗细胞，5
×
107个细胞使用6ml pbs进行清洗，将细胞混悬至单细胞后，静置2min，1500rpm离心5min，尽可能弃掉上清；清洗共重复3次。取出4
×
107个细胞，根据前述“2、标准品制备”方法中，自“置于具塞试管中”起操作，制备为供试品1。
[0097]
4、2d供试品制备：未接触过新型三维微载片的细胞4
×
107个细胞，根据前述“2、标准品制备”方法中，自“置于具塞试管中”起操作，制备为供试品2。
[0098]
5、测定方法：取0.5ml样品供试液(即供试品1或供试品2)或标准品于带塞比色管中，加0.5ml水，作为样品溶液，再加2ml异丙醇和1ml氧化剂溶液，摇匀，室温放置4min使其氧化。加入2ml艾氏试剂，加塞摇匀，放入60℃水浴中加热显色20min后，室温放置1h。用1cm比色皿，在560nm波长处测定吸光度。空白对照选用清洗液，即pbs作为供试液加入相应的试剂中进行560nm测定吸光度作为空白校正。
[0099]
6、微载片残留计算
[0100]
标准曲线的绘制：以标准溶液的浓度为x轴，δa标准(δa＝a标准管-a空白管)为y轴，绘制标准曲线(图6)，获得方程y＝0.0032*x 0.003。将样品δa(δa＝a测定管-a空白管)带入方程中得到供试品1和2的微载片含量分别为6.80μg/ml和8.28μg/ml。可降解三维微载片培养收获细胞中微载片残留量(x
供试品1-x
供试品2
)为1.48μg/ml；即1000万细胞中微载片残留量为1.48μg。
[0101]
该实施例证明氯胺t检测方法能够定量检测三维微载片培养后，裂解微载片收获细胞中的微载片残留量。
[0102]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。