通过质谱量化血浆中淀粉样β肽的方法与流程

通过质谱量化血浆中淀粉样β肽的方法1.描述2.本发明涉及诊断淀粉样蛋白疾病的医学和兽医科学领域，并且特别地涉及制备血浆样品以用于通过质谱检测和量化淀粉样蛋白aβ40和aβ42肽的分析方法。3.背景4.阿尔茨海默病(ad)是痴呆症的主要原因，特征在于进行性的中枢神经系统退行性疾病，其影响75-84岁人群的17％和85岁以上人群的32％(bateman和budelier,biomarkersofalzheimerdisease,journalofappliedlaboratorymedicine,jan2020,194-208)。ad的特征在于，在患者的脑中逐渐出现淀粉样斑块，该淀粉样斑块具有主要由40-42个氨基酸肽的原纤维形成的淀粉样沉积物的中心核心。所述淀粉样沉积物在淀粉样前体蛋白(app)的蛋白水解加工后形成，导致生成不溶性的aβ肽，主要是aβ1-40(aβ40)和aβ1-42(aβ42)。在健康患者中，这些肽被清除到脑脊液(csf)中或跨过血脑屏障转运到血液中。然而，淀粉样肽的过度产生或淀粉样肽清除的减少导致为ad的特征的淀粉样斑块的形成。这些斑块主要含有aβ42，并用作肽的“槽(sink)”，减少csf和血液两者中的aβ42浓度。5.因此，aβ42/aβ40浓度比目前被用作阿尔茨海默病早期阶段的脑淀粉样变性的生物标志物，用于纳入临床试验。aβ42和aβ40可以通过质谱(ms)或免疫测定来测量，这是目前可用的在脑脊液(csf)中进行的主要方法，其中发现当存在淀粉样斑块时，aβ42浓度较低(bateman和budelier,biomarkersofalzheimerdisease,journalofappliedlaboratorymedicine,jan2020,194-208)。然而，csf采集具有相当的侵入性，并且要求专业的医学技能，这对大型筛查研究来说并不是最方便的。因此，量化血浆中aβ42和aβ40的方法对于诊断具有症状或没有症状的个体非常有意义(fandos等人,plasmaamyloidβ42/40ratiosasbiomarkersforamyloidβcerebraldepositionincognitivelynormalindividuals.alzheimer’sdement,2017sep12；8:179-187)。6.然而，测量血浆中aβ42和aβ40的浓度也涉及一些困难。首先，血液是一种非常复杂的基质，包含大量的许多种蛋白质，这导致血浆中的总蛋白质含量是csf的60倍大。其次，由于从中枢神经系统转运到静脉血中，因此aβ42和aβ40的浓度比csf低。此外，淀粉样蛋白阳性个体和淀粉样蛋白阴性个体之间血浆中aβ42浓度的差异小于csf中的差异(bateman和budelier,biomarkersofalzheimerdisease,journalofappliedlaboratorymedicine,jan2020,194-208)。由于所述原因，血浆中淀粉样β肽的分析比csf中淀粉样β肽的分析更具挑战性，并且因此需要更灵敏和准确的方法。7.以前使用酶联免疫吸附测定(elisa)测量血浆中淀粉样β肽的浓度的研究显示出关于ad患者和健康对照中aβ42/aβ40浓度比测量值的矛盾结果(fukumoto等人,agebutnotdiagnosisisthemainpredictorofplasmaamyloidbeta-proteinlevels,archneurol.2003；60:958–964；pérez-grijalba等人,plasmaaβ42/40ratioaloneorcombinedwithfdg-petcanaccuratelypredictamyloid-petpositivity:across-sectionalanalysisfromtheab255study,alzheimer’sresther.2019；11:96)。事实上，组间的平均值差异(即健康对照对比轻度认知障碍个体)低至10％-15％，与分析方法的准确度和精确度的可接受的变异性在相同数量级。这意味着为了检测如此低的组间差异，分析方法的变异性必须远低于15％。8.另一方面，可用的质谱(ms)方法被显示比免疫测定更灵敏和精确。目前，本领域已知有两种用于确定人类血浆中aβ40和aβ42的基于ms的分析方法。第一种方法由randallbateman小组于2017年发表(ovod等人,amyloidbconcentrationsandstableisotopelabellingkineticsofhumanplasmaspecifictocentralnervoussystemamyloidosis,alzheimer’sanddementia,2017oct；13(10):1185)。该方法将通过免疫沉淀和lys-n消化进行的样品制备与nanolc-ms/ms组合。第二种方法由akinorinakamura小组于2018年发表(nakamura等人,highperformanceplasmaamyloid-βbiomarkersforalzheimer’sdisease,nature2018feb8；554(7691):249-254)并将通过双重免疫沉淀进行的样品制备与maldi-tof/ms组合。9.然而，由于在免疫沉淀期间需要使用昂贵的抗体，这两种方法都是耗费时间和资源的。此外，bateman的方法还要求对样品进行分析物酶促消化，这导致对n-截短的aβ物质的混合物而不是完整的aβ肽的检测。10.因此，本领域对于可应用于大型筛查研究的检测和量化血浆样品中淀粉样β肽的灵敏且可重复的方法仍然存在需求。11.本发明的发明人经过广泛和深入的实验，令人惊讶地发现了一种用于制备包含淀粉样肽的血浆样品的新方法，其允许通过质谱准确量化完整的淀粉样肽aβ40和aβ42。因此，这种新方法将aβ42/aβ40比测量值的变异性减少到低于健康对照和轻度认知障碍个体之间的实际差异的值。12.此外，本发明的方法在不使用样品的免疫沉淀或消化(为本领域已知方法的必要步骤)的情况下进行，并且因此，本发明的方法提供了更简单且更快速的样品制备，与目前可用的方法相比减少了成本和时间要求。13.最后，本发明的方法符合目前fda关于生物分析方法验证的建议，并且因此可以应用于诊断和/或区分神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的不同阶段。14.概述15.在一方面，本发明涉及一种用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法，其特征在于包括以下步骤：16.a)使所述血浆样品与变性剂接触，17.b)对步骤a)中获得的溶液进行第一固相萃取步骤以回收第一洗脱物，18.c)对步骤b)中获得的所述第一洗脱物进行第二固相萃取步骤以回收第二洗脱物，和19.d)干燥步骤c)中获得的所述第二洗脱物并对其进行处理以用于通过质谱分析，20.其中从步骤d)获得的样品包含完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42。21.在所述方法的一种实施方案中，第二固相萃取步骤是阳离子交换固相萃取。22.在另一种实施方案中，阳离子交换固相萃取是强、弱或混合模式的反相阳离子交换。23.在另一种实施方案中，第二固相萃取步骤是阴离子交换固相萃取。24.在另一种实施方案中，第二阴离子交换固相萃取是强、弱或混合模式的反相阴离子交换。25.在另一种实施方案中，在步骤a)中，使血浆样品与酸性变性剂接触，以获得具有小于或等于4.5的ph的溶液。26.在另一种实施方案中，酸性变性剂是浓度在40％(v/v)和70％(v/v)之间的甲酸在水中的溶液。27.在另一种实施方案中，第一固相萃取步骤是反相固相萃取。28.在另一种实施方案中，第一和第二固相萃取步骤中的每一个包括至少两个洗涤步骤，其特征在于，第一和第二固相萃取步骤的第一洗涤步骤用包含酸的溶液进行，并且第一和第二固相萃取步骤的第二洗涤步骤用包含水可混溶的极性有机溶剂的溶液进行。29.在另一种实施方案中，第一洗涤步骤的包含酸的溶液不同于第二洗涤步骤的包含酸的溶液。30.在另一种实施方案中，第一洗涤步骤的包含酸的溶液与第二洗涤步骤的包含酸的溶液相同。31.在另一种实施方案中，第一固相萃取步骤是阳离子交换固相萃取。32.在另一种实施方案中，第一阳离子交换固相萃取是强、弱或混合模式的反相阳离子交换。33.在另一种实施方案中，第一和第二固相萃取步骤中的每一个包括至少两个洗涤步骤，其特征在于，第一固相萃取的第一洗涤步骤用包含酸的溶液进行，并且第二固相萃取的第一洗涤步骤用包含碱的溶液进行，并且第一和第二固相萃取步骤的第二洗涤步骤用包含水可混溶的极性有机溶剂的溶液进行。34.在另一种实施方案中，在步骤a)中使血浆样品与碱性变性剂接触，以获得具有大于或等于约11的ph的溶液。35.在另一种实施方案中，碱性变性剂是浓度在5％(v/v)和50％(v/v)之间的氢氧化铵在水中的溶液。36.在另一种实施方案中，第一固相萃取步骤是阴离子交换固相萃取。37.在另一种实施方案中，第一阴离子交换固相萃取是强、弱或混合模式的反相阴离子交换。38.在另一种实施方案中，第一和第二固相萃取步骤中的每一个包括至少两个洗涤步骤，其特征在于，第一固相萃取的第一洗涤步骤用包含碱的溶液进行，并且第二固相萃取的第一洗涤步骤用包含酸的溶液进行，并且第一和第二固相萃取步骤的第二洗涤步骤用包含水可混溶的极性有机溶剂的溶液进行。39.在又另一种实施方案中，用于处理第二洗脱物以用于通过质谱分析的溶液是包含表面活性剂和还原剂的水性溶液。在优选的实施方案中，步骤d)的用于处理干燥的洗脱物的所述溶液是包含浓度在0.01％(v/v)和0.8％(v/v)之间的tritonx-100和浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦的水性溶液。40.在另一种实施方案中，步骤d)的用于处理干燥的洗脱物的所述溶液是包含表面活性剂、还原剂、水可混溶的极性有机溶剂和酸的水性溶液。在优选的实施方案中，步骤d)的用于处理干燥的洗脱物的所述溶液是包含浓度在0.01％(v/v)和0.8％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦、浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈、浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的二甲基甲酰胺和浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的三氟乙酸(tfa)的水性溶液。41.在本发明的一些实施方案中，血浆样品是人类血浆样品。在其他实施方案中，本发明方法的步骤a)中使用的血浆样品的体积在100μl和400μl之间。42.在本发明的一些实施方案中，用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法不包括在质谱分析之前对血浆样品进行免疫沉淀或消化。43.在第二方面，本发明涉及一种通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法，其特征在于，该方法包括本文所述的制备血浆样品的方法的步骤a)至d)，并且还包括以下步骤：44.i)对步骤d)中获得的溶液进行液相色谱步骤，以分离感兴趣的分析物，45.ii)对步骤i)中分离的分析物进行电离，以产生一种或更多种带电荷的物质；46.iii)根据所述一种或更多种带电荷的物质的离子迁移率分离所述一种或更多种带电荷的物质，47.iv)检测步骤iii)中分离的所述一种或更多种带电荷的物质，并通过质谱测量它们的丰度；和48.v)通过将在步骤iv)中测量的一种或更多种带电荷的物质的丰度与标准曲线进行比较，确定血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和/或aβ42的量或浓度。49.在一些实施方案中，用于通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的所述方法的特征在于，液相色谱是微液相色谱(micro-hplc)，电离是电喷雾电离(esi)，一种或更多种带电荷的物质的分离通过差分迁移谱(dms)进行，并且用于检测和测量分离的一种或更多种带电荷的物质丰度的质谱技术是在三重四极杆仪中的多重反应监测(mrm)。50.在本发明的其他实施方案中，用于通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的所述方法中使用的标准曲线是用人类血浆制备的。51.在第三方面，本发明涉及一种水性溶液，该水性溶液用于处理干燥的洗脱物以用于通过质谱分析，该水性溶液包含浓度在0.01％(v/v)和0.8％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦、浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈、浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的二甲基甲酰胺和浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的三氟乙酸(tfa)。52.附图简述53.图1示出了代表对应于通过本发明的方法量化的36个个体(pet阴性或pet阳性)的样品的aβ42/aβ40比值的图。54.图2示出了针对图1的aβ42/aβ40比值计算的roc曲线的图。55.图3示出了经历单一spe步骤(混合模式反相阳离子交换(mcx))的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。56.图4示出了根据方案a经历第一spe步骤(反相(hlbprime))、然后是第二spemcx的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。57.图5示出了经历了第一spe步骤mcx、然后是第二spehlb的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。58.图6示出了根据方案b经历第一spe步骤hlb、然后是第二spemcx的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。59.图7示出了与经历第一hlb、然后是第二mcx的组合相比，根据方案d经历第一spe步骤(混合模式反相阴离子交换spe(max))、然后是第二spemcx的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。60.图8示出了与经历第一hlb、然后是第二mcx的组合相比，根据方案c经历第一spe步骤mcx、然后是第二spemax的血浆样品获得的色谱图。左图迹线涉及aβ40，并且右图迹线涉及aβ42。61.详细描述62.以下描述仅仅是为了说明本发明的各种实施方案。因此，所讨论的特定修改并不意图是限制性的。对于本领域的技术人员来说将明显的是，在不脱离本文所呈现主题的精神或范围的情况下，可以进行各种等同、改变和修改，并且应理解，这样的等同的实施方案将被包括在本文中。63.如本发明中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数指代物，除非内容另外清楚地规定。64.贯穿本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或变化形式诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意味着包括陈述的要素或要素的组，但不排除任何其他要素或者要素的组。65.术语“分析物”、“物质(specie)”、“样品”、“组分”、“化学物质”和“离子”在本文都可以用来指待用本发明的方法分析、鉴定和量化的物质。66.如本文使用的术语“固相萃取”或“spe”是指藉以将混合物分离成组分的过程。这些组分溶解和/或悬浮在溶液(“样品溶液”)中，并通过它们对溶液通过的固体(“固定相”)的不同亲和力而彼此分离。在一些情况下，当样品溶液通过固定相时，样品溶液中不需要的组分可以被固定相保留(即，样品溶液中的分析物被纯化)。在其他情况下，所需的组分可以被固定相保留(即，感兴趣的分析物被保留在固定相中)，并使用第二流动相来洗脱固定相中保留的分析物以用于进一步的处理或分析。“固定相”通常被包含在“小柱(cartridge)”、“吸头(tip)”或“柱(column)”中，它们可以聚集在多孔板中，这对于大型筛查研究特别方便。固相萃取小柱、柱、吸头和多孔板是商业上可得的，或者可以根据本领域已知的方法制备。67.术语“纯化”是指相对于样品中可能干扰感兴趣分析物检测的其他成分，使一种或更多种感兴趣分析物的量富集的程序。如本文使用的，术语“纯化”并不是指从样品中去除感兴趣的分析物以外的所有物质。[0068]“免疫沉淀”是指利用抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)来富集样品中一种或更多种感兴趣的分析物的纯化程序。[0069]如本文使用的术语“消化”一般是指任何用于降解或裂解多肽或蛋白质的合适方法，包括例如使用细胞酶(蛋白酶)和分子内消化。[0070]如本文使用的术语“质谱”或“ms”是指测量特定分析物的质荷比的分析技术。ms被广泛地使用，以包括所有可以用于使用其质荷比检测和鉴定分析物的组件和系统。ms技术通常包括将分析物电离(尽管它们之前可以在溶液中电离)以形成带电荷的分析物，将这些带电荷的分析物转移到气相，确定质荷比和计算相对丰度或绝对丰度。分析物可以通过任何合适的方法电离和检测。[0071]术语“色谱”是指这样的过程，通过该过程，液体或气体携带的混合物被分离成组分，由于化学实体在流经固定相时的差异性分布，这些组分以不同的驻留时间被洗脱。因此，“液相色谱”(lc)或“高效液相色谱”(hplc)是指当流体移动通过柱时流体溶液的一种或更多种组分的选择性分离。分离是由于混合物的组分在一个或更多个固定相和流动相之间的分配而引起的。lc或hplc的实例包括正相液相色谱(nplc)、反相液相色谱(rplc)、高湍流液相色谱(htlc)、亲水相互作用色谱(hilic)、离子交换色谱(iec)、尺寸排阻色谱(sec)、疏水相互作用色谱(hic)、静电排斥液相色谱(erlic)和多维液相色谱。[0072]术语“micro-hplc”或“micro-lc”是指采用微流量(即1-25μl/min)和毛细管柱(内径150-500μm)的高效液相色谱(hplc)。[0073]如本文使用的术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”是指藉以产生具有等于一个或更多个电荷单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子具有净负电荷，并且正离子具有净正电荷。电离的非限制性实例包括电子电离、化学电离、电喷雾电离(esi)、大气压光电离(appi)、基质辅助激光解吸电离(maldi)、大气压化学电离(apci)等。[0074]“电喷雾电离”或“esi”是指藉以将感兴趣的分析物以离子转移到气相的电离方法，其中将含有感兴趣的分析物的样品溶液喷射到电场中以形成带电荷的液滴。[0075]术语“离子迁移谱(ims)”是指用于根据气相中电离的分子在载体缓冲气体中的迁移率来分离和鉴定所述分子的分析技术。术语“差分迁移谱(dms)”是指根据在高电场和低电场中、在大气压或接近大气压的气体中离子迁移率之间的差异来分离电离的分子的特定类型的ims。[0076]术语“多重反应监测(mrm)”，也称为“选定反应监测(srm)”，是指串联ms中的扫描模式，其中两个(或更多个)分析装置(即四极杆)被调整以监测感兴趣的分析物的一种或更多种选定的母体-产物对。[0077]术语“串联质谱”或“ms/ms”是指进行多于一级质量分析的质谱，其中所述多于一级在时间或空间上是分开的。例如，时间串联质谱可以包括一个质量分析仪(例如，离子阱)，其中特定离子首先被捕获、分离和片段化，并且然后片段在同一质量分析仪中进行分析。空间串联质谱包括多于一个分析仪。分析仪被一个或更多个反应区(即填充有气体如氩气、氙气、氮气、氦气的碰撞单元)隔开，在那里分析物发生解离。最后，片段离子在最终分析仪中过滤，并且然后进行检测。通常使用两个分析仪。这些分析仪可以属于同一类型，或者可以不属于同一类型。[0078]如本文使用的，术语“roc”意指“接收者操作特征(receiveroperatingcharacteristic)”。roc分析可以用于评价测试或分析方法的诊断性能或预测能力。roc图是测试在不同阈值或截止值的灵敏度和特异性的图。roc曲线上的每个点代表灵敏度及其相应的特异性。可以根据roc曲线选择阈值以鉴定灵敏度和特异性两者都具有可接受值的点，并且该值可以在将测试应用于诊断目的中使用。如果只有特异性被优化，那么测试将较少可能产生假阳性(在更多没有疾病的受试者中诊断出疾病)，代价是一些疾病病例将无法被鉴定出的可能性增加(例如假阴性)。如果只有灵敏度被优化，那么测试将更有可能鉴定出大多数或所有患有疾病的受试者，但也将在更多没有疾病的受试者中诊断出疾病(例如假阳性)。使用者能够以本领域技术人员容易理解的方式修改参数，并因此选择适合于特定临床情况的roc阈值。[0079]术语“曲线下面积(auc)值”，对测试区分不同样品性质(在本文情况下，区分那些患有aβ淀粉样变性(即淀粉样蛋白阳性)和那些没有aβ淀粉样变性(即淀粉样蛋白阴性)的受试者)的总体能力进行量化。在鉴定真阳性方面不优于随机概率的测试将产生auc为0.5的roc曲线。具有完美特异性和灵敏度的测试(即，不产生假阳性和假阴性)将具有1.00的auc。[0080]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。下文描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可以被使用，并且对本领域技术人员来说是将明显的。[0081]除非另有明确说明，否则本说明书中的每种实施方案经必要修改后将适用于每一种其他的实施方案。[0082]本发明涉及一种用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法。[0083]淀粉样β肽(也称为aβ或abeta肽)是淀粉样前体蛋白(app)经蛋白水解加工而产生的肽。如本文使用的，术语“淀粉样蛋白β”是指总淀粉样β(aβ)蛋白、aβ40、aβ42或另一种aβ亚型。在一些实施方案中，样品可以包含aβ40。在其他实施方案中，样品可以包含aβ42。在优选的实施方案中，样品可以包含aβ40和aβ42。[0084]如本文使用的，术语“完整的”淀粉样蛋白β是指未经历化学/酶促裂解或任何其他肽修饰的全长肽。在aβ40和aβ42肽的确切情况中，完整的淀粉样β肽aβ42是指对应于人类app亚型770(典型的，uniprotkb中登录号p05067)的氨基酸672至713的42个氨基酸的肽，并且完整的淀粉样β肽aβ40是指对应于人类app亚型770(典型的，uniprotkb中登录号p05067)的氨基酸672至711的40个氨基酸的肽。[0085]在一些实施方案中，样品是来源于受试者的血浆样品。合适的受试者包括人类或任何其他哺乳动物、家畜(诸如猪、牛、马、山羊、绵羊、大羊驼和羊驼)、伴侣动物(诸如狗、猫、兔和鸟类)、实验室动物(诸如啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠)或动物学动物(zoologicalanimal)。在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物。在更优选的实施方案中，受试者是人类。[0086]血浆样品可以“按原样”使用，或者可以使用标准技术从血浆样品中分离蛋白质级分。例如，血浆样品可以被浓缩、稀释或提取。合适的提取技术可以包括表面活性剂、酸、碱、有机溶剂或本领域已知的其他方法。在一些实施方案中，可以对原始样品进行预处理，以减少基质的复杂性。在一些实施方案中，这些预处理是本领域技术人员熟知的技术，诸如液-液提取或蛋白质沉淀，但不排除本领域技术人员已知的其他技术。在一些实施方案中，优选的是血浆样品。在更优选的实施方案中，血浆样品是人类血浆样品。[0087]在第一方面，本发明涉及一种用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法。所述方法包括以下步骤：[0088]a)使所述血浆样品与变性剂接触，[0089]b)对步骤a)中获得的溶液进行第一固相萃取步骤以回收第一洗脱物，[0090]c)对步骤b)中获得的所述第一洗脱物进行第二固相萃取步骤以回收第二洗脱物，和[0091]d)干燥步骤c)中获得的所述第二洗脱物并对其进行处理以用于通过质谱分析，[0092]其中从步骤d)获得的样品包含完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42。[0093]步骤d)中的术语“处理”是指使样品足以用于质谱分析，并包括例如，使样品足以用于与质谱偶联的液相色谱。[0094]在一些实施方案中，使包含淀粉样β肽的血浆样品与酸性变性剂接触。在更优选的实施方案中，酸性变性剂是有机酸。在又更优选的实施方案中，有机酸是羧酸。在又更优选的实施方案中，羧酸是单羧酸、二羧酸或三羧酸。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤6、例如约≤5、诸如约≤4的pka。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤4的pka。在优选的实施方案中，单羧酸、二羧酸或三羧酸是c1-c10卤代烷基羧酸、c1-c10烷基羧酸及其组合。例如，羧酸可以选自c1-c5卤代烷基单羧酸、c1-c5烷基单羧酸及其组合。在又更优选的实施方案中，羧酸是甲酸。[0095]本文公开的所有pka值是在25℃和1大气压在水中测量的。[0096]因此，在一些实施方案中，酸性变性剂是甲酸。在又更优选的实施方案中，酸性变性剂是甲酸在水中的溶液，其包含40％(v/v)和70％(v/v)之间的甲酸。在优选的实施方案中，甲酸溶液包含水中45％(v/v)和60％(v/v)之间的甲酸。在更优选的实施方案中，甲酸溶液包含水中约50％(v/v)的甲酸。[0097]在一些优选的实施方案中，使包含淀粉样β肽的血浆样品与酸性变性剂接触，以获得具有小于或等于约4.5的ph的溶液。在更优选的实施方案中，溶液的ph可以在约0.1和约4.5之间。例如，溶液的ph可以在约0.4和约3之间。溶液的ph可以在约0.5和2之间，例如在约0.8和1.5之间。在更优选的实施方案中，使血浆样品与酸性变性剂接触后获得的溶液具有在1和1.4之间、更优选地在1.1和1.3之间、更优选地约1.2的ph。[0098]本发明方法中所用酸性变性剂的体积取决于所用血浆样品的体积和所述酸性变性剂的ph。本领域技术人员能够通过简单计算来确定酸性变性剂的体积以获得具有特定ph的溶液。在本发明的一些优选的实施方案中，酸性变性剂是在水中浓度在40％(v/v)和70％(v/v)之间的甲酸。在本发明的更优选的实施方案中，使体积在100μl和400μl之间的血浆样品与体积在200μl和800μl之间、在水中浓度在40％(v/v)和70％(v/v)之间的甲酸接触。[0099]使用甲酸作为变性剂用于使本发明的血浆样品变性提供了若干优点，诸如破坏许多aβ-血浆蛋白(即igg)相互作用，同时保持aβ肽在溶液中(不发生沉淀)。[0100]在一些实施方案中，使包含淀粉样β肽的血浆样品与碱性变性剂接触。在更优选的实施方案中，碱性变性剂选自由水溶性氢氧化物、碳酸盐、氧化物及其组合组成的组。例如，碱可以是水溶性氢氧化物。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物、有机氢氧化物及其组合。在优选的实施方案中，碱是氢氧化铵。在又更优选的实施方案中，碱性变性剂是氢氧化铵在水中的溶液，其包含15％(v/v)和40％(v/v)之间的氢氧化铵。在优选的实施方案中，碱性剂的溶液包含水中20％(v/v)和50％(v/v)之间的氢氧化铵。在更优选的实施方案中，碱性剂的溶液包含水中约25％(v/v)的氢氧化铵。[0101]在一些优选的实施方案中，使包含淀粉样β肽的血浆样品与碱性变性剂接触，以获得具有大于或等于约11的ph的溶液。在更优选的实施方案中，溶液的ph可以在约11和约13之间。例如，溶液的ph可以在约11和约12之间。溶液的ph可在约11和11.5之间，最优选地约11.3。[0102]本发明方法中所用碱性变性剂的体积取决于所用血浆样品的体积和所述碱性变性剂的ph。本领域技术人员能够通过简单计算来确定碱性变性剂的体积以获得具有特定ph的溶液。在本发明的一些优选的实施方案中，碱性变性剂是在水中浓度在15％(v/v)和40％(v/v)之间的氢氧化铵。在本发明的更优选的实施方案中，使体积在100μl和400μl之间的血浆样品与体积在200μl和800μl之间、在水中浓度在15％(v/v)和40％(v/v)之间的氢氧化铵接触。[0103]使用氢氧化铵作为变性剂用于使本发明的血浆样品变性提供了若干优点，诸如破坏许多aβ-血浆蛋白(即igg)相互作用，同时保持aβ肽在溶液中(不发生沉淀)。[0104]样品变性后，淀粉样β肽通过固相萃取(spe)与样品的其他组分分离。[0105]本领域中已知若干类型的spe。它们可以根据所用固定相的化学性质进行分类。因此，在正相spe中，固定相比流动相更具极性，诸如硅胶或氧化铝作为固定相与极性较低的洗脱剂(即己烷)的流动相的组合。相反，反相spe使用低极性填料，如十八烷基硅烷或辛基硅烷，键合到二氧化硅或聚合物微珠，并且流动相通常是水和有机可混溶的溶剂和改性剂的混合物。另一方面，在离子交换spe期间，基于组分与固定相的带正电荷或负电荷的基团之间的静电相互作用，组分被分离。因此，离子交换spe包括阴离子交换spe和阳离子交换spe，在阴离子交换spe中，固定相包含与带负电荷的阴离子(诸如酸)相互作用并保留其的带正电荷的基团，在阳离子交换spe中，固定相包含与带正电荷的阳离子(诸如碱)相互作用并保留其的带负电荷的基团。强阳离子交换吸附剂含有在水性溶液中总是带负电荷的脂肪族磺酸基团，并且弱阳离子交换吸附剂含有当ph高于5时带电荷的脂肪族羧酸。也可以在同一个小柱中组合多于一种驻留机制，即所谓的混合模式spe，它通常组合反相和离子交换小柱。因此，混合模式反相阴离子交换和混合模式反相阳离子交换是本领域中已知的spe。[0106]本发明的方法中固相萃取的目的是分离和弃去血浆样品中不需要的组分，以便纯化和浓缩样品中感兴趣的淀粉样β肽。[0107]在一些实施方案中，本发明的方法包括对样品与变性剂接触后获得的溶液进行第一固相萃取步骤。在优选的实施方案中，本发明的方法包括在所述第一固相萃取步骤之后进行第二固相萃取步骤。因此，在一些实施方案中，本发明的用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的样品的方法包括两个连续的固相萃取步骤。[0108]在一些实施方案中，本发明的用于制备包含淀粉样β肽的样品的方法的第一和第二固相萃取步骤可以是本领域技术人员已知的任何类型。[0109]在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是反相spe。在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是阳离子交换spe。在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是阴离子交换spe。在一些实施方案中，阳离子交换spe是强、弱或混合模式反相阳离子交换。在一些实施方案中，阴离子交换spe是强、弱或混合模式反相阴离子交换。[0110]在一些实施方案中，第二固相萃取步骤是反相spe。在一些实施方案中，第二固相萃取步骤是阳离子交换spe。在一些实施方案中，第二固相萃取步骤是阴离子交换spe。在一些实施方案中，阳离子交换spe是强、弱或混合模式反相阳离子交换。在一些实施方案中，阴离子交换spe是强、弱或混合模式反相阴离子交换。[0111]在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是反相spe，并且第二固相萃取步骤是阳离子交换spe，更优选地所述阳离子交换spe是强、弱或混合模式反相阳离子交换。[0112]在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是反相spe，并且第二固相萃取步骤是阴离子交换spe，更优选地所述阴离子交换spe是强、弱或混合模式反相阴离子交换。[0113]在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是阳离子交换spe，更优选地所述阳离子交换spe是强、弱或混合模式反相阳离子交换，并且第二固相萃取步骤是阴离子交换spe，更优选地所述阴离子交换spe是强、弱或混合模式反相阴离子交换。[0114]在一些实施方案中，第一固相萃取步骤是阴离子交换spe，更优选地所述阴离子交换spe是强、弱或混合模式反相阴离子交换，并且第二固相萃取步骤是阳离子交换spe，更优选地所述阳离子交换spe是强、弱或混合模式反相阳离子交换。[0115]在本发明的用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法的一些优选的实施方案中，如在此公开的，使血浆样品与酸性变性剂接触，然后进行第一spe和第二spe，其中第一spe是反相spe，并且第二固相萃取步骤是阳离子交换spe。[0116]在本发明的用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法的一些优选的实施方案中，如在此公开的，使血浆样品与酸性变性剂接触，然后进行第一spe和第二spe，其中第一spe是反相spe，并且第二固相萃取步骤是阴离子交换spe。[0117]在本发明的用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法的一些优选的实施方案中，如在此公开的，使血浆样品与酸性变性剂接触，然后进行第一spe和第二spe，其中第一spe是阳离子交换spe，并且第二固相萃取步骤是阴离子交换spe。[0118]在本发明的用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法的一些优选的实施方案中，如在此公开的，使血浆样品与碱性变性剂接触，然后进行第一spe和第二spe，其中第一spe是阴离子交换spe，并且第二固相萃取步骤是阳离子交换spe。[0119]根据本发明的方法，在使包含淀粉样肽的血浆样品中的蛋白质变性后，如本文所述的两个连续spe步骤的特定组合允许纯化完整的aβ40和aβ42肽，其可以在不需要任何另外的纯化步骤的情况下通过质谱进一步分析。[0120]用于进行本发明的第一和第二spe步骤的方案包括固定相的调节和平衡，将样品装载到柱或小柱中，至少一个洗涤步骤和至少一个洗脱步骤。所述步骤是本领域技术人员所熟知的，并且每个步骤的具体条件也是本领域所熟知的。[0121]在本发明的一种实施方案中，用于进行本发明的第一和第二spe步骤的方案是本领域中已知的那些。在本发明的另一种实施方案中，第一和第二spe步骤包括至少一个洗涤步骤，以从样品中去除不需要的组分。在本发明的优选的实施方案中，第一和第二spe步骤中的每一个包括至少两个洗涤步骤。[0122]合适的洗涤溶液是本领域已知的。在一些实施方案中，用于本发明方法的spe步骤的洗涤溶液是酸(诸如有机酸，优选地乙酸、甲酸或三氟乙酸(tfa))的溶液。在其他实施方案中，用于本发明方法的spe步骤的洗涤溶液是水和水可混溶的有机溶剂的溶液。例如，水可混溶的有机溶剂可以是极性非质子有机溶剂或质子有机溶剂。水可混溶的有机溶剂的类别的非限制性实例包括但不限于酯类、腈类、羧酸类、酰胺类、醛类、酮类及其组合。本领域技术人员将理解，并非上述类别的每个成员都是水可混溶的，然而，本领域技术人员可以容易地确定特定类别的成员是水可混溶的。在又更优选的实施方案中，水可混溶的有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺或其组合。在特别优选的实施方案中，用于本发明方法的spe步骤的洗涤溶液的水可混溶的有机溶剂是乙腈。在其他实施方案中，用于本发明方法的spe步骤的洗涤溶液是碱(诸如水溶性氢氧化物、碳酸盐、氧化物及其组合)的溶液。在优选的实施方案中，用于本发明方法的spe步骤的洗涤溶液是氢氧化铵的溶液。[0123]在一些优选的实施方案中，用于第一洗涤的洗涤溶液是三氟乙酸(tfa)。在本发明的spe步骤期间，可以用于第一洗涤的tfa的浓度为水中0.01％(v/v)和10％(v/v)之间的tfa。在另一优选的实施方案中，洗涤溶液是水中0.05％(v/v)和1％(v/v)之间的tfa。在又更优选的实施方案中，洗涤溶液是水中约0.1％(v/v)的tfa。在优选的实施方案中，在本发明的第一spe步骤期间，用于第一洗涤的洗涤溶液是水中0.05％(v/v)和1％(v/v)之间的tfa，更优选地水中约0.1％的tfa。[0124]在一些优选的实施方案中，用于第一洗涤的洗涤溶液是甲酸。在本发明的spe步骤期间，可以用于第一洗涤的甲酸的浓度为水中15％(v/v)和35％(v/v)之间的甲酸。在优选的实施方案中，洗涤溶液是水中20％(v/v)和30％(v/v)之间的甲酸。在更优选的实施方案中，洗涤溶液是水中约25％(v/v)的甲酸。在另一优选的实施方案中，在本发明的第二spe步骤期间用于第一洗涤的洗涤溶液是水中20％(v/v)和30％(v/v)之间的甲酸，更优选地水中约25％(v/v)的甲酸。[0125]在一些优选的实施方案中，用于第一洗涤的洗涤溶液是氢氧化铵溶液。在本发明的spe步骤期间，可以用于第一洗涤的氢氧化铵的浓度为水中2％-50％(v/v)之间的氢氧化铵。在优选的实施方案中，洗涤溶液是水中2％(v/v)和30％(v/v)之间的氢氧化铵。在更优选的实施方案中，洗涤溶液是水中约10％(v/v)的氢氧化铵。在另一优选的实施方案中，在本发明的第二spe步骤期间用于第一洗涤的洗涤溶液是水中5％(v/v)和30％(v/v)之间的氢氧化铵，更优选地水中约10％(v/v)的氢氧化铵。[0126]在一些优选的实施方案中，用于第二洗涤的洗涤溶液是乙腈。在本发明的spe步骤期间，可以用于第二洗涤的乙腈的浓度为水中5％(v/v)和80％(v/v)之间的乙腈。在优选的实施方案中，洗涤溶液是水中10％(v/v)和60％(v/v)之间的乙腈。[0127]在优选的实施方案中，在本发明的第一spe步骤期间，用于第二洗涤的洗涤溶液是水中5％(v/v)和15％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗涤溶液是水中约10％(v/v)的乙腈。[0128]在优选的实施方案中，在本发明的第二spe步骤期间，用于第二洗涤的洗涤溶液是水中40％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗涤溶液是水中约60％(v/v)的乙腈。[0129]在其他优选的实施方案中，在本发明的第一spe步骤期间进行第三洗涤。在优选的实施方案中，用于第三洗涤的洗涤溶液包含浓度在90％(v/v)和100％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，在第一spe步骤期间用于第三洗涤的洗涤溶液是浓度为约100％(v/v)的乙腈。[0130]在优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中0.05％(v/v)和1％(v/v)之间的tfa的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中5％(v/v)和15％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中20％(v/v)和30％(v/v)之间的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中40％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含90％(v/v)和100％(v/v)之间的乙腈的溶液进行。[0131]在更优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约0.1％(v/v)的tfa的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中约10％(v/v)的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约25％(v/v)的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中约60％(v/v)的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含约100％(v/v)的乙腈的溶液进行。[0132]在优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中0.05％(v/v)和10％(v/v)之间的甲醇的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中5％(v/v)和15％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中0.5％(v/v)和50％(v/v)之间的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中30％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含90％(v/v)和100％(v/v)之间的乙腈的溶液进行。[0133]在优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中5％(v/v)和50％(v/v)之间的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中40％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含水中90％(v/v)和100％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中0.5％(v/v)和15％(v/v)之间的氢氧化铵的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中30％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行。[0134]在更优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约25％(v/v)的fa的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中约60％(v/v)的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含约100％(v)乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约10％(v/v)的氢氧化铵的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中约60％(v/v)的乙腈的溶液进行。[0135]在更优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中1％(v/v)和20％(v/v)之间的氢氧化铵的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中30％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中0.5％(v/v)和50％(v/v)之间的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中30％(v/v)和70％(v/v)之间的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含90％(v/v)和100％(v/v)之间的乙腈的溶液进行。[0136]在更优选的实施方案中，第一spe步骤包括至少两个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约10％(v/v)的氢氧化铵的溶液进行，并且第二洗涤步骤用包含水中约60％(v/v)的乙腈的溶液进行，并且第二spe步骤包括至少三个洗涤步骤，第一洗涤步骤用包含水中约25％(v/v)的甲酸的溶液进行，第二洗涤步骤用包含水中约60％(v/v)的乙腈的溶液进行，并且第三洗涤步骤用包含约100％(v/v)的乙腈的溶液进行。[0137]在任一spe步骤期间进行的至少一个洗涤步骤之后，需要洗脱保留在固定相中的分析物。合适的洗脱溶液是本领域技术人员熟知的。[0138]在一些实施方案中，在第一spe步骤期间保留在固定相中的分析物用包含表面活性剂和水可混溶的极性有机溶剂的洗脱溶液洗脱。在其他实施方案中，在第一spe步骤期间保留在固定相中的分析物用包含碱和水可混溶的极性有机溶剂的洗脱溶液洗脱。在其他实施方案中，在第一spe步骤期间保留在固定相中的分析物用包含酸和水可混溶的极性有机溶剂的洗脱溶液洗脱。[0139]例如，水可混溶的有机溶剂可以是极性非质子有机溶剂或质子有机溶剂。水可混溶的有机溶剂的类别的非限制性实例包括但不限于酯类、腈类、羧酸类、酰胺类、醛类、酮类及其组合。本领域技术人员将理解，并非上述类别的每个成员都是水可混溶的，然而，本领域技术人员可以容易地确定特定类别的成员是水可混溶的。在又更优选的实施方案中，水可混溶的有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺或其组合。在特别优选的实施方案中，本发明方法的第一spe步骤之后的洗脱溶液的水可混溶的有机溶剂是乙腈。洗脱溶液的表面活性剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是非离子型的。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型的。在一些优选的实施方案中，非离子表面活性剂为乙氧基化物类型。在又更优选的实施方案中，乙氧基化物类型的非离子表面活性剂是tritonx-100。碱可以选自由水溶性氢氧化物、碳酸盐、氧化物及其组合组成的组。例如，碱可以是水溶性氢氧化物。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物、有机氢氧化物及其组合。在优选的实施方案中，碱是氢氧化铵。洗脱溶液的酸可以是有机酸，优选地乙酸、甲酸或三氟乙酸(tfa)。[0140]在优选的实施方案中，在本发明方法的第一spe步骤之后使用的洗脱溶液包含浓度在1％(v/v)和5％(v/v)之间的tritonx-100和浓度在20％(v/v)和40％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗脱溶液由水中约2％(v/v)的tritonx-100和约30％(v/v)的乙腈组成。[0141]在另一优选的实施方案中，在本发明方法的第一spe步骤之后使用的洗脱溶液包含浓度在5％(v/v)和15％(v/v)之间的氢氧化铵和浓度在50％(v/v)和90％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗脱溶液由水中约10％(v/v)的氢氧化铵和约75％(v/v)的乙腈组成。[0142]在另一优选的实施方案中，在本发明方法的第一spe步骤之后使用的洗脱溶液包含浓度在1％(v/v)和15％(v/v)之间的三氟乙酸和浓度在50％(v/v)和90％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗脱溶液由水中约5％(v/v)的三氟乙酸和约70％(v/v)的乙腈组成。[0143]在一些实施方案中，在第二spe步骤期间保留在固定相中的分析物用包含碱和水可混溶的极性有机溶剂的洗脱溶液洗脱。在其他实施方案中，在第二spe步骤期间保留在固定相中的分析物用包含酸和水可混溶的极性有机溶剂的洗脱溶液洗脱。[0144]碱可以选自由水溶性氢氧化物、碳酸盐、氧化物及其组合组成的组。例如，碱可以是水溶性氢氧化物。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物、有机氢氧化物及其组合。在优选的实施方案中，碱是氢氧化铵。水可混溶的有机溶剂可以是极性非质子有机溶剂或质子有机溶剂。水可混溶的有机溶剂的类别的非限制性实例包括但不限于酯类、腈类、羧酸类、酰胺类、醛类、酮类及其组合。本领域技术人员将理解，并非上述类别的每个成员都是水可混溶的，然而，本领域技术人员可以容易地确定特定类别的成员是水可混溶的。在又更优选的实施方案中，水可混溶的有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺或其组合。在特别优选的实施方案中，本发明方法的第二spe步骤之后的洗脱溶液的水可混溶的有机溶剂是乙腈。洗脱溶液的酸可以是有机酸，优选地乙酸、甲酸或三氟乙酸(tfa)。[0145]在优选的实施方案中，在本发明方法的第二spe步骤之后使用的洗脱溶液包含浓度在5％(v/v)和15％(v/v)之间的氢氧化铵和浓度在50％(v/v)和90％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗脱溶液由水中约10％(v/v)的氢氧化铵和约75％(v/v)的乙腈组成。[0146]在另一优选的实施方案中，在本发明方法的第一spe步骤之后使用的洗脱溶液包含浓度在1％(v/v)和15％(v/v)之间的三氟乙酸和浓度在50％(v/v)和90％(v/v)之间的乙腈。在更优选的实施方案中，洗脱溶液由水中约5％(v/v)的三氟乙酸和约70％(v/v)的乙腈组成。[0147]在本发明的第一spe步骤期间洗脱感兴趣的分析物后，可以改变所得洗脱物的ph以使它们准备用于随后的步骤。在优选的实施方案中，使在第一spe期间洗脱后获得的洗脱物与甲酸(优选地水中浓度为30％(v/v)和70％(v/v)之间的甲酸，更优选地水中浓度为约50％(v/v)的甲酸)接触，以降低含有感兴趣分析物的溶液的ph。[0148]然后，可以将第二spe步骤后获得的包含纯化的完整的淀粉样β肽的洗脱物干燥并重悬于适于下游分析诸如质谱的溶液中。合适的干燥方法是本领域已知的，并且可以包括但不限于在离心真空浓缩器(例如thermospeedvac,genevac)中蒸发和冻干。在优选的实施方案中，在本发明的用于制备包含淀粉样β肽的样品的方法的第二spe步骤后获得的洗脱物在真空浓缩器中和在30℃和50℃之间的温度干燥至少30分钟。在更优选的实施方案中，洗脱物在真空浓缩器中和在40℃和47℃之间的温度干燥约35分钟。[0149]干燥洗脱物后，需要将分析物重悬于适于特定下游分析的溶液中。在一些实施方案中，下游分析可以是基于抗体的检测方法，诸如elisa，但在更优选的实施方案中，下游分析是质谱，包括与质谱偶联的液相色谱。用于不同下游分析的合适溶液是本领域已知的。[0150]在本发明的一些实施方案中，进一步对分析物进行质谱分析，包括与质谱偶联的液相色谱，并且在其中重悬干燥的分析物的溶液包含表面活性剂、还原剂、水可混溶的极性有机溶剂和酸中的至少两种。在其他实施方案中，重悬干燥的分析物的所述溶液包含表面活性剂和还原剂。在其他实施方案中，重悬干燥的分析物的所述溶液包含表面活性剂、还原剂、极性有机溶剂和酸。[0151]根据本发明，重悬干燥的分析物的溶液的表面活性剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是非离子型的。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型的。在一些优选的实施方案中，非离子表面活性剂为乙氧基化物类型。在又更优选的实施方案中，乙氧基化物类型的非离子表面活性剂是tritonx-100。[0152]根据本发明，重悬干燥的分析物的溶液的还原剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地适于还原二硫键的还原剂。适于还原二硫键的还原剂的非限制性实例包括有机膦还原剂或其他还原剂，诸如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。在优选的实施方案中，适于还原二硫键的还原剂是有机膦还原剂。在更优选的实施方案中，有机膦还原剂是三羧乙基膦。[0153]根据本发明，重悬干燥的分析物的溶液的水可混溶的极性有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是乙腈或二甲基甲酰胺。在其他实施方案中，极性有机溶剂可以是乙腈和二甲基甲酰胺的混合物。水可混溶的有机溶剂可以是极性非质子有机溶剂或质子有机溶剂。水可混溶的有机溶剂的类别的非限制性实例包括但不限于醚类、酯类、腈类、羧酸类、酰胺类、醛类、酮类及其组合。本领域技术人员将理解，并非上述类别的每个成员都是水可混溶的，然而，本领域技术人员可以容易地确定特定类别的成员是水可混溶的。在又更优选的实施方案中，水可混溶的有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺或其组合。[0154]根据本发明，重悬干燥的分析物的溶液的酸可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是有机酸。在又更优选的实施方案中，有机酸是羧酸。在又更优选的实施方案中，羧酸是单羧酸、二羧酸或三羧酸。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤4、例如约≤3、诸如约≤2、适当地≤1的pka。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤0.5的pka。在优选的实施方案中，羧酸是c1-c10卤代烷基单羧酸、c1-c10卤代烷基二羧酸或c1-c10卤代烷基三羧酸。例如，羧酸可以是c1-c5卤代烷基单羧酸。在又更优选的实施方案中，羧酸是三氟乙酸(tfa)。因此，在一些优选的实施方案中，重悬干燥的分析物的溶液的酸是tfa。[0155]本文公开的所有pka值是在25℃和1大气压在水中测量的。[0156]在更优选的实施方案中，表面活性剂为tritonx-100，还原剂为三羧乙基膦，极性有机溶剂为乙腈和二甲基甲酰胺，并且酸为tfa。[0157]在一些优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液中乙腈的浓度在2％(v/v)和8％(v/v)之间，更优选地在3％(v/v)和7％(v/v)之间，更优选地在4％(v/v)和6％(v/v)之间，并且甚至更优选地为约5％(v/v)。[0158]在一些优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液中二甲基甲酰胺的浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间，更优选地在0.5％(v/v)和2％(v/v)之间，更优选地在0.5％(v/v)和1.5％(v/v)之间，并且甚至更优选地为约1％(v/v)。[0159]在一些优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液中三氟乙酸(tfa)的浓度在0.1％(v/v)和5％(v/v)之间，更优选地在0.2％(v/v)和4％(v/v)之间，更优选地在0.2％(v/v)和3％(v/v)之间，更优选地在0.2％(v/v)和2.5％(v/v)之间，并且甚至更优选地为约0.5％(v/v)。[0160]在一些优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液中tritonx-100的浓度在0.01％(v/v)和2％(v/v)之间，更优选地在0.05％(v/v)和1％(v/v)之间，更优选地在0.05％(v/v)和0.8％(v/v)之间，更优选地在0.05％(v/v)和0.1％(v/v)之间，并且甚至更优选地为约0.05％(v/v)。[0161]在一些优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液中三羧乙基膦的浓度在0.05％(w/v)和0.3％(w/v)之间，更优选地在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间，更优选地在0.12％(w/v)和0.16％(w/v)之间，并且甚至更优选地为约0.14％(w/v)。[0162]在一些优选的实施方案中，溶解分析物的溶液是包含表面活性剂和还原剂的水性溶液。在又更优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液包含浓度在0.05％(v/v)和0.8％(v/v)之间的tritonx-100和浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦。[0163]在另一优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液包含浓度在0.01％(v/v)和0.1％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦和浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈。[0164]在一些优选的实施方案中，溶解分析物的溶液是包含表面活性剂、还原剂、极性有机溶剂和酸的水性溶液。在又更优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液包含浓度在0.01％(v/v)和0.1％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦、浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈和浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的三氟乙酸(tfa)。在又更优选的实施方案中，溶解干燥的分析物的溶液包含浓度在0.01％(v/v)和0.1％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦、浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈、浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的二甲基甲酰胺和浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的三氟乙酸(tfa)。[0165]在一些实施方案中，通过本发明的方法制备的样品通过液相色谱和/或质谱进一步分析。[0166]本发明还涉及用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法，其特征在于，该方法不包括在质谱分析之前对血浆样品进行免疫沉淀或消化。[0167]本发明还涉及一种用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法，其特征在于，该方法主要包括以下步骤：[0168]a)使所述血浆样品与变性剂接触，[0169]b)对步骤a)中获得的溶液进行第一固相萃取步骤以回收第一洗脱物，[0170]c)对步骤b)中获得的所述第一洗脱物进行第二固相萃取步骤以回收第二洗脱物，和[0171]d)干燥步骤c)中获得的所述第二洗脱物并对其进行处理以用于通过质谱分析，[0172]其中从步骤d)获得的样品包含完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42。[0173]在第二方面，本发明涉及一种用于通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法。在一些实施方案中，本发明的通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法包括如本文所述的用于制备样品的方法的步骤a)至步骤d)，并且还包括以下步骤：[0174]i)对步骤d)中获得的溶液进行液相色谱步骤，以分离感兴趣的分析物，[0175]ii)对步骤i)中分离的分析物进行电离，以产生一种或更多种带电荷的物质；[0176]iii)根据所述一种或更多种带电荷的物质的离子迁移率分离所述一种或更多种带电荷的物质，[0177]iv)检测步骤iii)中分离的所述一种或更多种带电荷的物质，并通过质谱测量它们的丰度；和[0178]v)通过将步骤iv)中测量的一种或更多种带电荷的物质的丰度与标准曲线进行比较，确定血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和/或aβ42的量或浓度。[0179]在本发明的一些实施方案中，通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样肽aβ40和aβ42的方法包括对从如本文所述的用于制备包含淀粉样β肽的样品的方法获得的溶液进行色谱步骤i)。在优选的实施方案中，所述色谱步骤是液相色谱(lc)。在更优选的实施方案中，所述液相色谱是hplc。在又更优选的实施方案中，所述色谱步骤是微液相色谱(micro-hplc)。[0180]在本发明的一些实施方案中，通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法包括第二步骤ii)，其中对步骤i)中分离的分析物进行电离以产生一种或更多种带电荷的物质。[0181]在本发明的一些实施方案中，分析物所经历的电离是正离子模式的电喷雾电离(esi)。用于进行本发明的电喷雾电离的条件是本领域技术人员熟知的。[0182]在本发明的一些实施方案中，通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法包括第三步骤iii)，其中根据其离子迁移率分离步骤ii)中获得的一种或更多种带电荷的物质。在优选的实施方案中，通过离子迁移谱(ims)分离所述一种或更多种带电荷的物质。在更优选的实施方案中，本发明的方法中使用的离子迁移谱技术是差分迁移谱(dms)。[0183]在本发明的一些实施方案中，在根据其离子迁移率分离带电荷的物质之后，通过质谱检测它们并测量它们的丰度(步骤iv)。如之前解释的，术语“质谱”包括确定一种分析物或一组分析物的质荷比的若干分析技术。质谱技术的非限制性实例包括离子阱(3d或线性)、单四极杆或三重四极杆、飞行时间、轨道离子阱(orbitrap)、傅立叶变换离子回旋共振质谱及其组合(混合仪器)。[0184]在优选的实施方案中，通过质谱测量带电荷的物质的强度和丰度的技术是在三重四极杆仪中的多重反应监测(mrm)。[0185]在本发明的一些实施方案中，通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法包括第五步骤v)，其中所述肽的量或浓度通过将iv)中测量的分析物的丰度与标准曲线进行比较来确定。[0186]因此，校准曲线优选地使用递增浓度的至少一种标准品来制备，以便量化通过质谱分析的样品中分析物的量或浓度。在本发明的上下文中，由于aβ40和aβ42是优选地待量化的肽，因此标记的15n-aβ40和15n-aβ42优选地用作校准曲线的标准品。[0187]校准曲线可以用包含bsa的缓冲溶液诸如pbs来制备,如先前现有技术中描述的。然而，在本发明的优选的实施方案中，校准曲线用血浆制备，这提供了若干优点，诸如为标准品和分析物两者提供相等的回收率，以及使可以另外对量化产生不利影响的基质效应相等。在更优选的实施方案中，校准曲线用人类血浆制备。[0188]此外，内部标准品被用作本发明方法的不同步骤的质量以及信号归一化的对照。因此，为了确保不同步骤的质量，可以将内部标准品添加到制备校准曲线的溶液中和待通过质谱分析的样品中。[0189]在一些实施方案中，用于校准曲线的溶液和样品用作为内部标准品的标记的2h-aβ40和2h-aβ42加标。在其他实施方案中，用于校准曲线的溶液和样品用作为内部标准品的标记的13c-aβ40和13c-aβ42加标。在其他实施方案中，用于校准曲线的溶液和样品用作为内部标准品的2h-aβ40和13c-aβ42或2h-aβ42和13c-aβ40加标。[0190]在其他实施方案中，本发明涉及一种通过质谱量化血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的方法，其特征在于，该方法不包括通过将iv)中测量的分析物丰度与标准曲线进行比较来确定所述肽的浓度的步骤。在这样的实施方案中，用于量化的方法是半定量方法，其中使用内部标准品的目的是在不与标准曲线进行比较的情况下量化所述分析物的丰度。[0191]本发明的方法中使用的包含淀粉样β肽的样品优选地为血浆样品。用于制备用于通过质谱分析的样品的方法的步骤a)中使用的血浆样品的体积可以由技术人员考虑待遵循的特定的质谱方案来确定。[0192]然而，本发明的方法的优点之一是可以减少获得淀粉样β肽aβ40和aβ42浓度的准确值所需的样品体积，以鉴定受试者的神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病的早期阶段。本发明的方法中所需血浆样品的体积的减少对于大型筛查研究特别方便。[0193]因此，用于制备用于通过质谱分析的包含淀粉样β肽的血浆样品的方法的步骤a)中使用的样品体积在100μl和400μl之间。在优选的实施方案中，样品体积在150μl和300μl之间。在更优选的实施方案中，样品体积在200μl和250μl之间。在又更优选的实施方案中，样品体积为约200μl。[0194]在第三方面，本发明涉及一种用于处理待通过质谱分析的干燥的洗脱物的水性溶液，该水性溶液包含表面活性剂、还原剂、水可混溶的极性有机溶剂和酸中的至少两种。在其他实施方案中，所述水性溶液包含表面活性剂和还原剂。在其他实施方案中，所述溶液包含表面活性剂、还原剂、极性有机溶剂和酸。[0195]根据本发明，处理干燥的分析物的溶液的表面活性剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是非离子型的。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子型的。在一些优选的实施方案中，非离子表面活性剂为乙氧基化物类型。在又更优选的实施方案中，乙氧基化物类型的非离子表面活性剂是tritonx-100。[0196]根据本发明，处理干燥的分析物的溶液的还原剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地适于还原二硫键的还原剂。适于还原二硫键的还原剂的非限制性实例包括有机膦还原剂或其他还原剂，诸如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。在优选的实施方案中，适于还原二硫键的还原剂是有机膦还原剂。在更优选的实施方案中，有机膦还原剂是三羧乙基膦。[0197]根据本发明，处理干燥的分析物的溶液的水可混溶的极性有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何类型。水可混溶的有机溶剂可以是极性非质子有机溶剂或质子有机溶剂。水可混溶的有机溶剂的类别的非限制性实例包括但不限于酯类、腈类、羧酸类、酰胺类、醛类、酮类及其组合。本领域技术人员将理解，并非上述类别的每个成员都是水可混溶的，然而，本领域技术人员可以容易地确定特定类别的成员是水可混溶的。在又更优选的实施方案中，水可混溶的有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺或其组合。[0198]根据本发明，处理干燥的分析物的溶液的酸可以是本领域技术人员已知的任何类型，优选地是有机酸。在又更优选的实施方案中，有机酸是羧酸。在又更优选的实施方案中，羧酸是单羧酸、二羧酸或三羧酸。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤4、例如约≤3、诸如约≤2、适当地≤1的pka。单羧酸、二羧酸或三羧酸可以具有约≤0.5的pka。在优选的实施方案中，羧酸是c1-c10卤代烷基单羧酸、c1-c10卤代烷基二羧酸或c1-c10卤代烷基三羧酸。例如，羧酸可以是c1-c5卤代烷基单羧酸。在又更优选的实施方案中，羧酸是三氟乙酸(tfa)。因此，在一些优选的实施方案中，处理干燥的分析物的溶液的酸是tfa。[0199]在更优选的实施方案中，表面活性剂为tritonx-100，还原剂为三羧乙基膦，极性有机溶剂为乙腈和二甲基甲酰胺，并且酸为tfa。[0200]在更优选的实施方案中，本发明的用于重悬待通过质谱分析的干燥的洗脱物的水性溶液包含浓度在0.01％(v/v)和0.1％(v/v)之间的tritonx-100和浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦。[0201]在其他更优选的实施方案中，本发明的用于处理待通过质谱分析的干燥的洗脱物的水性溶液包含浓度在0.010％(v/v)和1％(v/v)之间的tritonx-100、浓度在0.1％(w/v)和0.2％(w/v)之间的三羧乙基膦、浓度在3％(v/v)和7％(v/v)之间的乙腈、浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的二甲基甲酰胺和浓度在0.1％(v/v)和3％(v/v)之间的三氟乙酸(tfa)。[0202]通过参考以下实例，本发明将被更全面的理解。然而，它们不应当被解释为限制本发明的范围。实施例[0203]实施例1：制备用于通过质谱分析的血浆样品[0204]校准曲线和质量控制[0205]使用人类血浆和15n-aβ40和15n-aβ42标记的标准品(rpeptide,watkinsville,ga,usa)制备了校准曲线和质量控制样品。将50pg/ml至3000pg/ml和10pg/ml至100pg/ml的校准范围分别用于制备一系列的15n-aβ40标准品和15n-aβ42标准品。[0206]校准曲线的系列标准品、质量控制样品和待被进一步分析的来自人类受试者的血浆样品均用定制标记的作为内部标准品的2h-aβ40和2h-aβ42(bachem,bubendorf,switzerland)进行加标(spike)，用于质量控制和信号归一化。[0207]制备用于通过质谱分析的血浆样品[0208]取决于随后使用的spe小柱的组合，按照不同的方案(a、b、c或d)制备从人类受试者获得的血浆样品。[0209]方案a：首先用所选的内部标准品对样品进行加标。然后，通过使400μl水中50％甲酸(fa)与200μl人类血浆接触，使样品变性。变性后，使用两个连续的spe步骤纯化淀粉样肽。[0210]第一spe由反相spe组成，其中使用了hlbprime萃取板(oasishlbprime96孔板，30mg,waters,milford,ma,usa，零件号186008054)。以下概述了用于第一spe的合适条件：[0211]·溶剂化：1ml乙腈[0212]·调节：1ml水中0.1％fa(甲酸)[0213]·样品装载[0214]·洗涤1：0.5ml5％甲醇[0215]·洗涤2：0.5ml水中10％乙腈[0216]·洗脱：0.4ml乙腈/水70/30中0.1％tfa[0217]·通过添加10μl水中50％fa将洗脱物酸化。[0218]在第一spe之后，对洗脱物进行第二spe，在这种情况下，使用mcx萃取板(oasismcx96孔μelution板，30μm，2mg，waters,milford,ma,usa，零件号186001830ba)进行混合模式反相阳离子交换spe。以下概述了用于第二spe的合适条件：[0219]·溶剂化：0.2ml甲醇[0220]·调节：0.2ml水中5％fa[0221]·样品装载：来自spe1的酸化洗脱物[0222]·洗涤1：0.4ml水中5％fa[0223]·洗涤2：0.4ml水中40％乙腈[0224]·洗液3：0.4ml100％乙腈[0225]·洗脱：100μl乙腈/水/氢氧化铵75/15/10。[0226]在第二spe后，将洗脱物在真空浓缩器中在45℃蒸发至干燥，持续35分钟。然后，将干燥的样品用25μlab溶剂重悬，ab溶剂是一种内部优化的溶液，包含以下：[0227]·100％乙腈：2.5ml[0228]·100％二甲基甲酰胺(dmf)：0.5ml[0229]·水中25％tfa：1ml[0230]·水中10％tritonx-100：0.25ml[0231]·三羧乙基膦：70mg[0232]·水：在容量瓶中定容至体积50ml。[0233]方案b：首先用所选的内部标准品对样品进行加标。然后，通过使400μl水中50％甲酸(fa)与200μl人类血浆接触，使样品变性。变性后，使用两个连续的spe步骤纯化淀粉样肽。[0234]第一spe由反相spe组成，其中使用了hlb萃取板(oasishlb,96孔板，30μm,30mg,waters,milford,ma，usa，零件号wat058951)。以下概述了用于第一spe的合适条件：[0235]·溶剂化：1ml乙腈[0236]·调节：1ml水中0.1％tfa(三氟乙酸)[0237]·样品装载[0238]·洗涤1：1ml0.1％tfa[0239]·洗涤2：0.5ml水中10％乙腈[0240]·洗脱：0.7ml乙腈/水中30/70中2％tritonx-100[0241]·通过添加10μl水中50％fa将洗脱物酸化。[0242]在第一spe之后，对洗脱物进行第二spe，在这种情况下，使用mcx萃取板(oasismcx96孔μelution板，30μm,2mg,waters,milford,ma,usa，零件号186001830ba)进行混合模式反相阳离子交换spe。以下概述了用于第二spe的合适条件：[0243]·溶剂化：0.2ml甲醇[0244]·调节：0.2ml水中25％fa[0245]·样品装载：来自spe1的酸化洗脱物[0246]·洗涤1：0.4ml水中25％fa[0247]·洗涤2：0.4ml水中60％乙腈[0248]·洗液3：0.4ml100％乙腈[0249]·洗脱：100μl乙腈/水/氢氧化铵75/15/10。[0250]在第二spe后，将洗脱物在真空浓缩器中在45℃蒸发至干燥，持续35分钟。然后，将干燥的样品用25μlab溶剂重悬，ab溶剂是一种内部优化的溶液，包含以下：水中5％v/vacn、1％v/v二甲基甲酰胺、0.5％v/vtfa、0.05％v/vtritonx-100、0.14％w/v三羧乙基膦。[0251]方案c：首先用所选的内部标准品对样品进行加标。然后，通过使400μl水中50％甲酸(fa)与200μl人类血浆接触，使样品变性。变性后，使用两个连续的spe步骤纯化淀粉样肽。[0252]第一spe由混合模式反相阳离子交换spe组成，其使用了mcx萃取板(oasismcx96孔板，30μm,30mg,waters,milford,ma,usa，零件号186000248)。以下概述了用于第一spe的合适条件：[0253]·溶剂化：1ml甲醇[0254]·调节：1ml水中25％fa[0255]·样品装载[0256]·洗涤1：1ml水中25％fa[0257]·洗涤2：1ml水中60％乙腈(40/60)[0258]·洗液3：1ml100％乙腈[0259]·洗脱：2×400μl乙腈/水/氢氧化铵(75/15/10)。[0260]在第一spe之后，对洗脱物进行第二spe，在这种情况下，使用maxμelution萃取板(oasismaxμelution板，waters,milford,ma,usa，零件号186001829)进行混合模式反相阴离子交换spe。以下概述了用于第二spe的合适条件：[0261]·溶剂化：0.3ml甲醇[0262]·调节：0.4mlnh4oh10％[0263]·样品装载[0264]·洗涤1：0.4mlnh4oh10％[0265]·洗涤2：0.4ml乙腈/水(60/40)[0266]·洗脱：2x50μl乙腈/水70/30，5％tfa。[0267]在第二spe后，将洗脱物在真空浓缩器中在45℃蒸发至干燥，持续35分钟。然后，将干燥的样品用25μlab溶剂重悬，ab溶剂是一种内部优化的溶液，包含以下：水中5％v/vacn、1％v/v二甲基甲酰胺、0.5％v/vtfa、0.05％v/vtritonx-100、0.14％w/v三羧乙基膦。[0268]方案d：首先用所选的内部标准品对样品进行加标。然后，通过使400μl水中25％nh4oh与200μl人类血浆接触，使样品变性。变性后，使用两个连续的spe步骤纯化淀粉样肽。[0269]第一spe由混合模式反相阴离子交换spe组成，其中使用了oasismax96孔板(30μm,30mg,waters,milford,ma,usa，零件号186000373)。以下概述了用于第一spe的合适条件：[0270]·溶剂化：1ml甲醇[0271]·调节：1mlnh4oh10％[0272]·样品装载[0273]·洗涤1：1ml10％nh4oh[0274]·洗涤2：1ml乙腈/水60/40[0275]·洗脱：2×400μl乙腈/水70/30，5％三氟乙酸。[0276]在第一spe之后，对洗脱物进行第二spe，在这种情况下，使用mcx萃取板(oasismcx96孔μelution板，30μm，2mg，waters,milford,ma,usa，零件号186001830ba)进行混合模式反相阳离子交换spe。以下概述了用于第二spe的合适条件：[0277]·溶剂化：0.2ml甲醇[0278]·调节：0.2ml水中25％fa[0279]·样品装载[0280]·洗涤1：0.4ml水中25％fa[0281]·洗涤2：0.4ml水中60％乙腈[0282]·洗液3：0.4ml100％乙腈[0283]·洗脱：100μl乙腈/水/氢氧化铵75/15/10。[0284]在第二spe后，将洗脱物在真空浓缩器中在45℃蒸发至干燥，持续35分钟。然后，将干燥的样品用25μlab溶剂重悬，ab溶剂是一种内部优化的溶液，包含以下：[0285]·100％乙腈：2.5ml[0286]·100％二甲基甲酰胺(dmf)：0.5ml[0287]·水中25％tfa：1ml[0288]·水中10％tritonx-100：0.25ml[0289]·三羧乙基膦：70mg[0290]·水：在容量瓶中定容至体积50ml。[0291]在每种情况下校准曲线和质量控制样品也经历相同的制备方案。[0292]实施例2：通过质谱分析血浆样品[0293]实施例1中制备的血浆样品随后按照本发明的淀粉样肽量化方法通过质谱分析。[0294]用于量化淀粉样肽的分析系统包括以下模块：[0295]om3micro-hplc双泵(捕集-洗脱)色谱仪，配有ctc自动进样器和柱烘箱(sciex,framingham,ma,usa)。[0296]o6500 qtrap混合三重四极杆-线性离子阱质谱仪，与selexion差分迁移谱-dms-接口(sciex,framingham,ma,usa)耦合。[0297]注入后，将样品加载在捕集柱(ymctriartc18,12nm,3μm,5x0.3mm.ymc,dinslaken,germany)上。使用水中0.5％tfa和5％二甲亚砜(dmso)，捕集流量为50μl/min，持续2分钟。然后切换捕集阀，并将分析物从捕集柱洗脱到分析柱和ms系统。使用以下色谱条件：[0298]oa阶段：水中0.1％fa[0299]ob阶段：乙腈中0.1％fa[0300]o流量：15μl/min[0301]o柱：haloproteinc18,3.4μm,0.3x50mm(advancedmaterialstechnology,wilmington,de,usa)[0302]o柱温：55℃[0303]o梯度：15％b持续0.3min，在3.5min线性上升到40％b，在0.1min内上升到90％b并持续0.3min，在0.1min内回到初始条件(15％b)并持续3min，以允许柱重新平衡。[0304]o在5.5min，切换分析阀，并用tfe/水80/20中0.1％tritonx-100洗涤系统。然后用加载溶剂(水中5％dmso0.5％tfa)平衡捕集柱。[0305]当切换捕集阀并将分析物洗脱到分析柱时，样品采集开始。在色谱分离发生后，分析物进入质谱仪的离子源，并经历正离子模式的电喷雾电离(esi)。进入气相后，分析物经历差分迁移谱(dms)，以尽可能地与干扰性基质离子分离。[0306]dms与microlc的特定组合导致背景噪声减少并提高了灵敏度。[0307]dms分离后，通过在三重四极杆仪中的多重反应监测(mrm)分析离子(感兴趣的分析物的带电荷物质)。简而言之，前体(假分子)离子在第一四极杆(q1)中被过滤，在第二四极杆(q2或碰撞单元)中通过与目标气体碰撞而片段化(这一过程称为碰撞诱导解离，cid，或碰撞激活解离，cad)，并且感兴趣的片段在第三四极杆(q3)中被过滤并到达检测器。[0308]电荷态为5(z＝5)的前体离子在q1中被选择，在q2中通过与氮气碰撞使而片段化，并且片段在q3中被分析(也是z＝5)。mrm采集参数总结如下：[0309][0310]对于aβ40、15n-aβ40和2h-aβ40，在q3中分析了b395 产物离子。对于aβ42、15n-aβ42和2h-aβ42，在q3中分析了b415 产物离子。上表中所有的分子质量都是平均质量。[0311]以下采集参数对所有物质都是相同的：源温度250℃、帘式气体30磅每平方英寸(psi)、离子喷雾电压4800伏(v)、离子源气体1(雾化)30psi、离子源气体2(脱溶剂化)50psi、去簇电位85v以及入口电位10v。两个过滤四极杆q1和q3均以单位分辨率运行。[0312]通过校准曲线样品的线性回归，用线性方程拟合峰面积比(15n-aβ40/2h-aβ40和15n-aβ42/2h-aβ42)与浓度数据。在质量控制样品的情况下，将响应比(15n-aβ40/2h-aβ40和15n-aβ42/2h-aβ42)在其对应的校准曲线中进行插值，并获得反算出的浓度并进行评价。对于感兴趣的样品，将样品响应比(aβ40/2h-aβ40和aβ42/2h-aβ42)在其对应的校准曲线中进行插值，并获得计算的浓度。用multiquant3.0.3软件(sciex,framingham,ma,usa)进行回归分析。[0313]实施例3：根据本发明制备和分析的血浆样品中完整的淀粉样β肽aβ40和aβ42的量化[0314]按照实施例1(方案b)和实施例2所述的方法制备来自两个不同血浆样品(样品a和样品b)的20个重复，并按照实施例2中解释的方法进一步通过质谱分析。[0315]通过在对每个血浆样品的20个重复进行的淀粉样β肽量化的校准曲线中进行插值获得的值在下表1中示出。[0316]如表1中可以观察到的，aβ40的量化的变异系数(％cv)低于4％，而aβ42的量化的变异系数为约6％。这些变异系数代表小的变异性，这使得本发明的方法适合于检测组间aβ肽的小的差异。[0317]表1.血浆中aβ40和aβ42的量化[0318][0319]人类血浆中aβ40量化的绝对值与通过本领域已知的ms法和免疫配体结合测定(lba)法(主要是elisa)获得的值相似。然而，对于aβ42的量化，用本发明的方法观察到的水平显著更高。[0320]此外，本发明的方法允许量化完整的肽aβ40和aβ42，而本领域中已知的其他方法，诸如bateman小组的方法，则检测截短的肽(ovod等人,amyloidbconcentrationsandstableisotopelabellingkineticsofhumanplasmaspecifictocentralnervoussystemamyloidosis,alzheimer’sanddementia,2017oct；13(10):1185)。[0321]实施例4：检测样品中aβ物质的小的变化[0322]在进一步的研究中，研究了检测人类血浆中淀粉样蛋白浓度的小的差异的能力。因此，按照实施例1的方法(方案b)制备了200μl和220μl的血浆样品，并按照实施例2中解释的方法进一步通过质谱分析。在这种情况下，对分析物的比(面积14n-aβ40/15n-aβ40和14n-aβ42/15n-aβ42)进行比较。[0323]在本实施例中，血浆样品中淀粉样蛋白浓度完全相同。然而，对于绝对量来说并不是这样，因为使用的体积存在10％的差异。这种情况模拟了实际样品中10％的浓度差异。[0324]表2示出了按照实施例1和实施例2所述的本发明方法，在样品起始体积为200μl或220μl的相同血浆样品的几个重复中进行的aβ42和aβ40量化的结果。[0325]结果显示，通过本发明的方法量化，血浆样品体积增加10％导致aβ42和aβ40的量分别增加10％和9％。[0326]表2.血浆样品中aβ40和aβ42肽增加10％的确定[0327][0328]实施例5：本发明方法的诊断性能[0329]根据实施例1中解释的方法制备来自先前通过正电子发射断层成像(pet)表征的36个个体(26个pet阴性个体和14个pet阳性个体)的样品，并根据实施例2中解释的方法进一步通过质谱分析。计算了aβ42/aβ40比，并在图1中示出。对于pet阴性个体，aβ42/aβ40比值的平均值为0.184，标准差为0.02；而对于pet阳性个体，aβ42/aβ40比值的平均值为0.152，标准差为0.03(p值《0.001)。roc曲线示出了auc＝0.8365(图2)。[0330]如背景部分中解释的，aβ42/aβ40浓度比被用作阿尔茨海默病早期阶段的脑淀粉样变性生物标志物，其中当存在淀粉样斑块时，aβ42浓度较低。因此，这些结果表明，本发明的方法不仅可以用于监测作为治疗响应的aβ变化，而且可以用于诊断目的，因为它们允许区分pet阳性个体和pet阴性个体。[0331]实施例6：spe小柱的不同组合的比较[0332]基于如实施例1中解释的制备用于质谱的样品并且然后如实施例2所述进行分析，对spe小柱组合进行不同的测试。针对aβ40和aβ42分别萃取的色谱迹线在图4至图8中示出。为了进行比较，还对单一spe步骤(混合模式反相阳离子交换)的使用进行了评价(图3)。由于色谱柱的持续时间，所得洗脱物不容易被micro-lc成功分析，因此没有评价单一反向模式spe的使用。[0333]因此，评价了以下spe组合：[0334]-图4示出了当按照方案a使血浆样品与酸性变性剂接触，并首先用反向模式spe(hlbprime)、然后是第二混合模式反相阳离子交换spe(mcx)进行分离时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的色谱迹线。[0335]-图6示出了当按照方案b使血浆样品与酸性变性剂接触，并首先用反向模式spe(hlb)、然后是第二混合模式反相阳离子交换spe(mcx)进行分离时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的色谱迹线。[0336]-图5示出了当使血浆样品与酸性变性剂接触，并首先用混合模式反相阳离子交换spe(mcx)、然后是第二反相模式spe(hlb)进行分离时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的色谱迹线。[0337]图中清楚地显示，当第一spe是mcx、然后是hlb时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的迹线比使用第一hlb或hlbprime、然后是mcx获得的迹线差。此外，当与单一spe步骤相比时，如在现有技术中已知的(图3)，迹线要强烈得多，这表明两个连续spe步骤的组合提供了更好的信噪比以及因此更好的灵敏度。[0338]-图8示出了当使血浆样品与酸性变性剂接触，并首先用混合模式反相阳离子交换spe(mcx)分离、然后是第二混合模式反相阴离子交换spe(max)分离(方案c)时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的色谱迹线。将所述迹线与当用酸性剂变性的血浆样品首先用反向模式spe(hlb)、然后是第二混合模式反相阳离子交换spe(mcx)进行分离时获得的迹线进行比较。[0339]图8中示出的色谱迹线显示，使用第一mcxspe、然后是第二maxspe允许获得aβ40和aβ42的鉴别峰，与使用第一hlbspe、然后是mcxspe时类似，尽管此时不那么强烈。然而，当第一spe被hlb替代时(图9)，两种分析物的回收率都很低。[0340]-图7示出了当根据方案d使血浆样品与碱性变性剂接触，并首先用混合模式反相阴离子交换spe(max)、然后是第二混合模式反相阳离子交换spe(mcx)进行分离时，针对aβ40(左图)和aβ42(右图)萃取的色谱迹线。为了进行比较，在图7中还示出了当血浆样品用碱性剂变性并首先用反相模式spe(hlb)、然后是第二混合模式反相阳离子交换spe(mcx)分离时获得的迹线。[0341]这些结果表明，当血浆样品用碱性剂变性，并且然后经历第一max、然后是mcx后，针对aβ40和aβ42获得的峰几乎与当样品用酸性剂变性时hlb然后是mcx的组合一样好。当前第1页12当前第1页12