用于定量糖蛋白的方法与流程

1.本发明涉及用于定量样品中的糖蛋白的方法和用于此类方法中的材料。


背景技术：

2.重组蛋白质被越来越多地开发用于例如作为药物产品。分析工具例如液相层析(lc)和毛细管电泳(ce)已被成功地用于分离且定量完整单克隆抗体变体的大小和荷电变体(staub等人，j pharm biomed anal 55，810-822，2011)。另外，免疫测定如酶联免疫吸附测定(elisa)也被实施用于定量目的，利用针对例如人血清或血浆中的靶蛋白的特异性抗体(mushens等人，j. immunol. methods，162 (1)，1993)。lc-质谱法(ms)是用于蛋白质分析和定量的常用方法。在
‘
自下而上’的ms方法中，靶蛋白的酶促消化产生了签名肽，其随后在作为内标(is)的稳定同位素标记的(sil)肽的存在下进行定量(us20120264155a1)。对完整蛋白质定量日益增加的兴趣由肽水平定量中的一些缺陷驱动(jin等人，bioanalysis 10(11)，851-862，2018)。选择最适当签名肽和优化酶促消化步骤使得测定开发复杂且耗时。另外，酶促蛋白质消化增加了谱复杂性，使得分析更易受干扰影响。然而，肽水平定量中的主要局限性在于关于整个蛋白质分子的信息在消化后丢失，并且任何给定的肽都可能无法真正地代表整个蛋白质。macchi等人描述了定量完整的双特异性抗体及其变体的基于ms的方法(macchi等人，anal chem 87:10475-82 (2015))。然而，基于lc-ms的完整抗体混合物的定量在lc和ms两个方面均带来与大小、结构复杂性和异质性有关的挑战。因此，使用完整的替代蛋白质种类作为is仍是受限的。
3.免疫球蛋白是糖蛋白。igg1、igg2和igg4在ch2区中具有单个保守的asn-连接的糖基化位点(对于igg1在位置asn297处)，并且因此每个免疫球蛋白分子携带两个聚糖。其它免疫球蛋白的糖基化程度更高(参见例如maverakis等人(2015) j autoimmun，57:1-13)。由于岩藻糖、半乳糖和唾液酸残基向核心复合物双触角七糖(glcnac2man3glcnac2)的可变添加，igg-fc asn-连接的聚糖是高度异质的翻译后修饰。聚糖在蛋白质构象、稳定性和生物学功能中起重要作用(costa等人，crit rev biotechnol 34(4): 281-99 (2014))。fc聚糖的异质性因物种和表达系统而变化。哺乳动物细胞系通常应用于制造重组糖蛋白，其中最常用的是基于中国仓鼠卵巢(cho)的表达系统。重组生物治疗剂也产生于其它表达系统，例如酵母、植物或昆虫(lalonde等人，j biotechnol 251:128-40 (2017))。然而，由于酶促机制中的差异，后面这些生物产生与哺乳动物细胞中产生的不同的聚糖结构。
4.糖蛋白样品的去糖基化可以通过诸如肽:n-糖苷酶f (pngase f)等各种糖苷酶来完成，其中每种酶具有其独特的聚糖切割模式(seki等人，(2019) j. biol. chem. 294(45): 17143-54)。已应用了在去糖基化后的lc-ms分析，以表征治疗性单克隆抗体的n-糖占据(liu等人，anal biochem 509第142-45页，2016)。


技术实现要素：

5.仍然需要准确地定量样品中、特别是蛋白质混合物内蛋白质的改善方法。
6.本发明提供了用于定量糖蛋白的方法，其使用具有与混合物中单独的蛋白质样品组分高度可比较的生物物理性质的内标，从而使得能够准确定量此类蛋白质样品的组成。
7.本发明的方法中使用的内标是待定量糖蛋白的变体形式，其仅含有核心glcnac部分而不是完整的聚糖结构。本发明的方法利用样品中的糖蛋白与内标的变体形式之间所得到的质量差异，用于样品中的蛋白质相对于内标的定量。
8.相应地，在第一个方面，本发明涉及用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，b. 将内标加入所述样品中，其中所述内标包含待定量的所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，和c. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
9.在进一步的方面中，本发明涉及用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 通过用一种或多种酶处理所述一种或多种糖蛋白以获得所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式来制备内标，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，b. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，c. 将所述内标加入所述样品中，和d. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
10.在更进一步的方面中，本发明涉及用作用于定量样品中的所述糖蛋白的内标、包含已知量的糖蛋白变体形式的组合物，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式。
附图说明
11.图1显示了所述方法的潜在应用的示意图。在此实例中，5种igg抗体的混合物可以使用充当待定量的5种抗体的内标的5种变体抗体进行定量。除了将内标与待定量的抗体区分开的在内标上残留的核心glcnac部分之外，这些内标与待定量的完全去糖基化的抗体等同。通过应用其中将观察到的质量(x轴)针对洗脱时间(y轴)进行标绘的时间分辨解卷积(trd)，可以生成二维视图，这允许鉴定单独的抗体样品和内标。在第三个维度中，峰值强度以这样的方式保存，即使得可以推导峰体积用于进一步的定量计算。
12.图2显示了igg抗体通过endos2的酶促去糖基化导致由无岩藻糖基化种类的存在引起的样品异质性。(a) igg1-cd19-21d4-e345k用endos2的酶促去糖基化导致聚糖直至核心asn-连接的glcnac基团的有效去除。然而，无岩藻糖基化igg1-cd19-21d4-e345k的存在导致样品异质性，其中一些抗体含有具有glcnac-岩藻糖部分的两条重链，一些含有具有glcnac-岩藻糖部分的一条重链和具有不含与之附着的岩藻糖的glcnac部分的一条重链，并且一些含有具有不含与之附着的岩藻糖的glcnac部分的两条重链。(b) igg1-cd19-21d4-e345k用pngase f的酶促去糖基化导致完全去糖基化的igg1-cd19-21d4-e345k的同质群体。
13.图3显示了endos2处理的igg抗体用来自干酪乳杆菌(l. casei)的α-l-岩藻糖苷
酶的酶促处理有效地去除了残留的岩藻糖基团，导致质量异质性降低。在小图a中，igg1-cd19-21d4-e345k仅用endos2进行处理，导致大部分的igg-(glcnac-fuc)2以及一些igg-(glcnac-fuc)和igg-(glcnac)。在小图b中，igg1-cd19-21d4-e345k用endos2和α-l-岩藻糖苷酶两者进行处理，导致igg-(glcnac)的单峰。
14.图4显示了来自pngase f处理样品的pngase f并不从用endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的igg抗体中去除残留的glcnac部分。(a) 来自pngase f处理的样品igg1-cd19-21d4-e345k的pngase f并不作用于endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的内标igg1-cd19-21d4-e345k-(glcnac)2。(b) 来自pngase f处理的样品igg1-cd19-21d4-e345k的pngase f并不作用于endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的内标igg1-cd19-21d4-e345k-(glcnac)2或未处理的igg1-b12，而来自内标的endos2-和α-l-岩藻糖苷酶确实作用于未处理的igg1-b12。
15.图5显示了抗体混合物的ms分析和lc分析，所述抗体混合物由以下构成：去糖基化的人igg1-cd19-21d4-e345k、igg1-cd22-hurfb4、igg1-7d8、igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k抗体，以及在每条重链上具有asn-连接的glcnac部分的这些抗体的相应内标。(a) 通过常规解卷积质谱法加工的指示重叠的抗体质量峰和匹配内标的ms谱。(b) 如通过lc分析确定的，(a)中提到的抗体和变体抗体内标的洗脱时间。(c) 关于(a)中提到的抗体样品混合物和变体内标的ms和lc数据的时间分辨解卷积质谱，其中每个样品混合物或标准混合物的质量(da)在x轴上，而洗脱时间(分钟)在y轴上。方形指示了关于峰体积积分的边界。
16.图6显示了针对测试的每种抗体的已知抗体浓度(μg/ml)所标绘的样品/is比率。显示了关于(a) igg1-cd19-21d4-e345k、(b) igg1-cd22-hurfb4、(c) igg1-7d8、(d) igg1-cd37-37-3和(e) igg1-cd52-campath-e345k的结果。图6f-j显示了使用时间分辨解卷积ms确定的抗体浓度(μg/ml)，如针对预计的已知抗体浓度(μg/ml)所标绘的。显示了关于(f) igg1-cd19-21d4-e345k、(g) igg1-cd22-hurfb4、(h) igg1-7d8、(i) igg1-cd37-37-3和(j) igg1-cd52-campath-e345k的结果。
具体实施方式
17.定义当在本文中使用时，术语“糖蛋白”指含有共价附着到多肽链的一种或多种聚糖(即寡糖-或碳水化合物-侧链)的蛋白质。将聚糖附着到多肽的过程称为糖基化。最常见的糖基化类型之一是asn-连接的糖基化，其中聚糖附着到多肽的天冬酰胺残基的酰胺氮。
18.术语“内标”具有其在本领域中通常的含义，并且指已知量的物质，在本文中是变体糖蛋白，所述物质被加入含有待定量分析物例如糖蛋白的样品中。然后可以通过确定分析物信号与内标信号的比率，将该物质用于分析物的定量。
19.术语“免疫球蛋白”指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链，即一对轻(l)低分子量链和一对重(h)链组成，所有四条链潜在地通过二硫键互连。免疫球蛋白的结构已得到充分表征。参见例如fundamental immunology第7章(paul，w.编辑，第2版raven press，n.y. (1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区构成。重链恒定区通常由三个结构域ch1、ch2和ch3构成。重链经由所谓的“铰链区”中的二硫键互连。每条轻链通常由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一
个结构域cl构成。vh和vl区可以进一步细分为高可变性区(或高变区，其在结构确定的环的序列和/或形式方面可为高变的)，也被称为互补决定区(cdr)，散布着被称为构架区(fr)的更保守区域。每个vh和vl通常由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端到羧基末端按以下次序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4 (还参见chothia和lesk j. mol. biol. 196，901 917 (1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文的cdr序列根据imgt规则使用domaingapalign (lefranc mp.，nucleic acids research 1999；27:209-212，以及ehrenmann f.，kaas q.和lefranc m.-p. nucleic acids res.，38，d301-307 (2010)来鉴定；还参见互联网http地址(www.imgt.org/)。
20.本发明中对fc区/fc结构域中氨基酸位置的提及根据eu编号(edelman等人，proc natl acad sci u s a. 1969 may；63(1):78-85；kabat等人，sequences of proteins of immunological interest. 第5版
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1991 nih公开号91-3242)。
21.免疫球蛋白的fc区被定义为抗体的片段，其通常在用木瓜蛋白酶消化抗体后生成，并且其包括免疫球蛋白的两个ch2-ch3区以及连接区，例如铰链区。抗体重链的恒定结构域定义了抗体同种型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige。fc区介导了抗体对于被称为fc受体的细胞表面受体和补体系统蛋白质的效应子功能。
22.如本文使用的，术语“糖基化”指翻译后修饰，其涉及将聚糖选择性附着到多肽，例如抗体，以便稳定多肽的结构或向多肽传递功能。聚糖结构因生物而异，但一般包含两个或更多个glcnac部分、多个甘露糖部分和任选进一步的碳水化合物部分，例如半乳糖部分、岩藻糖部分和唾液酸部分。最普遍的糖基化类型，n-联和o-联糖基化，分别在真核细胞的内质网和高尔基体中发生。n-联(或asn-连接的)糖基化是指碳水化合物结构与多肽的天冬酰胺(asn)残基的侧链氮原子连接的过程，而o-联糖基化是指碳水化合物结构与多肽的丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)残基的侧链氧原子连接的过程。免疫球蛋白，例如igg分子，在ch2结构域中的氨基酸位置asn297处具有单个保守的asn-连接的糖基化位点。如本文使用的，术语“去糖基化”指聚糖从多肽(例如抗体)中的去除，例如酶促去除。
23.当在本文中使用时，术语“核心glcnac部分”或“核心asn-连接的glcnac部分”指直接附着到多肽链中的asn受体残基(并且因此不经由另一个部分)的n-乙酰葡糖胺，也被称为glcnac部分。换言之，它是最接近多肽链的glcnac部分。
24.当在本文中使用时，术语“岩藻糖”或“岩藻糖基化的”指其为糖蛋白的聚糖结构的部分的岩藻糖部分。岩藻糖部分可以在复杂聚糖结构中的不同定位处出现。在本上下文中，与核心glcnac部分连接的岩藻糖部分是特别有利的。
25.当在本文中使用时，在从糖蛋白中去除asn-连接的聚糖的上下文中，术语“完全去除”或其变化指从多肽链中的asn受体位点去除整个聚糖结构，包括核心glcnac部分。asn受体残基由此转换为asp。
26.如本文使用的，术语“铰链区”预期指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人igg1抗体的铰链区根据eu编号对应于氨基酸216-230。
27.如本文使用的，术语“ch2区”或“ch2结构域”预期指免疫球蛋白重链的ch2区。因此，例如人igg1抗体的ch2区根据eu编号对应于氨基酸231-340。然而，ch2区也可以是如本文所述的其它亚型中的任一种。
28.如本文使用的，术语“ch3区”或“ch3结构域”预期指免疫球蛋白重链的ch3区。因
此，例如人igg1抗体的ch3区根据eu编号对应于氨基酸341-447。然而，ch3区也可以是如本文所述的其它亚型中的任一种。
29.如本文使用的，术语“同种型”指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga1、igga2、ige或igm或其任何同种异型，例如igg1m(za)和igg1m(f))。进一步地，每个重链同种型都可以与kappa (κ)或lambda (λ)轻链组合。
30.在本发明的上下文中，术语“抗体”(ab)指具有与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其中任一的衍生物。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。如上所述，抗体的恒定区或“fc”区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如clq，补体激活的经典途径中的第一种组分。抗体也可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体或类似分子。术语“双特异性抗体”指对于至少两个不同的、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则此类靶标可能在相同的细胞或者不同的细胞或细胞类型上。如上文指示的，除非另有说明或与上下文明显相矛盾，否则术语抗体在本文中包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。此类片段可以通过任何已知技术例如酶促切割、肽合成和重组表达技术提供。已显示了抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。
31.当在本文中使用时，术语“全长抗体”指含有所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域的抗体，所述结构域对应于在该同种型的野生型抗体中通常发现的那些结构域。“全长氨基酸序列”指当蛋白质在待定量的样品中出现时该蛋白质的整个氨基酸序列，例如样品中的抗体重链的整个氨基酸序列。
32.如本文使用的，术语“抗原结合区域”、“抗原结合区”、“结合区”或“抗原结合结构域”指能够与抗原结合的抗体区域。该结合区通常由抗体的vh和vl结构域定义，所述结构域可以进一步细分为高可变性区(或高变区，其在结构确定的环的序列和/或形式方面可为高变的)，也称为互补决定区(cdr)，散布着被称为构架区(fr)的更保守区域。抗原可以是例如存在于细胞、细菌或病毒粒子上的任何分子，例如多肽。
33.如本文使用的，术语“靶标”或“靶抗原”指抗体的抗原结合区与之结合的分子。靶标包括抗体所针对的任何抗原。术语“抗原”和“靶”关于抗体可以互换使用，并且对于本发明的任何方面或实施方案构成相同的含义和目的。
[0034]“变体形式”是与“亲本”糖蛋白相比包含一种或多种修饰(例如氨基酸取代)的糖蛋白分子。示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含有fc的抗体片段、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。修饰可以包含聚糖或氨基酸序列的修饰。在本发明的上下文中，变体中的氨基酸取代如以下地进行指示：原始氨基酸
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位置
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取代的氨基酸；使用三字母代码或单字母代码，包括代码xaa和x来指示氨基酸残基。相应地，标记“e345r”或“glu345arg”意指该变体在对应于亲本抗体中的氨基酸位置345的变体氨基酸位置中包含用精氨酸取代谷氨酸。
[0035]
如本文使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)预期指表达载体已引入其内的细胞。应当理解，此类术语预期不仅指特定的主题细胞，而且指此细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续代中发生，所以此类后代实际上可能与亲代细
胞不等同，但其仍被包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如cho细胞、hek-293细胞、per.c6、ns0细胞和淋巴细胞以及其它真核宿主，例如植物细胞和真菌。
[0036]
如本文使用的，术语“血浆半衰期”指示在消除期间(在分布阶段后)将血浆中的多肽浓度减少到其初始浓度的一半花费的时间。对于抗体，分布阶段通常为1-3天，在此期间，由于在血浆和组织之间的重新分布，血浆浓度存在约50%降低。
[0037]
如本文使用的，术语“抗体-药物缀合物”指对于至少一种类型的恶性细胞具有特异性的抗体或含有fc的多肽、药物以及将药物与例如抗体偶联的接头。接头在恶性细胞的存在下是可切割的或不可切割的，其中抗体-药物缀合物杀死恶性细胞。
[0038]
本发明的进一步方面和实施方案如上所述，在第一个方面，本发明涉及用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，b. 将内标加入所述样品中，其中所述内标包含待定量的所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，和c. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
[0039]
在一个实施方案中，本发明的方法并不包括蛋白酶解消化或以其它方式来片段化待定量的糖蛋白的多肽链的步骤。
[0040]
在一个实施方案中，该方法在步骤c.之前包括用酶处理样品，其中所述酶能够从所述一种或多种糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖，但不能从所述变体形式中去除核心asn-连接的glcnac部分，即该酶能够完全去除延伸超出核心glcnac部分的asn-连接的聚糖，但不能去除没有延伸超出核心glcnac部分的asn-连接的聚糖，例如仅由任选地岩藻糖基化的核心glcnac部分组成的asn-连接的聚糖。
[0041]
如本文的实施例中所示，pngase f是可以从糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖的酶的实例，即该酶从糖蛋白中去除整个asn-连接的聚糖，包括核心glcnac部分(从而将asn转换为asp)。然而，本文实施例中还显示了pngase f并不从仅具有核心asn-连接的glcnac部分的糖蛋白变体中去除核心glcnac部分。因此，用具有pngase f特性的酶处理样品导致样品中的糖蛋白的完全去糖基化，但并不导致保留核心asn-连接的glcnac的内标的完全去糖基化。本发明的方法利用所得到的质量差异，用于样品中的蛋白质相对于内标的定量。图1说明了本发明的方法的(非限制性)实施方案。
[0042]
在一个实施方案中，在步骤b之前执行用酶的处理，所述酶能够从所述一种或多种糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖，但不能从变体形式中去除核心asn-连接的glcnac部分。在另一个实施方案中，所述酶处理在步骤b中的内标添加之后执行。在一个实施方案中，所述酶是肽:n-糖苷酶f，也被称为pngase f (ec 3.5.1.52) (norris等人，structure 2(11): 第1049-59页(1994))。
[0043]
在另一个实施方案中，该方法在步骤b.之前包括用能够从所述一种或多种糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖的酶处理样品的步骤，任选地随后为在步骤b之前所述酶的去除或失活。例如，如果将可以从糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖但也可以从变体形式中去除核心asn-连接的glcnac的酶用于待定量的糖蛋白的去糖基化，则在变体形式添加前将
所述酶去除或失活可能是有益的或者甚至有必要的，以便保存变体形式和待定量的去糖基化蛋白质之间的质量差异。
[0044]
如所述的，本发明的方法使用待定量的糖蛋白的变体形式作为内标。优选地，对于待定量的每种糖蛋白，内标中的相应变体形式是同质制剂，即对于每种糖蛋白，所有变体分子的质量是等同的。
[0045]
所使用的变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式。特别地，每个核心asn-连接的glcnac部分可以由单个n-乙酰葡糖胺部分组成，所述n-乙酰葡糖胺部分直接附着到所述一种或多种糖蛋白各自的所述变体形式的多肽链中的asn受体残基。在优选的实施方案中，并没有岩藻糖部分与所述核心glcnac部分连接。
[0046]
在其它实施方案中，所述核心glcnac部分是岩藻糖基化的，优选100%岩藻糖基化的，即用作内标的变体形式的所有分子都是岩藻糖基化的。
[0047]
在优选的实施方案中，用作内标的变体形式是多于95%糖基化的，即组合物中的所有变体分子的受体位点总数中多于95%的asn受体位点具有附着的glcnac。在进一步的实施方案中，变体形式是多于98%、例如多于99%、例如100%糖基化的。
[0048]
如所述的，所述一种或多种糖蛋白的定量通过与内标比较来执行。这克服了由作为分开的度量进行测量的样品组成的外部校准曲线在排他地使用时受到诸如ms仪器条件等实验条件、喷雾条件、样品回收率、遗留等影响的问题。同时分析内标和样品分析物两者，以补偿在样品制备和分析的整个过程期间的任何可能变化。在考虑动态范围后，内标的添加量应该与分析物处于适当的比率。只要内标和一种或多种样品分析物的浓度落入线性动态范围内，就不需要校准曲线。然而，将外部校准曲线与内标结合使用是常见实践，并且提供最佳结果，因为外标(es)的使用将不具有例如内源性蛋白质和/或样品基质的干扰，而内标同时校正在分析过程中的仪器稳定性的任何偏差。为了获得校准曲线，计算ms峰值强度比(es/is) (y值)，并且针对已知es浓度(x值)进行标绘。在样品分析(用is掺料)后，可以计算ms峰值强度比(y值) (未知/is)，并且可以通过插值从校准曲线推导出样品浓度。
[0049]
在一个实施方案中，步骤c.中的定量使用质谱法来执行。在进一步的实施方案中，步骤c.中的定量使用质谱法和非基于质量的分离技术的组合来执行。如果样品具有复杂的组成和/或待对多于一种糖蛋白进行定量，则此种不同技术的组合可以是特别有用的。非基于质量的分离技术可以允许具有高度相似质量的两种或更多种蛋白质的分离，因此使得分开定量成为可能。例如，在一个实施方案中，在内标添加后，样品可以包含具有小于75 da、例如小于60 da、例如小于50 da的质量差异的两种或更多种糖蛋白。在一个实施方案中，步骤c.中的定量使用液相层析-质谱法(lc-ms)、例如基于反相的lc-ms来执行。
[0050]
待定量的糖蛋白可以是包含一种或多种asn-连接的聚糖的任何糖蛋白，包括天然糖蛋白、重组糖蛋白、治疗性糖蛋白、诊断性糖蛋白、酶等。在一个实施方案中，待定量的糖蛋白仅含有asn-x-thr糖基化位点，且不含asn-x-ser位点。在另一个实施方案中，待定量的糖蛋白是多于95%糖基化的，即组合物中的所有分子的受体位点总数中多于95%的asn受体位点具有附着的聚糖。在进一步的实施方案中，待定量的糖蛋白是多于98%、例如多于99%、例如100%糖基化的。
[0051]
在一些实施方案中，对两种或更多种，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的糖蛋白进行定量，优选同时进行。特别地，所提供的样品可以包含2-10种不同的抗体，例如
2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10种不同的抗体。在其中样品包含待定量的两种或更多种抗体的本发明的特定实施方案中，所述两种或更多种不同抗体中的丰度最低的抗体以这样的量存在，所述量为所述两种或更多种不同抗体中丰度最高的抗体的量的至少1% (w/w)、2% (w/w)、3% (w/w)、4% (w/w)、5%(w/w)、6% (w/w)、7% (w/w)、8%(w/w)、9% (w/w)或10% (w/w)。特别地，两种或更多种抗体可以以这样的量存在，使得任何两种抗体的量之间的比率(w/w)为1:5至5:1之间，例如1:4至5:1、1:3至5:1、1:2至5:1、1:1至5:1、2:1至5:1、3:1至5: 1、3:4至5:1、1:5至4:1、1:5至3:1、1:5至2:1、1:5至1:1、1:5至1:2、1:5至1:3、1:5至1:4、1:4至4:1、1:4至3:1、1:4至2:1、1:4至1:1、1:4至1:2、1:4至1:3、1:3至4:1、1:3至3:1、1:3至2:1、1:3至1:1、1:3至1:2、1:2至4:1、1:2至3:1、1:2至2:1、1:2至1:1、1:1至4:1、1:1至3:1之间，或例如1:1至2:1之间。
[0052]
待定量的天然糖蛋白可以具有任何起源，包括例如动物起源，例如哺乳动物起源，或其它真核生物起源，例如真菌或酵母起源。类似地，重组产生的糖蛋白可以在能够进行asn-连接的糖基化的任何种类的宿主细胞中产生，包括动物宿主细胞，例如诸如cho细胞等哺乳动物宿主细胞或诸如hek细胞等人细胞，或者真菌或酵母细胞。
[0053]
在一个实施方案中，待定量的一种或多种糖蛋白是抗体。在进一步的实施方案中，该方法包括定量两种或更多种，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的抗体。在更进一步的实施方案中，所述两种或更多种不同的抗体是igg抗体，例如全长igg抗体。在该上下文中，“不同”可以是氨基酸序列的差异和/或除asn-连接的糖基化外的任何翻译后修饰的差异，例如缀合、末端剪切或其它氨基酸残基修饰。在一个实施方案中，差异是除asn-连接的糖基化外的翻译后修饰的差异。在一个实施方案中，该方法包括同时定量同一样品中的抗体-药物缀合物和非缀合的抗体。
[0054]
在进一步的实施方案中，含有待定量的一种或多种糖蛋白的样品是从本领域中描述的经由半分子交换在体外生成双特异性抗体的方法的步骤之一获得的样品(参见例如labrijn等人(2013) pnas 110:5145和wo2011131746)。在这些方法的一些中，将同源二聚体亲本抗体混合并在体外经受受控还原条件，其将抗体分离成半分子并允许再组装和再氧化，以形成双特异性抗体。通过同时定量同源二聚体亲本抗体和所得到的双特异性抗体，可以将本发明的定量方法用于监测双特异性抗体形成的进展和/或测定纯度。
[0055]
在进一步的实施方案中，含有待定量的一种或多种糖蛋白的样品是从wo2019243626 (genmab)中描述的方法的步骤之一获得的样品。
[0056]
wo2019243626描述了用于生产在其氨基酸序列中具有差异的两种或更多种不同抗体的输出混合物的方法，所述差异使得能够通过层析分离抗体，其中-两种或更多种不同抗体以或基本上以所期望或预定浓度比存在于所述输出混合物中；和-该方法包括以下步骤：a. 提供输入混合物，其中两种或更多种不同抗体并不以或基本上不以所期望或预定浓度比存在；b. 通过层析分离两种或更多种抗体；c. 以提供输出混合物所需的量回收两种或更多种抗体。
[0057]
术语“输出混合物”在本文中预期指抗体混合物，其中两种或更多种不同的抗体以所期望或预定浓度比存在。术语“输入混合物”预期指抗体混合物，其中在“输出混合物”的上下文中提及的两种或更多种不同抗体中的至少两种以这样的浓度比存在，即其并非所期望或预定浓度比的浓度比和/或并不在与所期望或预定浓度比的容许偏差内。
[0058]
因此，本发明的方法可以例如被用于定量输入混合物或输出混合物中的抗体。
[0059]
本发明的方法中提供的样品可以是任何种类的包含糖蛋白的样品。在一个实施方案中，样品是细胞培养物样品，即取自或衍生自产生待定量的糖蛋白的细胞(例如重组宿主细胞)的培养物的样品。本发明的方法因此可以例如被用于监测糖蛋白的产生，如果在细胞培养物中产生多于一种糖蛋白，则包括监测糖蛋白(例如所产生的抗体)的数量和/或比率。
[0060]
相应地，在进一步的方面中，本发明涉及用于监测细胞培养物中糖蛋白产生的方法，所述方法包括培养产生所述糖蛋白的宿主细胞，并且执行如本文所述的根据本发明的方法。取决于定量结果，可以调整细胞培养生长条件以调节糖蛋白的产生，或者，如果产生多于一种糖蛋白则调节糖蛋白的比率。
[0061]
本发明的方法还可以被用于糖蛋白制剂或批次在纯化和/或精制后的质量控制(gc)。因此，在一个实施方案中，样品包含纯化的糖蛋白，例如纯化的重组产生的糖蛋白。
[0062]
相应地，在进一步的方面中，本发明涉及用于纯化的重组产生的糖蛋白的质量控制的方法，所述方法包括执行如本文所述的根据本发明的方法。
[0063]
根据本发明的方法可以以自动化方式来进行，即在该方法的一个或所有步骤中没有人为干预。在一个实施方案中，该方法的步骤b.和c.以自动化方式执行。在进一步的实施方案中，步骤a.、b.和c.以自动化方式执行。该方法可以在足够短的时间范围例如4小时或更短时间内提供定量结果，以允许调整正在进行的细胞培养过程。
[0064]
在另一个实施方案中，样品是或衍生自体液样品，例如血液样品、血浆样品或血清样品。本发明的方法因此可以被用于监测诸如人类受试者等受试者中的糖蛋白的命运，例如血浆半衰期。
[0065]
本发明的方法适合于定量跨越广泛范围的浓度的糖蛋白。在一个实施方案中，样品中待定量的每种糖蛋白的浓度高于0.001 g/l，例如高于0.005 g/l，例如高于0.01 g/l。在另一个实施方案中，样品中待定量的每种糖蛋白的浓度低于1 g/l，例如低于0.25 g/l，例如低于0.1 g/l。
[0066]
如所述的，在进一步的方面中，本发明涉及用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 通过用一种或多种酶处理所述一种或多种糖蛋白以获得所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式来制备内标，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，b. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，c. 将所述内标加入所述样品中，和d. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
[0067]
该方法可经必要的修改而包含上文关于本发明的第一个方面的方法描述的一个或多个进一步特征。
[0068]
在一个实施方案中，制备内标的步骤包括用诸如endos2或endos等内切-β-n-乙酰氨基葡糖苷酶(engase ec 3.2.1.96) (fairbanks (2017) chem soc rev46:5128)的处理。
[0069]
在一个优选的实施方案中，所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分且不含与所述核心glcnac部分连接的岩藻糖部分的形式。
[0070]
在一个实施方案中，在步骤a.中用一种或多种酶的所述处理包括用内切-β-n-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶的处理，所述岩藻糖苷酶能够水解来自asn-连接的岩藻糖-α-1,6-glcnac部分的α-1,6-键合，例如岩藻糖苷酶29a，也被称为lcfuc29a (gh29)，ec编号3.2.1.51，来自干酪乳杆菌或脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis) (tsai等人2017 acs chem. biol 12:63)。在进一步的实施方案中，制备内标的步骤包括用endos2或endos (优选endos2)的处理，随后为用岩藻糖苷酶的处理。
[0071]
在本发明的上述方法的一个实施方案中，待定量的一种或多种糖蛋白中的至少一种在核心asn-连接的glcnac部分、即所有核心asn-连接的glcnac部分中的一些上含有岩藻糖。
[0072]
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的内标不是同位素标记的。
[0073]
在一个实施方案中，待定量的糖蛋白及其用于内标的变体形式两者均以其全长形式使用，所述全长形式即具有全长氨基酸链，或以几乎全长形式使用，所述几乎全长形式例如包含其全长氨基酸序列的50%或更多，例如75%或更多，例如90%或更多，例如95%或更多，例如包含重链抗体序列的50%或更多，例如75%或更多，例如90%或更多，例如95%或更多。
[0074]
在进一步的方面中，本发明涉及用作用于定量样品中的所述糖蛋白的内标、包含已知量的糖蛋白变体形式的组合物，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式。优选地，所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分且不含与所述核心glcnac部分连接的岩藻糖部分的形式。
[0075]
公开内容的另外项目1. 用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，b. 将内标加入所述样品中，其中所述内标包含待定量的所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，和c. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
[0076]
2. 根据项目1的方法，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分且不含与所述核心glcnac部分连接的岩藻糖部分的形式。
[0077]
3. 根据项目1或2的方法，其中所述方法在步骤c.之前包括用酶处理样品，其中所述酶能够从所述一种或多种糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖，但不能从所述变体形式中去除核心asn-连接的glcnac部分。
[0078]
4. 根据项目3的方法，其中所述酶处理在步骤b之前执行。
[0079]
5. 根据项目3的方法，其中所述酶处理在步骤b中的内标添加之后执行。
[0080]
6. 根据项目3至5中任一项的方法，其中所述酶是pngase f (ec 3.5.1.52)。
[0081]
7. 根据项目1或2的方法，其中所述方法在步骤b.之前包括用能够从所述一种或
多种糖蛋白中完全去除asn-连接的聚糖的酶处理样品，任选地随后为所述酶的去除或失活。
[0082]
8. 根据前述项目中任一项的方法，其中步骤c.中的定量使用质谱法来执行。
[0083]
9. 根据前述项目中任一项的方法，其中步骤c.中的定量使用质谱法和非基于质量的分离技术的组合来执行。
[0084]
10. 根据前述项目中任一项的方法，其中步骤c.中的定量使用液相层析-质谱法(lc-ms)、例如基于反相的lc-ms来执行。
[0085]
11. 根据前述项目中任一项的方法，其中所述方法并不包括蛋白酶解消化或以其它方式来片段化待定量的糖蛋白的氨基酸链的步骤。
[0086]
12. 根据前述项目中任一项的方法，其中待定量的所述一种或多种糖蛋白及其用于内标的变体形式两者均以其全长形式使用，所述全长形式即具有全长氨基酸链，或以几乎全长形式使用，所述几乎全长形式例如包含其全长氨基酸序列的50%或更多，例如75%或更多，例如90%或更多，例如95%或更多。
[0087]
13. 根据前述项目中任一项的方法，其中待定量的所述一种或多种糖蛋白是抗体。
[0088]
14. 根据前述项目中任一项的方法，其中所述方法包括定量两种或更多种，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的抗体。
[0089]
15. 根据项目14的方法，其中所述两种或更多种抗体是igg抗体，例如全长igg抗体。
[0090]
16. 根据前述项目中任一项的方法，其中待定量的所述一种或多种糖蛋白中的至少一种含有在核心asn-连接的glcnac部分上的岩藻糖。
[0091]
17. 根据前述项目中任一项的方法，其中所述样品是细胞培养物样品。
[0092]
18. 根据前述项目中任一项的方法，其中所述样品包含纯化的重组产生的糖蛋白。
[0093]
19. 根据项目17或18的方法，其中所述方法的步骤b.和c.以自动化方式执行，优选其中步骤a.、b.和c.以自动化方式执行。
[0094]
20. 根据项目1至16中任一项的方法，其中所述样品是血液样品、血浆样品或血清样品。
[0095]
21. 用于监测细胞培养物中糖蛋白产生的方法，所述方法包括培养产生所述糖蛋白的宿主细胞，并且执行根据项目17或19的方法。
[0096]
22. 用于纯化的重组产生的糖蛋白的质量控制的方法，所述方法包括执行根据项目18或19的方法。
[0097]
23. 用作用于定量样品中的所述糖蛋白的内标、包含已知量的糖蛋白变体形式的组合物，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式。
[0098]
24. 用于定量样品中的一种或多种糖蛋白的方法，其中待定量的每种糖蛋白包含一种或多种asn-连接的聚糖，所述方法包括以下步骤：a. 通过用一种或多种酶处理所述一种或多种糖蛋白以获得所述一种或多种糖蛋白各自的变体形式来制备内标，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分的形式，
b. 提供包含待定量的所述一种或多种糖蛋白的样品，c. 将所述内标加入所述样品中，和d. 通过与内标比较来定量所述一种或多种糖蛋白。
[0099]
25. 根据项目24的方法，其中在步骤a.中用一种或多种酶的所述处理包括用诸如endos2或endos等内切-β-n-乙酰氨基葡糖苷酶的处理。
[0100]
26. 根据项目24或25的方法，其中所述变体形式是仅含有核心asn-连接的glcnac部分且不含与所述核心glcnac部分连接的岩藻糖部分的形式。
[0101]
27. 根据项目24至25中任一项的方法，其中在步骤a.中用一种或多种酶的所述处理包括用诸如endos2或endos等内切-β-n-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶的处理，所述岩藻糖苷酶能够水解来自asn-连接的岩藻糖-α-1,6-glcnac部分的α-1,6-键合。
[0102]
28. 根据项目24至27中任一项的方法，其包含项目2至20的进一步特征中的一个或多个。
[0103]
序列
本发明通过下述实施例进行进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步的限制。
实施例
[0104]
实施例1：人igg1-cd19-21d4、人igg1-cd22-hurfb4、人igg1-7d8、人igg1-cd37-37-3和人igg1-cd52-campath及变体的表达和抗体产生对于分离的免疫球蛋白的抗体表达，通过基因合成(geneart gene synthesis；thermofisher scientific，德国)制备可变重(vh)链和可变轻(vl)链序列，并且将其克隆到含有igg1m(f)同种异型重链(hc；seq id no: 1)和轻链(lc；seq id no: 3)恒定区的pcdna3.3表达载体(thermofisher scientific，us)中。如所使用的，重链恒定区氨基酸序列在下文的序列参考表中进行鉴定。
[0105]
通过基因合成或定点诱变引入所期望的突变。本技术中提到的抗体具有衍生自以下的vh和vl序列：先前描述的igg1-cd19-21d4 (wo2007002223；vh: seq id no 4；vl: seq id no 8)、igg1-cd22-hurfb4 (在weber等人，j immunol res 2015，561814 (2015)中公开的鼠抗体的人源化变体)、igg1-7d8 (wo2004/035607；vh: seq id no 16；vl: seq id no 20)、igg1-cd37-37-3 (wo2011/112978；vh: seq id no 23；vl: seq id no 27)和igg1-cd52-campath (crowe等人，immunology 87(1):105-110 (1992)；vh: seq id no 30；vl: seq id no 34)。在本文中也提供了序列。实施例中使用的igg1-cd19-21d4和igg1-cd52-campath抗体具有在氨基酸位置e345处的突变e345k (seq id no: 2)，其增强了单独的抗体之间的fc:fc相互作用。由于这些抗体变体在溶液中是单体的，因此这些突变的存在并不影响当前申请中描述的方法。
[0106]
将序列从pcdna 3.3表达载体亚克隆到内部开发的表达载体pgenpr6dgv (igg1-cd19-21d4-e345k，igg1-cd22-hurfb4，igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k)内，或克隆到载体pcon7d8-dgv (对于igg1-7d8)内，从同一载体表达两个orf。这些表达载体含有由上游cmv启动子和下游tk多聚a转录终止信号调控的两个抗体开放读码框，以及在sv40启动子片段和sv40多聚a转录终止信号的控制下表达的谷氨酰胺合成酶选择标记物。使用
程序t020 (lonza)，基本上根据制造商的说明书，使用amaxa solution v试剂盒通过核转染(lonza nucleofector 2b)，将载体转移到适合在化学成分确定的培养基上的悬浮生长的cho-k1细胞系(ecacc目录号85051005)的细胞内，或转移到处于1
ꢀµ
g/1.0e 06细胞的适合在化学成分确定的培养基上的悬浮生长的cho-k1sv细胞系(ecacc目录号85051005)的细胞中。含有表达载体的细胞在96孔板中在含有gs em补充剂(sigma)的cd-cho培养基(life technologies/thermo scientific)中在msx选择(sigma)下生长4周，这之后将展示生长和igg表达的一组亲本培养物扩大到更大的体积。顶级生产克隆在ambr15平台(tap biosystems)中测试igg表达，这之后选择最佳生产亲本用于接种500ml直至3l的生物反应器，以供应igg材料。在14天后收获细胞培养物，并且通过过滤收集含有igg的上清液。
[0107]
通过蛋白a亲和层析纯化抗体。细胞培养上清液在0.2 μm死端过滤器上进行过滤，随后为加载到适当大小的mabselect sure柱(ge healthcare)上，以及用0.1 m柠檬酸-naoh，ph 3洗脱抗体。将洗脱物立即用2 m tris-hcl，ph 9中和，且过夜透析至12.6 mm磷酸钠、140 mm nacl，ph 7.4 (ge healthcare)。在透析后，样品在0.2 μm死端过滤器上进行无菌过滤。通过在280 nm处的吸光度来确定纯化igg的浓度。纯化的蛋白质通过ce-sds、hp-sec和质谱法进行分析。
[0108]
实施例2：igg抗体通过endos2的酶促去糖基化揭示了由无岩藻糖基化种类的存在引起的样品异质性，而pngase f使igg抗体完全去糖基化对于复杂蛋白质混合物内的igg抗体克隆的绝对定量，可以使用与内部igg抗体标准相组合的质谱法。这些内标应该具有与样品分析物相似的生物物理特性(例如相似的电离效率和物理化学性质)，但应该可与样品分析物区分开。asn-连接的糖基化位点asn297具有结构上多样的asn-连接的聚糖分支，全都都具有在基部处的两个n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)基团。内切糖苷酶endos2水解这两个glcnac基团之间的键合，仅保留最接近多肽链的asn-连接的核心glcnac部分。在此处，测试了使用endos2的酶促处理是否允许生成其中保留小的同质质量标签的内标抗体。
[0109]
为了水解在fc-聚糖的n-聚糖核心的基部处的两个glcnac残基之间的键合，将50
ꢀµ
l的200
ꢀµ
g/ml抗体igg1-cd19-21d4-e345k用1
ꢀµ
l endos2 (40 u/
µ
l；genovis，目录号a0-gl1-020)在37℃下处理1小时，所述endos2是来自血清型m49 a组链球菌属(streptococcus)菌株的内切糖苷酶。可替代地，对于完全去糖基化，将50
ꢀµ
l的200
ꢀµ
g/ml igg1-cd19-21d4-e345k用1
ꢀµ
l肽-n-糖苷酶f (pngase f；2.5u/ml；prozyme，目录号gke-5006d)在37℃下处理过夜。
[0110]
通过在与orbitrap q-exactive plus质谱仪(thermo scientific)在线联接的dionex ultimate 3000 uhplc系统(thermo scientific)上执行的液相层析-质谱法(lc-ms)来分析样品。将样品注射(5
ꢀµ
l)到bioresolve反相单克隆抗体柱(1.0 mm
ꢀ×ꢀ
5 cm，具有450
ꢀå
孔径的2.7
ꢀµ
m粒径；waters，目录号186009015)上。流动相a含有0.1%的甲酸(v/v)水溶液(biosolve，目录号0023244101bs)，而流动相b含有0.1% (v/v)的甲酸乙腈溶液(biosolve，目录号0001934101bs)。使用下述线性梯度以200 μl/分钟洗脱蛋白质：在0分钟的25% b，在2分钟的30% b，在12分钟的40% b，在13分钟的80% b，在18分钟的80% b，在19分钟的25% b，在25分钟的25% b。以17,500的分辨率设置以及5
×
106的自动增益控制(agc)靶值和200 ms的最大注入时间，获取完整的ms谱。每个谱由10次微扫描组成。
[0111]
使用genedata expressionist refiner ms (版本13.0)软件分析原始数据。将保留时间(rt)范围限制为1至22分钟，并且将m/z范围限制为1400至4000 da。使用完整蛋白质活性的谐波抑制解卷积(模式：全自动化，期望(eagerness)：标准；多重保留时间/质量：真实；步长：1.0 da)以及基于曲率的峰值检测(平滑：7次扫描；中心计算：强度加权(0%阈值)；边界确定：拐点)和以下高级设置对谱进行解卷积：最小峰值强度：1%；最小搜索质量：5.0 kda；最大搜索质量：500.0 kda；相对质量窗口：2%；最大质量窗口：1.0 kda；质量解卷积：相对质量窗口10%，最大质量窗口5.0 kda)。然后使用算术平均方法对解卷积的谱求平均值。使用谱峰值检测活性检测解卷积的谱的峰值(平滑：3点；峰值检测：基于上升；中心计算：局部最大值；边界确定：拐点)。排除强度低于最大强度1%的峰。
[0112]
igg1-cd19-21d4-e345k用endos2的酶促处理导致直至asn-连接的glcnac基团的聚糖的有效去除，仅留下最里面的glcnac残基和单个附着的核心岩藻糖(igg-(glcnac-fuc)2；图2)。然而，抗体制剂中不含核心岩藻糖基化(即不含经由α-1,6-键合与最里面的glcnac残基附着的核心岩藻糖基团)的抗体种类的存在导致样品异质性：除igg-(glcnac-fuc)2抗体之外，endos2处理的样品还含有包含具有与核心岩藻糖连接的最里面的glcnac残基的一条重链以及具有不含核心岩藻糖的最里面的glcnac残基的一条重链的一小部分抗体(-fuc或igg-(glcnac-fuc))，以及包含具有不含核心岩藻糖基团的最里面的glcnac残基的两条重链的一小部分抗体(-fuc2或igg-(glcnac))。相比之下，抗体igg1-cd19-21d4-e345k用pngase f的酶促处理(图2b)导致完全去糖基化的igg1-cd19-21d4-e345k的同质群体。
[0113]
实施例3：endos2处理的igg抗体用干酪乳杆菌α-l-岩藻糖苷酶的酶促去岩藻糖基化从核心glcnac基团中去除岩藻糖基团如实施例2中所示，igg抗体用endos2的酶促去糖基化导致igg抗体的异质群体，其携带由具有或不具有岩藻糖基团附着的glcnac核心基团组成的聚糖基团。作为结果，抗体可能含有其中最里面的glcnac残基与核心岩藻糖基团连接的两条重链(igg-(glcnac-fuc)2)，或者可替代地，一条或两条重链可能含有核心glcnac基团而无附着的岩藻糖基团(分别为igg-(glcnac-fuc)或igg-(glcnac))。
[0114]
在此处，通过去除igg-(glcnac-fuc)2和igg-(glcnac-fuc)上的残留岩藻糖基团，同时未触及glcnac基团，测试了是否可将酶促去岩藻糖基化用于去除这种异质性。
[0115]
将50
ꢀµ
l的200
ꢀµ
g/ml igg1-cd19-21d4-e345k在37℃下用以下处理6小时：1
ꢀµ
l内切糖苷酶endos2 (40 u/
µ
l；genovis，目录号a0-gl1-020)，以水解在fc-聚糖的n-聚糖核心的基部处的两个glcnac残基之间的键合；以及1
ꢀµ
l干酪乳杆菌岩藻糖苷酶(岩藻糖苷酶29a；0.5 mg/ml；nzytech，目录号cz0566)，以水解核心岩藻糖基团与最里面的glcnac残基的α-1,6键合。可替代地，将50
ꢀµ
l的200
ꢀµ
g/ml igg1-cd19-21d4-e345k在37℃下用1
ꢀµ
l endos2处理6小时。lc-ms如实施例2中所述的执行。
[0116]
endos2处理的igg抗体用来自干酪乳杆菌的α-l-岩藻糖苷酶的酶促处理有效地从igg-(glcnac-fuc)2和igg-(glcnac-fuc)中去除残留的岩藻糖基团，导致具有同质glcnac标签的igg抗体(图3b)。
[0117]
实施例4：来自pngase f处理的样品的pngase f并不从用endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的igg抗体中去除残留的glcnac部分
如实施例3中所示，igg抗体用endos2和α-l-岩藻糖苷酶的酶促去糖基化留下在两条重链上的小的同质glcnac部分。当用作内标时，这些igg-(glcnac)2抗体可以掺料到已用内切糖苷酶pngase f完全去糖基化的抗体的复杂混合物内。我们测试了pngase f是否可以从igg-(glcnac)2抗体中去除残留的glcnac部分，以确定在可以将内部igg-(glcnac)2标准掺料进去之前是否需要将来自抗体样品的pngase f去除或失活。
[0118]
将50
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l的400
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g/ml igg1-cd19-21d4-e345k在37℃下用以下处理6小时：2
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l内切糖苷酶endos2 (40 u/
µ
l；genovis，目录号a0-gl1-020)，以水解在fc-聚糖的n-聚糖核心的基部处的两个glcnac残基之间的键合；以及2
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l干酪乳杆菌岩藻糖苷酶(岩藻糖苷酶29a；0.5 mg/ml；nzytech，目录号cz0566)，以水解核心岩藻糖基团与最里面的glcnac残基的α-1,6键合。平行地，如实施例2所述，将50
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l的400
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g/ml igg1-cd19-21d4-e345k在37℃下用2
ꢀµ
l pngase f (2.5 u/ml)完全去糖基化过夜。在处理后，25
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l的每种样品进行1:1混合。lc-ms如实施例2中所述的执行。
[0119]
可替代地，将50
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l的600
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g/ml igg1-cd19-21d4-e345k用3
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l endos2和3
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l α-l-岩藻糖苷酶在37℃下处理6小时。平行地，将50
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l的600
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g/ml igg1-cd19-21d4-e345k在37℃下用3
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l pngase f (2.5 u/ml)完全去糖基化过夜。25
ꢀµ
l的每种样品和25
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l的600
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g/ml igg1-b12进行1:1:1混合，并且在37℃下温育3小时。lc-ms如实施例2中所述的执行。
[0120]
将pngase f处理的igg1-cd19-21d4-e345k加入endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的igg抗体(igg1-cd19-21d4-e345k-(glcnac)2)中并不导致endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的igg抗体上的残留glcnac部分的去除(图4a)，显示了不需要将来自样品分析物的pngase f失活或去除。
[0121]
将pngase f处理的igg1-cd19-21d4-e345k加入endos2和α-l-岩藻糖苷酶处理的内标igg1-cd19-21d4-e345k和未处理的igg1-b12中，并不导致内标或未处理的igg1-b12的完全去糖基化。相反，igg1-b12作为igg1-b12-(glcnac)2和igg1-b12-(glcnac)-(glcnac-fuc)变体出现，提示了在该混合物中，来自内标的endos2和α-l-岩藻糖苷酶的酶促活性较来自样品分析物的pngase f的酶促活性占优势。
[0122]
实施例5：抗体混合物的分析通过多维分离方法得到促进如实施例2-4中所述的，经由随后通过endos2内切糖苷酶和干酪乳杆菌岩藻糖苷酶(29a)的抗体样品去糖基化，可以生成高度同质的变体抗体内标。该方法的使用导致在两条重链上都仅具有残留的asn-连接的核心glcnac部分的完整的整个蛋白质。这些抗体变体可以被用作用于定量抗体混合物中单独的抗体的内标。然而，当所有分析的抗体样品及其指定的内标没有重叠的质量分布(即(接近)等压质量)时，含有抗体的样品基于质谱法的分离和检测是最佳的。在此处，我们描述了可以如何将基于lc的分离方法加入程序中，以允许对含有具有重叠质量分布(即(接近)等压质量)的抗体混合物的样品进行时间分辨解卷积。
[0123]
通过将等浓度的人抗体igg1-cd19-21d4-e345k、igg1-cd22-hurfb4、igg1-7d8、igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k混合达总共8 mg/ml的最终浓度来生成抗体混合物。对于内标的生成，将40 μl的endos2 (40 u/μl；genovis，目录号a0-gl1-020)以及21.3 μl的干酪乳杆菌岩藻糖苷酶(岩藻糖苷酶29a；0.5 mg/ml；nzytech，目录号cz0566)加入200 μl的抗体混合物中，以及加入378.6 μl milliq(最终浓度2.5 mg/ml)，并且在37℃
下温育过夜。通过将160 μl的pngase f (2.5u/ml；prozyme，目录号gke-5006d)加入200 μl的抗体混合物中，以及加入440 μl milliq(最终浓度2 mg/ml)，并且使样品在37℃下温育过夜，使样品抗体混合物完全去糖基化。在将抗体样品稀释至120 μg/ml的浓度后，加入内标至75 μg/ml的最终浓度。lc-ms基本上如实施例2中所述的执行。
[0124]
使用genedata expressionist refiner ms (版本13.0)软件分析原始数据。保留时间(rt)范围限制为1至16分钟，随后为使用基于成对比对的树比对方案的层析图比对，伴随空位罚分1和50次扫描的最大rt偏移。使用层析化学噪声扣除活性(rt窗口：50；分位数：50%，方法：剪切，阈值：0.0，rt结构去除：6次扫描)来扣除化学噪声。使用完整蛋白质活性的时间分辨解卷积(最小质量：140 kda；最大质量：150 kda；方法：谐波抑制解卷积；1.0 da步长；7次扫描，基于曲率、强度加权的(0%阈值)峰值检测，以及确定边界的拐点；最小峰值强度：1%；最小搜索窗口：5.0 kda；最大搜索窗口：500.0 kda；相对质量窗口：2%；最大质量窗口：1.0 kda；以及具有相对质量窗口10%和最大质量窗口5.0 kda的质量解卷积)对离子图进行解卷积。使用峰值检测活性检测解卷积的离子图的峰(总和窗口：10次扫描；最小峰大小：10次扫描；最大合并距离：25点；合并策略：中心；平滑：3点；峰值检测：基于上升；分离过滤器：真实，3点；中心计算：局部最大值；边界确定：拐点)。在检测之前，使用已知序列通过蛋白质作图活性来鉴定峰(10 da的质量容限以及10 da的合并匹配；n末端谷氨酰胺至焦谷氨酸盐和c末端赖氨酸丢失的固定修饰；糖基化设置：去糖基化的，仅asn连接的位点，使用共有序列和过滤核心结构；完全连接的二硫键；关于每个igg的复杂连接性；以及关于以下缀合物的下述质量漂移：glcnac(fuc)2: 698 δ；glcnac(fuc): 552 δ；glcnac: 406 δ，具有1个缀合物的最大数目)。
[0125]
图5a显示了抗体混合物的质谱，所述抗体混合物由人igg1-cd19-21d4-e345k、igg1-cd22-hurfb4、igg1-7d8、igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k(标记为种类a
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e)，以及其相应的内标(种类a
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e’，全都用上撇号指示)构成。抗体样品b (igg1-cd22-rfb4)和d (igg1-cd37-37-3)具有几乎等同的质量，并且因此它们的质量峰重叠。类似地，它们相应的内标b'和d'具有重叠的质量峰。其它抗体样品及其相应内标的质谱并未显示重叠。lc分离导致4个主要洗脱峰(图5b)，使得难以鉴定单独的抗体样品和内标。然而，通过应用其中标绘质量(x轴)和洗脱时间(y轴)的时间分辨解卷积(trd)，可以生成二维视图，允许鉴定单独的抗体样品和内标(图5c)。尽管抗体b和d以及伴随的内标b'和d'的质量峰重叠，但这些样品之间的洗脱时间差异允许trd后的峰分离。在第三个维度中，峰值强度以这样的方式保存，即可以推导峰体积用于进一步的定量计算。
[0126]
实施例6：通过时间分辨解卷积ms分析混合的样品和内标使得能够进行具有高准确度的igg浓度确定可以应用如实施例5中所述的基于时间分辨解卷积ms的分离程序，以定量复杂抗体混合物中的单独的抗体。在此处，我们描述了通过测量含有指定的igg-glcnac2内标(is)的抗体样品的ms峰体积/强度，可以如何准确地确定抗体样品浓度。
[0127]
通过如实施例5中所述以限定的抗体浓度混合igg1-cd19-21d4-e345k、igg1-cd22-hurfb4、igg1-7d8、igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k来生成抗体的混合物，以用作外部校准标准。混合物的一部分如实施例5中所述用endos2和干酪乳杆菌岩藻糖苷酶(29a)进行处理，以生成is，并且另一部分如实施例2中所述使用pngase f完全去糖基
化，以生成抗体外标。接下来，生成外标的稀释系列，并且对于每个标准都用一个固定的is浓度进行掺料(即对于每种igg-glcnac2为xxx μg/ml)。抗体外部校准标准的范围为每种单独的抗体15
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80 μg/ml。将50 μl的每个校准标准移液到q-sert小瓶(sigma)内。如实施例2和5中所述，将数据通过trd ms进行采集且随后进行加工。
[0128]
含有去糖基化的igg1-cd19-21d4-e345k、igg1-cd22-hurfb4、igg1-7d8、igg1-cd37-37-3和igg1-cd52-campath-e345k以及参考is igg-glcnac2变体的校准标准的ms峰体积/强度通过lc-ms进行测量，并且数据通过时间分辨解卷积进行加工。
[0129]
通过首先计算去糖基化抗体的ms峰值强度与is的ms峰体积/强度的比率(外标/is)来生成校准曲线。图6a-e在标绘获得的比率(y轴)对单独的标准抗体浓度时显示了极佳的线性。对于每个生成的抗体标准曲线，发现决定系数(r2)为0.99，指示了igg-glcnac
2 is对获得校准曲线的合适性。图6f-j显示了相对于预计的抗体浓度，如从校准曲线推导出的对于每种抗体计算的抗体样品浓度，指示了测量的高准确度。
[0130]
实施例7：通过时间分辨解卷积ms的过程中igg浓度确定。
[0131]
通过将实施例5中描述的方法整合到过程中的工作流程内，可以加速igg定量。为此，将包含细胞培养上清液的测试样品在2至24小时之间通过pngase f去糖基化(使用类似于实施例2中描述的方法)。随后，将去糖基化的细胞上清液样品用先前制备的is抗体进行掺料(实施例5)，优选在接近于预计的样品igg浓度的范围内。接下来，将制备的样品注入到lc-ms系统内。lc-ms系统包含亲和纯化捕集柱。在本实施例中，亲和捕集柱含有固定化的蛋白a，其结合抗体的fc部分。在制备的细胞培养物样品注入后，抗体在蛋白a柱上被捕获。随后，通过利用洗涤缓冲液从柱中洗掉所有宿主细胞蛋白。在下一步骤中，捕获的抗体通过低ph洗脱缓冲液在一个步骤中从柱中洗脱，并且随后在与质谱仪联机的反相(rp)分析柱上分离。所获得的ms数据将进行加工，并且检测抗体质量，并且浓度值将根据实施例6由信号强度进行计算。