一种针对三线镰刀菌的纳米铜抗菌剂

1.本发明涉及抗菌剂技术领域，特别涉及一种针对三线镰刀菌的纳米铜抗菌剂。


背景技术：

2.随着经济社会的发展，消费者对健康的追求越来越强烈，抗菌技术随之映入眼帘，纳米材料因其独特的理化特性，成为近年来一种新型高效抗菌技术。制备金属纳米粉体的方法有电爆丝法(eew)、等离子体合成法、溶胶-凝胶法、感应加热蒸发法(ihe)、激光感应复合加热蒸发法(lche)等。然而，这些方法都不能大规模地产生纳米粉体，为了解决市场需求，我们课题组自主研发了金属纳米粉体宏量制备技术(mpnp)。该技术是通过特定的能量转换法，将高纯度含金属原料转化为流动状态，与反应气体发生反应，同时利用温度场控制相平衡，然后成核和团聚，得到纳米粉体。该工艺原料利用率高，收率高，绿色环保。
3.目前市场上的抗菌剂琳琅满目，一般分为无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂。无机抗菌剂具有广谱抗菌、高稳定性、高持久度、耐高温等特点，尤其是在近年出现的对许多抗菌剂都免疫的超级细菌，无机抗菌剂的应用是突破高耐药性的关键。金属纳米材料是一种优良的无机抗菌材料，其中银离子类抗菌剂是最常用的抗菌剂，抗菌性能优异，但是银纳米颗粒生产成本高、细胞毒性强，当纳米银颗粒接触动物细胞时，产生的活性氧对动物细胞具有明显的毒性；铜系也是优良的无机抗菌剂，铜是人体健康不可缺少的微量营养素，对于血液、中枢神经和免疫系统，头发、皮肤和骨骼组织以及脑子和肝、心等内脏的发育和功能有重要影响，生产成本低廉，抗菌性能仅次于银，铜与水在有氧条件下发生化学反应，产生羟自由基(－oh)和活性氧离子(o
2－
)，它们具有很强的氧化还原作用，能够破坏微生物细胞增殖能力，从而抑杀微生物，纳米铜比表面积增大，更易发生化学反应，因此选铜纳米颗粒。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种针对三线镰刀菌的纳米铜抗菌剂，通过铜纳米颗粒的优异抗菌性能提高三线镰刀菌的抗菌率进而提高农作物产量。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种针对三线镰刀菌的纳米铜抗菌剂，其特征在于，包括如下步骤：
7.步骤一：核壳型铜纳米颗粒和磷酸盐缓冲溶液超声振荡处理获得纳米铜抗菌剂；
8.步骤二：探究三线镰刀菌最佳稀释倍数；
9.步骤三：选用最佳稀释倍数的三线镰刀菌，用不同浓度的纳米铜抗菌剂分别探究其对于三线镰刀菌的抗菌率。
10.优选地，在步骤一中，所述的铜纳米颗粒由面心立方结构铜和立方晶系赤铜矿(cu2o)组成，如图1，可见三个明显分立的衍射峰，衍射角2θ分别为43.297
°
、50.433
°
和74.130
°
，分别对应面心立方结构铜的(111)、(200)和(220)晶面；另有三个微弱的衍射峰，衍射角2θ分别为29.554
°
、42.297
°
和61.344
°
，分别对应立方晶系赤铜矿的(110)、(200)和
(220)晶面。
11.优选地，在步骤一中，如图2，所述的铜纳米颗粒为球形、团聚较少、分散性好，平均粒径为68.98nm。
12.优选地，在步骤一中，如图3，所述的铜纳米颗粒只含有铜元素和氧元素，含量分别为99.53wt.％和0.47wt.％。
13.优选地，在步骤一中，所述的磷酸盐缓冲溶液是常用于生物学研究的一种缓冲溶液，它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，ph为7.2-7.4，主要成分有氯化钠137mm、磷酸氢二钠10mm、磷酸二氢钾1.76mm、氯化钾2.7mm。
14.优选地，在步骤一中，制备纳米铜抗菌剂的超声波清洗剂超声频率为40
±
1khz，其抗菌剂制备步骤如下：
15.纳米铜浓度为1
×
10-7
g/ml的抗菌剂的制备：向离心管中注入5mlpbs缓冲液，再向其中加入0.01g纳米铜，在40khz下超声振荡处理10min，用移液枪吸取0.5ml纳米铜溶液加入到新的离心管中，再向其中注入4.5mlpbs缓冲液，超声处理，获得稀释10倍的纳米铜溶液，以此稀释的方法，可获得含有0.0001g纳米铜的pbs溶液5ml，再吸取0.5ml加入至99.5mlpbs缓冲液中，即可获得浓度为1
×
10-7
g/ml的纳米铜抗菌剂。
16.优选地，在步骤二中，所述三线镰刀菌是植物致病真菌。
17.优选地，在步骤二中，选用稀释倍数为102、103、104的三线镰刀菌探究最佳稀释倍数，其主要步骤如下：
18.(1)菌悬液的制备：三线镰刀菌菌种斜面用接种环划取一定量的菌加入到100ml马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，主要成分为马铃薯浸粉0.7g/l、蛋白胨1.4g/l、葡萄糖2.1g/l、氯化钠0.7g/l。放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到真菌母液。
19.(2)活化三线镰刀菌：取100μl真菌母液加入到100ml营养肉汤培养基中，放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到处于稳定期的真菌母液。
20.(3)稀释菌液及培养：移液枪吸取0.5ml真菌母液到10ml离心管中，再吸取4.5ml pbs缓冲液于离心管中，振荡摇匀得稀释101倍的菌液，重复此步骤分别获得稀释102、103、104倍的三线镰刀菌。
21.准备3个250ml锥形瓶，在其中加入95mlpbs缓冲液，每个锥形瓶中加入5ml稀释后的菌液，封口后放入摇床，于28℃、180r/min培养24h。
22.(4)涂板：提前准备好马铃薯琼脂培养基，主要成分为马铃薯浸粉1.104g/l、琼脂3.68g/l、葡萄糖3.68g/l，ph值为5.6。从培养后的混合液中分别吸取100μl，滴在固体培养基表面，用涂布棒涂抹均匀，每个处理重复三次，放入28℃培养箱中培养48h。
23.(5)计数：取培养48h后的固体培养基进行计数，每个菌落记为1个真菌，分别计3个平行培养皿真菌数并取平均值，如图4，从而选取最佳稀释倍数为103倍。
24.优选地，在步骤三中，纳米铜抗菌剂的浓度分别为0、1
×
10-7
g/ml、5
×
10-7
g/ml、1
×
10-6
g/ml、5
×
10-6
g/ml、1
×
10-5
g/ml、5
×
10-5
g/ml、1
×
10-4
g/ml。
25.优选地，在步骤三中，抗菌实验步骤如下：
26.(1)菌悬液的制备：三线镰刀菌菌种斜面用接种环划取一定量的菌加入到100ml马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，主要成分为马铃薯浸粉0.7g/l、蛋白胨1.4g/l、葡萄糖2.1g/l、氯化钠0.7g/l。放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到真菌母液。
27.(2)活化三线镰刀菌：取100μl真菌母液加入到100ml营养肉汤培养基中，放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到处于稳定期的真菌母液。
28.(3)稀释菌液及共培养：移液枪吸取0.5ml真菌母液到10ml离心管中，再吸取4.5mlpbs缓冲液于离心管，振荡摇匀得稀释101倍的菌液，重复此步骤可获得稀释103倍的三线镰刀菌。
29.准备浓度梯度个250ml锥形瓶，在其中加入90mlpbs缓冲液和5ml不同浓度的纳米铜抗菌剂，摇晃均匀，向每个锥形瓶中加入5ml稀释103倍的菌液，封口后放入摇床，于28℃、180r/min共培养24h。
30.(4)涂板：提前准备好马铃薯琼脂培养基，主要成分为马铃薯浸粉1.104g/l、琼脂3.68g/l、葡萄糖3.68g/l，ph值为5.6。从培养后的混合液中分别吸取100μl，滴在固体培养基表面，用涂布棒涂抹均匀，每个处理重复三次，放入28℃培养箱中培养48h。
31.(5)计数：取培养48h后的固体培养基进行计数，每个菌落记为1个真菌，分别计3个平行培养皿真菌数并取平均值，然后计算抗菌率，如图6，可知纳米铜液体抗菌剂对三线镰刀菌的mic为1
×
10-4
g/ml。
32.优选地，抗菌率计算公式为：
[0033][0034]
式中：
[0035]
r—抗菌率，％
[0036]
a—共培养后对照样品菌落数
[0037]
b—共培养后试验样品菌落数
[0038]
通过上述工艺和所选试剂，纳米铜抗菌剂将很大程度提高三线镰刀菌的抗菌率。
[0039]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：由于铜纳米颗粒为球形、团聚较少、分散性好，平均粒径为68.98nm，由面心立方结构铜和立方晶系赤铜矿(cu2o)组成，只含有铜元素和氧元素，含量分别为99.53wt.％、0.47wt.％，其抗菌剂成本低，具有高效、持久、广谱的抗菌性。对植物致病真菌三线镰刀菌，纳米铜抗菌剂浓度为1
×
10-4
g/ml时，抗菌率会达到100.00％，即最低抑菌浓度(mic)为1
×
10-4
g/ml。
附图说明
[0040]
图1为本发明中铜纳米颗粒x射线衍射图谱(xrd)；
[0041]
图2(a)为本发明中铁纳米颗粒扫描电子显微镜图(sem)；(b)为本发明中铁纳米颗粒扫描电子显微镜图(sem)得到的粒径分布图；
[0042]
图3为本发明中铜纳米颗粒能谱图(eds)；
[0043]
图4为本发明中三线镰刀菌不同稀释倍数培养48h的菌落图；
[0044]
图5为本发明中三线镰刀菌不同稀释倍数培养48h的菌落数柱状图；
[0045]
图6为本发明中不同纳米铜含量抗菌剂与三线镰刀菌共培养48h的菌落图；
[0046]
图7(a)为本发明中不同纳米铜含量抗菌剂与三线镰刀菌共培养48h的菌落数柱状图；(b)为本发明中不同纳米铜含量抗菌剂与三线镰刀菌共培养48h的抗菌率图。
具体实施方式
[0047]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048]
实施例1
[0049]
制备纳米铜抗菌剂时，向离心管中注入5mlpbs缓冲液，再向其中分别加入0.01g、0.05g、0.1g纳米铜，在40khz下超声振荡处理10min。用移液枪吸取0.5ml纳米铜溶液加入到新的离心管中，再向其中注入4.5mlpbs缓冲液，超声处理，获得稀释10倍的纳米铜溶液，以此稀释的方法，可获得含有0.0001g、0.0005g、0.001g、0.005g、0.01g、0.05g、0.1g纳米铜的pbs溶液各5ml，再从每种溶液中分别吸取0.5ml并分别加入至99.5mlpbs缓冲液中，最终获得浓度分别为1
×
10-7
g/ml、5
×
10-7
g/ml、1
×
10-6
g/ml、5
×
10-6
g/ml、1
×
10-5
g/ml、5
×
10-5
g/ml、1
×
10-4
g/ml的纳米铜抗菌剂。
[0050]
实施例2
[0051]
选用稀释倍数为102、103、104的三线镰刀菌探究最佳稀释倍数，其主要步骤如下：
[0052]
(1)菌悬液的制备：三线镰刀菌菌种斜面用接种环划取一定量的菌加入到100ml马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，主要成分为马铃薯浸粉0.7g/l、蛋白胨1.4g/l、葡萄糖2.1g/l、氯化钠0.7g/l。放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到真菌母液。
[0053]
(2)活化三线镰刀菌：取100μl真菌母液加入到100ml营养肉汤培养基中，放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到处于稳定期的真菌母液。
[0054]
(3)稀释菌液及培养：移液枪吸取0.5ml真菌母液到10ml离心管中，再吸取4.5ml pbs缓冲液于离心管中，振荡摇匀得稀释101倍的三线镰刀菌，重复此步骤分别获得稀释102、103、104的三线镰刀菌。
[0055]
准备3个250ml锥形瓶，向其中加入95mlpbs缓冲液，每个锥形瓶中加入5ml稀释后的菌液，封口后放入摇床，于28℃、180r/min培养24h。
[0056]
(4)涂板：提前准备好马铃薯琼脂培养基，主要成分为马铃薯浸粉1.104g/l、琼脂3.68g/l、葡萄糖3.68g/l，ph值为5.6。从培养后的混合液中分别吸取100μl，滴在固体培养基表面，用涂布棒涂抹均匀，每个处理重复四次，放入28℃培养箱中培养48h。
[0057]
(5)计数：取培养48h后的固体培养基进行计数，每个菌落记为1个真菌，如图4，稀释102倍的4个平行培养皿真菌数都是不可计数，稀释103倍的4个平行培养皿真菌数分别为10、13、11、28，平均菌落数为16，稀释104倍的4个平行培养皿真菌数分别为1、1、3、3，平均菌落数为2，可知三线镰刀菌的最佳稀释倍数为103倍。
[0058]
实施例3
[0059]
选用最佳稀释倍数的三线镰刀菌，用不同浓度的纳米铜抗菌剂分别探究其对于三线镰刀菌的抗菌率，抗菌实验步骤如下：
[0060]
(1)菌悬液的制备：三线镰刀菌菌种斜面用接种环划取一定量的菌加入到100ml马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，主要成分为马铃薯浸粉0.7g/l、蛋白胨1.4g/l、葡萄糖2.1g/l、氯化钠0.7g/l。放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到真菌母液。
[0061]
(2)活化三线镰刀菌：取100μl真菌母液加入到100ml营养肉汤培养基中，放入恒温摇床中，以180r/min、28℃活化24h得到处于稳定期的真菌母液。
[0062]
(3)稀释菌液及共培养：移液枪吸取0.5ml真菌母液到10ml离心管中，再吸取4.5mlpbs缓冲液于离心管中，振荡摇匀得稀释101的三线镰刀菌，重复此步骤获得稀释103倍的三线镰刀菌。准备7个250ml锥形瓶，向其中分别加入90mlpbs缓冲液和5ml含纳米铜1
×
10-5
g、5
×
10-5
g、1
×
10-4
g、5
×
10-4
、1
×
10-3
g、5
×
10-3
g、1
×
10-2
g的抗菌剂，摇晃均匀，再准备1个250ml锥形瓶，向其中加入95mlpbs缓冲液作为对照组。每个锥形瓶中加入5ml稀释后的菌液，封口后放入摇床，于28℃、180r/min进行共培养24h。
[0063]
(4)涂板：提前准备好马铃薯琼脂培养基，主要成分为马铃薯浸粉1.104g/l、琼脂3.68g/l、葡萄糖3.68g/l，ph值为5.6。从培养后的混合液中分别吸取100μl，滴在固体培养基表面，用涂布棒涂抹均匀，每个处理重复三次，放入28℃培养箱中培养48h。
[0064]
(5)计数：取培养48h后的固体培养基进行计数，每个菌落记为1个真菌，如图6，空白对照组的3个平行培养皿真菌数分别是18、42、58，平均菌落数为40；1
×
10-7
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是30、30、35，平均菌落数为32；5
×
10-7
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是25、17、21，平均菌落数为21；1
×
10-6
g/mll抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是15、13、8，平均菌落数为12；5
×
10-6
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是6、6、8，平均菌落数为7；1
×
10-5
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是2、3、3，平均菌落数为3；5
×
10-5
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是1、0、1，平均菌落数为1；1
×
10-4
g/ml抗菌剂3个平行培养皿真菌数分别是0、0、0，平均菌落数为0；可知纳米铜浓度为1
×
10-7
g/ml、5
×
10-7
g/ml、1
×
10-6
g/ml、5
×
10-6
g/ml、1
×
10-5
g/ml、5
×
10-5
g/ml、1
×
10-4
g/ml的抗菌剂，与三线镰刀菌共培养24h的抗菌率分别为20.00％、47.50％、70.00％、82.50％、92.50％、97.50％、100.00％，抗菌性能好。
[0065]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。