用于诱导针对SARS-COV-2的免疫的药剂的用途的制作方法

infectious diseases)合作；国药集团(sinopharm)与中国科学院武汉生物制品研究所和中国科学院武汉病毒研究所(wuhan institute of biological products and wuhan institute of virology of chinese academy of sciences)合作；国药集团与北京生物制品研究所(beijing institute of biological products)和病毒性疾病控制与预防研究所(institute of control and prevention of viral diseases)合作)在iii期临床计划中进行研究，并且一种疫苗(中国医学科学院医学生物学研究所(institute of medical biology,chinese academy of medical sciences)在i期/ii期临床计划中进行研究。
10.(zhang y等人.“灭活的sars-cov-2疫苗在18-59岁健康成人中的安全性、耐受性和免疫原性：一项随机化的、双盲的、安慰剂对照的、1/2期临床试验(safety,tolerability,and immunogenicity of an inactivated sars-cov-2 vaccine in healthy adults aged 18-59years：a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 1/2 clinical trial)”.《柳叶刀传染病》.2021年2月；21(2):181-192；xia s等人.“针对sars-cov-2的灭活疫苗对安全性和免疫原性结果的影响：2项随机化的临床试验的中期分析(effect of an inactivated vaccine against sars-cov-2 on safety and immunogenicity outcomes:interim analysis of 2 randomized clinical trials)”.《美国医学会杂志(jama)》.2020年9月8日；324(10):951-960.xia s等人，“灭活的sars-cov-2疫苗bbibp-corv的安全性和免疫原性：一项随机化的、双盲、安慰剂对照的1/2期试验(safety and immunogenicity of an inactivated sars-cov-2 vaccine,bbibp-corv：a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 1/2 trial)”.《柳叶刀传染病》.2021年1月；21(1):39-51.doi:10.1016/s1473-3099(20)30831-8。epub 2020年10月15日.pmid:33069281；pmcid:pmc7561304.che y等人.“在健康成人中进行的灭活的sars-cov-2疫苗的随机化的、双盲的和安慰剂对照的ii期试验(randomized,double-blinded and placebo-controlled phase ii trial of an inactivated sars-cov-2vaccine in healthy adults)”.《临床传染病(clin infect dis.)》2020年11月9日)。
11.2)含有全长s蛋白作为抗原的疫苗。
12.已知三种基于多种血清型的腺病毒的疫苗，它们表达sars-cov-2的全长s蛋白的基因。康希诺生物股份有限公司(cansino biological inc.)和北京生物技术研究所(beijing institute of biotechnology)已经开发了基于人类腺病毒血清型5的疫苗；牛津大学，阿斯利康(oxford university,astrazeneca)——基于黑猩猩腺病毒的疫苗；俄罗斯卫生部fgbu n.f.gamaleya国家流行病学和微生物学研究中心(fgbu n.f.gamaleya national research center for epidemiology and microbiology,ministry of health of russia)——基于人类腺病毒血清型26和血清型5的疫苗。此外，已知dna疫苗，其含有sars-cov-2的全长s蛋白的基因，并且是由伊诺维奥制药公司(inovio pharmaceuticals)与国际疫苗研究所合作开发的。
13.(zhu f等人.“重组腺病毒5型载体化的covid-19疫苗的安全性、耐受性和免疫原性：一项剂量递增、开放标签、非随机化的、人类首次试验(safety,tolerability,and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored covid-19 vaccine：a dose-escalation,open-label,non-randomised,first-in-human trial)”.《柳叶刀》.2020年6月13日；395(10240):1845-1854.van doremalen n等人.“chadox1 ncov-19疫苗
预防恒河猴的sars-cov-2肺炎(chadox1 ncov-19vaccine prevents sars-cov-2pneumonia in rhesus macaques)”.《自然(nature)》.2020年10月；586(7830):578-582.logunov dy等人.“两种制剂中基于rad26和rad5载体的异源初始增强covid-19疫苗的安全性和免疫原性：来自俄罗斯的两项开放、非随机化的1/2期研究(safety and immunogenicity of an rad26 and rad5 vector-based heterologous prime-boost covid-19vaccine in two formulations：two open,non-randomised phase 1/2studies from russia)”.《柳叶刀》.2020年9月26日；396(10255):887-897)。
14.3)疫苗，其中具有两个脯氨酸取代的全长s蛋白(k986p和v987p)用作抗原。
15.已知两种疫苗，其基于含有编码具有脯氨酸取代的sars-cov-2的s蛋白的mrna的脂质纳米颗粒(莫德纳公司(moderna)与国家过敏和传染病研究所(national institute of allergy and infectious diseases)合作；德国生物新技术公司(biontech)与复星制药(fosun pharma)和辉瑞(pfizer)合作)。此外，已知由诺华公司(novavax)开发的蛋白质亚单位疫苗是；在该疫苗中，sars-cov-2的全长s蛋白具有两个脯氨酸取代(k986p和v987p)并且在弗林蛋白酶切割位点中具有三个突变(r682q、r683q和r685q)。已经由杨森制药公司(janssen pharmaceutical companies)开发了另一种基于人类腺病毒血清型26的疫苗，该疫苗表达sars-cov-2的全长s蛋白，其具有两个脯氨酸取代(k986p和v987p)和在弗林蛋白酶切割位点中的两个突变(r682s和r685g)。
16.(l.baden等人.“mrna-1273 sars-cov-2疫苗的功效和安全性(efficacy and safety of the mrna-1273 sars-cov-2 vaccine)”.《新英格兰医学杂志(n engl j med.)》,2020年12月30日；l.jackson“一种针对sars-cov-2的mrna疫苗——初步报告(an mrna vaccine against sars-cov-2-preliminary report)”.《新英格兰医学杂志》,2020年11月12日；383(20):1920-1931.keech c等人.“sars-cov-2重组刺突蛋白纳米颗粒疫苗的1-2期试验(phase 1-2 trial of a sars-cov-2recombinant spike protein nanoparticle vaccine)”.《新英格兰医学杂志》,2020年12月10日；tostanoski l等人.“ad26疫苗预防仓鼠的sars-cov-2严重临床疾病(ad26 vaccine protects against sars-cov-2 severe clinical disease in hamsters)”.《自然医学(nat med.)》2020 nov；26(11):1694-1700.doi:10.1038/s41591-020-1070-6.epub 2020年9月3日)。
17.4)含有s蛋白的rbd作为抗原的疫苗
18.含有rbd二聚体(残基319-537为串联重复序列)的蛋白亚单位疫苗已经由安徽智飞龙科马生物制药有限公司(anhui zhifei longcom biopharmaceutical)与中国科学院微生物研究所合作开发。此外，已知基于脂质纳米颗粒的疫苗，该脂质纳米颗粒含有编码rbd-三聚体(通过添加来自t4纤维蛋白原(fibritin)的foldon结构域而三聚体化)的mrna(德国生物新技术公司与复星制药和辉瑞合作)(mulligan m等人，“covid-19 rna疫苗bnt162b1在成人中的i/ii期研究(phase i/ii study of covid-19 rna vaccine bnt162b1 in adults)”.《自然》.2020年10月；586(7830):589-593.dai l.“针对covid-19、mers和sars的β冠状病毒疫苗的通用设计(a universal design of betacoronavirus vaccines against covid-19,mers,and sars)”.《细胞(cell)》.2020年8月6日；182(3):722-733.e11.dai l等人.“针对covid-19的疫苗的病毒靶标(viral targets for vaccines against covid-19)”.《自然评论免疫学(nat rev immunol.)》2021年2月；21
(2):73-82)。
19.目前世界上已授权生产8种预防covid-19的疫苗。临床研究结果显示，使用这些疫苗的免疫导致产生针对sars-cov-2的抗体介导的和细胞介导的免疫应答。然而，每种类型的疫苗如何提供持久的接种后保护性免疫尚未确定。专家认为，它可能显示出个体间的可变性，并且根据多种估计，持续1至2年。此类持续时间决定了需要开发待用于人类的再接种的covid预防的特异性药剂。
20.然而，选择再接种药剂是一项具有挑战性的任务。
21.在开发用于再接种的特定预防的药剂的过程中，人们应该牢记由加强的免疫在人体中产生的效应，这些效应对于抗感染免疫的整体结构(包括其保护特性)具有相当大的影响。
22.已知使用包含多种抗原的疫苗(例如灭活的疫苗)导致形成针对每种抗原的免疫应答。然而，在这种情况下，与仅包含这一种抗原的疫苗相比，对于给定抗原的免疫水平较低(免疫应答稀释的效应)。此外，病原体结构中的一些抗原可能是非保护性的，并且针对此类抗原的t细胞克隆和b细胞克隆的形成不会有助于免疫的整体保护性，从而干扰对保护很重要的细胞克隆的形成。
23.基于上述，可以得出结论，包含一种或多种具有显著保护特性的蛋白质的疫苗对于再接种更有前景。在这种情况下，再接种将与额外的刺激(加强)和同等重要的将免疫应答集中于病原体的抗原决定簇有关，无论初始免疫如何，这对于人类保护来说都是最重要的。
24.从现有技术水平上来说，用于针对冠状病毒感染的再接种的药剂还未知。
25.rf专利第2731342号(2020年9月1日公布)中公开的技术方案被要求保护的发明的作者选择作为原型。从这一专利中已知用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药剂的变体。
[0026]-含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0027]-含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还包含组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0028]-含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0029]
此外，在这一专利中，公开了药剂的指定变体用于诱导针对严重急性呼吸综合征
病毒sars-cov-2的特异性免疫的用途，包括以至少一周的时间间隔依次施用有效量的组分1和组分2。
[0030]
这一药剂的缺点是未描述其用于延长疫苗接种后免疫的用途。
[0031]
因此，本发明的背景表明需要开发一种药剂，其可以用于针对由sars-cov-2病毒引起的疾病的再接种。


技术实现要素：

[0032]
要求保护的这组发明的技术问题是开发提供针对sars-cov-2病毒的疫苗接种后免疫延长的药剂。
[0033]
技术结果是产生了提供针对sars-cov-2病毒的疫苗接种后免疫延长的安全且有效的药剂。
[0034]
所述技术结果是通过使用一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起的疾病的再接种来实现的，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；和/或含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0035]
此外，公开了所述药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒，或仅含有组分2。
[0036]
此外，公开了另一种药剂用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起疾病的再接种的用途，所述药剂含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0037]
所述药剂以液体形式或冻干形式使用。
[0038]
更重要的是，用于液体形式的缓冲液以重量％计含有：
[0039][0040]
此外，重构的冻干剂含有缓冲液，所述缓冲液以重量％计由以下构成：
[0041][0042]
此外，在使用期间，组分1和组分2处于分开的容器中。
附图说明
[0043]
图1
[0044]
说明了通过评估由sars-cov-2的s抗原再刺激的增殖cd8 淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的液体形式的所开发的药剂在志愿者中评估免疫效力的结果。
[0045]
y轴
–
增殖细胞的量，％。
[0046]
x轴
–
天数。
[0047]
●‑
表示在第0天每个志愿者的个体值。
[0048]
■‑
表示在第14天每个志愿者的个体值。
[0049]
▲‑
表示在第28天每个志愿者的个体值。
[0050]
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验(mann-whitney test)用括号和符号*，p《0.05；**，p《0.01；****，p《0.001示出。
[0051]
图2
[0052]
说明了通过评估由sars-cov-2的s抗原再刺激的增殖cd4 淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的液体形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
[0053]
y轴
–
增殖细胞的量，％。
[0054]
x轴
–
天数。
[0055]
●‑
表示在第0天每个志愿者的个体值。
[0056]
■‑
表示在第14天每个志愿者的个体值。
[0057]
▲‑
表示在第28天每个志愿者的个体值。
[0058]
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p《0.05；**，p《0.01；****，p《0.001
示出。
[0059]
图3
[0060]
说明了通过评估由sars-cov-2的s抗原再刺激的增殖cd8 淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
[0061]
y轴
–
增殖细胞的量，％。
[0062]
x轴
–
天数。
[0063]
●‑
表示在第0天每个志愿者的个体值。
[0064]
■‑
表示在第14天每个志愿者的个体值。
[0065]
▲‑
表示在第28天每个志愿者的个体值。
[0066]
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p《0.05；**，p《0.01；****，p《0.001示出。
[0067]
图4
[0068]
说明了通过评估由sars-cov-2的s抗原再刺激的增殖cd4 淋巴细胞的百分比，使用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂在志愿者中的免疫效力的评估结果。
[0069]
y轴
–
增殖细胞的量，％。
[0070]
x轴
–
天数。
[0071]
●‑
表示在第0天每个志愿者的个体值。
[0072]
■‑
表示在第14天每个志愿者的个体值。
[0073]
▲‑
表示在第28天每个志愿者的个体值。
[0074]
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p《0.05；**，p《0.01；****，p《0.001示出。
[0075]
图5
[0076]
说明了在免疫前(第0天)和在研究的第14和28天用sars-cov-2的s抗原再刺激后，在用根据变体1的液体形式的所开发的药剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中ifnγ浓度的倍数增加。
[0077]
y轴
–
干扰素γ浓度的倍数增加
[0078]
x轴
–
天数。
[0079]
●‑
表示在第0天每个志愿者的个体值。
[0080]
■‑
表示在第14天每个志愿者的个体值。
[0081]
▲‑
表示在第28天每个志愿者的个体值。
[0082]
对于每个数据集合，中位值显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异使用曼-惠特尼检验用括号和符号*，p《0.05；**，p《0.01；****，p《0.001示出。
[0083]
图6
[0084]
说明了在免疫前(第0天)和在研究的第14和28天用sars-cov-2的s抗原再刺激后，在用根据变体1的冻干形式的所开发的药剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中ifnγ浓度的倍数增加。
different promoters,promoter mutation,and an enhancer on recombinant protein expression in cho cells)》//科学报告-2017.－第8卷.－第10416页]。
[0104]
表达盒seq id no:2包含cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。cag启动子是一种合成启动子，其打开cmv启动子的早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子(鸡β-肌动蛋白和兔β-珠蛋白)。实验表明，与cmv启动子相比，cag启动子的转录活性更高。[yang c.q.,li x.y.,li q.,fu s.l.,li h.,guo z.k.,lin j.t.,zhao s.t.“通过使用体内电穿孔来评价三种不同启动子驱动鸡胚发育过程中的基因表达(evaluation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation)”.《遗传学和分子研究(genet.mol.res.)》-2014.－第13卷.－第1270-1277页]。
[0105]
表达盒seq id no:3包含ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。ef1启动子是人真核翻译延伸因子1α(ef-1α)的启动子。该启动子在广泛的细胞类型中具有组成型活性[pmid:28557288。ef-1α启动子在转染的cho-k1细胞中维持来自附加型载体的高水平转基因表达(the ef-1αpromoter maintains high-level transgene expression episomal vectors in transfected cho-k1 cells)]。ef-1α基因编码延伸因子1α，其是真核细胞中最常见的蛋白之一并且几乎在哺乳动物的所有细胞类型中均有表达。这种ef-1α通常在其中病毒启动子不能表达受控基因的细胞中和在其中病毒启动子逐渐消失的细胞中具有活性。
[0106]
表达盒seq id no:4包含cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
[0107]
选择基于腺病毒的载体系统来有效地将编码sars-cov-2冠状病毒的s蛋白的基因递送到人体中。腺病毒载体提供许多优点：它们不能在人细胞中繁殖，进入分裂和非分裂细胞，能够诱导细胞介导和抗体介导的免疫应答，并提供高水平的靶抗原表达。
[0108]
作者开发了含有两种组分的药剂的变体，它们基于不同的腺病毒血清型。在这种情况下，针对腺病毒的载体部分的免疫应答(其可以在施用所述药剂的第一组分后产生)在将来不被增强并且不影响针对疫苗抗原的抗原特异性免疫应答的产生。
[0109]
此外，所开发的药剂扩展了用于诱导针对sars-cov-2冠状病毒的免疫应答的药剂的医疗设备(armamentarium)，并且这将克服针对一些腺病毒血清型的预先存在的免疫应答在群体的某些部分中存在而产生的困难。
[0110]
因此，这些努力导致了以下药剂变体的开发。
[0111]
1.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；和/或含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0112]
2.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选
自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；或者仅含有组分2。
[0113]
3.用于针对由严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2引起疾病的再接种的药剂，所述药剂含有组分1，其是基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒；并且还含有组分2，其是基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的药剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0114]
实例1
[0115]
含有人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的表达载体的获得。
[0116]
在第1阶段，作者开发了质粒构建体pad26-ends的设计，其携带与人类腺病毒血清型26的基因组同源的两个位点(两个同源臂)和氨苄青霉素抗性基因。一个同源臂是人类腺病毒血清型26的起点(从左侧反向末端重复序列到e1位点)和包括pix蛋白的病毒基因组序列。第二个同源臂含有从е4位点的orf3到基因组的末端的核苷酸序列。pad26-ends构建体由zao“eurogene”(莫斯科)合成。
[0117]
将分离自病毒粒子的人类腺病毒血清型26的dna与pad26-ends构建体混合。pad26-ends与病毒dna之间的同源重组产生质粒pad26-dle1，其携带缺失e1位点的人类腺病毒血清型26的基因组。
[0118]
然后在获得的质粒pad26-dle1中，使用常规的克隆方法将含有开放阅读框6(orf6-ad26)的序列用来自人类腺病毒血清型5的类似序列替换，以使人类腺病毒血清型26能够在细胞培养物hek293中有效复制。这产生了质粒pad26-dle1-orf6-ad5。
[0119]
然后使用常规的基因工程改造方法使构建的质粒pad26-dle1-orf6-ad5中缺失腺病毒基因组的e3位点(piii基因与u-外显子之间约3321b.p.)，以增加载体包装能力。这导致基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的重组载体pad26-only-null含有人类腺病毒血清型5的开放阅读框orf6且缺失基因组的e1和e3位点。seq id no:5用作人类腺病毒血清型26的母体序列。
[0120]
此外，作者开发了表达盒的几种设计：
[0121]-表达盒seq id no:1包含cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
[0122]-表达盒seq id no:2包含cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
[0123]-表达盒seq id no:3包含ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
[0124]
在质粒构建体pad26-ends的基础上，使用基因工程改造方法获得了构建体parms-26-cmv-s-cov2、parms-26-cag-s-cov2、parms-26-ef1-s-cov2，它们分别含有表达盒seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3，并且还带有人类腺病毒血清型26的基因组的同源性臂。接着，在同源臂之间的独特水解位点处将构建体parms-26-cmv-s-cov2、parms-26-cag-s-cov2、parms-26-ef1-s-cov2线性化；将每种质粒与重组载体pad26-only-null进行混合。
同源重组产生质粒pad26-only-cmv-s-cov2、pad26-only-cag-s-cov2、pad26-only-ef1-s-cov2，其携带含有人类腺病毒血清型5的开放阅读框orf6的人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组，且缺失基因组的e1和e3位点，表达盒分别为seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3。
[0125]
在第4阶段，用特异性限制性核酸内切酶对质粒pad26-only-cmv-s-cov2、pad26-only-cag-s-cov2、pad26-only-ef1-s-cov2进行水解以除去载体部分。获得的dna产物用于转染细胞培养物нек293。
[0126]
因此，获得了表达载体，其含有人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0127]
实例2
[0128]
基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组获得表达载体形式的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0129]
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例1中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中或在用于冻干形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒。
[0130]
因此，获得了以下基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代：
[0131]
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(ad26-cmv-s-cov2)。
[0132]
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(ad26-cmv-s-cov2)。
[0133]
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，具有含有cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(ad26-cag-s-cov2)。
[0134]
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，具有含有cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(ad26-cag-s-cov2)。
[0135]
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型26的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且位点orf6-ad26被orf6-ad5取代，具有含有ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:3(ad26-ef1-s-cov2)。
id no:2)、simad25-ef1-s-cov2(含有表达盒seq id no:3)。
[0150]
因此，获得了表达载体，其含有猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且其中整合了选自seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0151]
实例4
[0152]
基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的获得，其中基因组中缺失e1和e3位点，并且其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0153]
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例3中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒，并且在用于冻干形式的药剂的缓冲液中含有腺病毒颗粒。
[0154]
因此，获得了以下基于猿猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点：
[0155]
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(simad25-cmv-s-cov2)。
[0156]
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(simad25-cmv-s-cov2)。
[0157]
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(simad25-cag-s-cov2)。
[0158]
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(simad25-cag-s-cov2)。
[0159]
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:3(simad25-ef1-s-cov2)。
[0160]
6.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于猴腺病毒血清型25的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:3(simad25-ef1-s-cov2)。
[0161]
每种提供的免疫生物制剂都是所开发的药剂的变体1中的组分2和变体3中的组分1。
[0162]
实例5
[0163]
含有人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体的获得。
[0164]
在第1阶段，开发了质粒构建体pad5-ends的设计，其携带与人类腺病毒血清型5的基因组同源的两个位点(两个同源臂)。一个同源臂是人类腺病毒血清型5的起点(从左侧反向末端重复序列到e1位点)和包括病毒基因组的pix蛋白的序列。第二个同源臂含有位于e4位点的orf3之后直至基因组的末端的核苷酸序列。pad5-ends构建体由zao“eurogene”(莫
斯科)合成。
[0165]
将从病毒粒子中分离的人类腺病毒血清型5的dna与pad5-ends构建体混合。pad5-ends与病毒dna之间的同源重组产生质粒pad5-dle1，其携带缺失e1位点的人类腺病毒血清型5的基因组。
[0166]
使用常规的基因工程改造方法使构建的质粒pad5-dle1中缺失腺病毒基因组的e3位点(从基因12.5k的末端到u外显子序列的起始的约2685b.p.)，以增加载体的包装能力。这导致基于人类腺病毒血清型5的基因组的重组质粒载体pad5-too-null，其中基因组中缺失e1和е3。seq id no:7用作人类腺病毒血清型5的母体序列。
[0167]
此外，作者开发了表达盒的几种设计：
[0168]-表达盒seq id no:1包含cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
[0169]-表达盒seq id no:2包含cag启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号；
[0170]-表达盒seq id no:3包含ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号。
[0171]
然后，在质粒构建体pad5-ends的基础上，使用基因工程改造方法获得了构建体parms-ad5-cmv-s-cov2、parms-ad5-cag-s-cov2、parms-ad5-ef1-s-cov2，它们分别含有表达盒seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3，并且还带有人类腺病毒血清型5的基因组的同源性臂。
[0172]
接着，在同源臂之间的独特水解位点处将构建体parms-ad5-cmv-s-cov2、parms-ad5-cag-s-cov2、parms-ad5-ef1-s-cov2线性化，将每种质粒与重组载体pad5-too-null进行混合。同源重组产生质粒pad5-too-cmv-s-cov2、pad5-too-gac-s-cov2、pad5-too-ef1-s-cov2，其分别携带基因组中缺失е1和е3位点的人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组和表达盒seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3。
[0173]
在第4阶段，用特异性限制性核酸内切酶对质粒pad5-too-cmv-s-cov2、pad5-too-gac-s-cov2、pad5-too-ef1-s-cov2进行水解以除去载体部分。获得的dna产物用于转染细胞培养物нек293。所得的材料用于制备量的重组腺病毒的积累。
[0174]
这项工作导致获得了人类腺病毒血清型5，其含有编码sars-cov-2的s蛋白的基因：ad5-cmv-s-cov2(含有表达盒seq id no:1)、ad5-cag-s-cov2(含有表达盒seq id no:2)、ad5-ef1-s-cov2(含有表达盒seq id no:3)。
[0175]
因此，获得了表达载体，其含有人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0176]
实例6
[0177]
基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的获得，其中基因组中缺失e1和e3位点，其中整合了选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3的表达盒。
[0178]
在工作的此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例5中获得的表达载体。所得的悬浮液在用于液体形式的药剂的缓冲液中或在用于冻干形式的药剂的缓冲液中
含有腺病毒颗粒。
[0179]
因此，获得了以下基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点：
[0180]
1.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(ad5-cmv-s-cov2)。
[0181]
2.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:1(ad5-cmv-s-cov2)。
[0182]
3.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(ad5-cag-s-cov2)。
[0183]
4.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:2(ad5-cag-s-cov2)。
[0184]
5.在用于液体形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:3(ad5-ef1-s-cov2)。
[0185]
6.在用于冻干形式的药剂的缓冲液中的基于人类腺病毒血清型5的重组菌株的基因组的免疫生物制剂，其中基因组中缺失e1和e3位点，具有含有ef1启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no:3(ad5-ef1-s-cov2)。
[0186]
每种提供的免疫生物制剂均是所开发的药剂的变体1和变体2中的组分1。
[0187]
每种提供的免疫生物制剂均是所开发的药剂的变体1和变体3中的组分2。
[0188]
实例7
[0189]
缓冲溶液的制备
[0190]
根据要求保护的本发明的开发的药剂包含置于分开的小瓶中的两种组分。每种组分在缓冲溶液中包含基于具有表达盒的重组腺病毒的免疫生物制剂。
[0191]
本发明的作者精心设计了缓冲溶液的组成以确保重组腺病毒颗粒的稳定性。所述溶液包括：
[0192]
1.维持溶液的ph所需的三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
[0193]
2.添加以达到适当的离子强度和渗透压(osmolarity)的氯化钠。
[0194]
3.用作冷冻保护剂的蔗糖。
[0195]
4.需要作为二价阳离子的来源的氯化镁六水合物。
[0196]
5.用作自由基氧化的抑制剂的edta。
[0197]
6.用作表面活性剂的来源的聚山梨醇酯-80。
[0198]
7.用作自由基氧化的抑制剂的乙醇95％。
[0199]
8.用作溶剂的水
……
[0200]
本发明的作者开发了用于液体形式的药剂和用于冻干形式的药剂的缓冲溶液的两种变体。
[0201]
获得了实验组的几个变体，用于确定用于液体形式的药剂的缓冲溶液的组成中的化合物的浓度(表1)。将药剂的组分之一添加到每一种所制备的缓冲溶液中：
[0202]
1.基于重组人类腺病毒血清型26的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0203]
2.基于重组人类腺病毒血清型5的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0204]
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0205]
因此，测试了药剂组合物中的每种腺病毒血清型的稳定性。制备的药物产品在-18℃和-70℃的温度下储存3个月，然后解冻，并评估重组腺病毒滴度的变化。
[0206]
表1—用于液体形式的药剂的实验缓冲溶液的组成
[0207]
表1
[0208][0209]
实验的结果表明，在-18℃和-70℃的温度下，在用于液体形式的药剂的缓冲液中储存3个月后，重组腺病毒的滴度没有变化。
[0210]
因此，所开发的用于液体形式的药剂的缓冲溶液提供了所开发的药剂的所有组分在以下活性成分的范围(重量％)内的稳定性：
[0211]
tris：0.1831重量％至0.3432重量％；
[0212]
氯化钠：0.3313重量％至0.6212重量％；
[0213]
蔗糖：3,7821重量％至7,0915重量％；
[0214]
氯化镁六水合物：0.0154重量％至0.0289重量％；
[0215]
edta：0.0029重量％至0.0054重量％；
[0216]
聚山梨醇酯-80：0.0378重量％至0.0709重量％；
[0217]
乙醇95％：0.0004重量％至0.0007重量％；
[0218]
溶剂：余量。
[0219]
获得了实验组的几个变体，用于确定用于冻干形式的药剂的缓冲溶液的组成中的化合物的浓度(表2)。将药剂的组分之一添加到每一种所制备的缓冲溶液中：
[0220]
1.基于重组人类腺病毒血清型26的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0221]
2.基于重组人类腺病毒血清型5的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0222]
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的免疫生物制剂，具有含有cmv启动子、编码sars-cov-2的s蛋白的基因和腺苷酸化信号的表达盒，1*10
11
个病毒颗粒。
[0223]
因此，测试了药剂组合物中的每种腺病毒血清型的稳定性。制备的药物产品在 2℃和 8℃的温度下储存3个月，然后解冻，并评估重组腺病毒滴度的变化。
[0224]
表2-实验缓冲溶液的组成
[0225]
表2.
[0226][0227][0228]
实验的结果表明，在 2℃和 8℃的温度下，在用于冻干形式的药剂的缓冲液中储存3个月后，重组腺病毒的滴度没有变化。
[0229]
因此，所开发的用于冻干形式的药剂的缓冲溶液提供了所开发的药剂的所有组分在以下活性成分的范围(重量％)内的稳定性：
[0230]
tris：0.0180重量％至0.0338重量％；
[0231]
氯化钠：0.1044重量％至0.1957重量％；
[0232]
蔗糖：5,4688重量％至10.2539重量％；
[0233]
氯化镁六水合物：0.0015重量％至0.0028重量％；
[0234]
edta：0.0003重量％至0.0005重量％；
[0235]
聚山梨醇酯-80：0.0037重量％至0.0070重量％；
[0236]
溶剂：余量。
[0237]
实例8
[0238]
通过评估在接种后不同时间间隔志愿者的血液中针对sars-cov-2病毒的抗原的
细胞介导的免疫应答，研究所开发的药剂的免疫原性。
[0239]
所开发的药剂变体1的临床研究包括对细胞介导的免疫强度的研究。
[0240]
对参与研究的40名志愿者用以下免疫接种:
[0241]
1)液体形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2，组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量1х10
11
个病毒颗粒(20名志愿者)。
[0242]
2)冻干形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2，组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量1х10
11
个病毒颗粒(20名志愿者)。
[0243]
第0天(在药剂施用前)、第14天和第28天，从志愿者中采集血液样品，并以ficcol密度梯度离心，以便分离单核细胞。将分离的细胞用cfse荧光染料(invivogen，сша)染色并加入到板孔中。然后在体外通过向培养基中加入冠状病毒s蛋白(直至最终蛋白浓度为1μg/ml)对淋巴细胞进行再刺激。没有添加抗原的完整细胞被用作阴性对照。加入抗原后72小时，测量增殖细胞的百分比，并且收集培养基用于测量干扰素γ水平。
[0244]
使用针对t细胞标记物分子cd3、cd4、cd8(抗cd3 pe-cy7(bd生物科学(bd biosciences)，克隆sk7)、抗cd4 apc(bd生物科学，克隆sk3)、抗cd8 percp-cy5.5(bd生物科学，克隆sk1))的抗体对细胞进行染色，以评估增殖细胞的百分比。使用流式细胞荧光计bd facs ariaiii(bd生物科学，美国)来鉴定细胞混合物中增殖的(携带少量cfse染料)cd4 和cd8 t细胞。从用冠状病毒抗原s再刺激的细胞的分析获得的结果中减去从完整细胞的分析获得的结果，以便测定每个样品中增殖细胞的所得的百分比。最终结果在图1、2(用于液体形式的疫苗)和图3、4(用于冻干形式的疫苗)中示出。
[0245]
按照制造商的说明，使用干扰素γeia-best药剂盒(vector best，俄罗斯)在用冠状病毒s蛋白再刺激后72小时内测量人血单核细胞的培养基中干扰素γ(ifnγ))的浓度。结果在图5(用于液体形式的疫苗)和图6(用于冻干形式的疫苗)中示出。
[0246]
研究结果显示，通过使用两种形式的药剂变体1对志愿者进行连续免疫诱导的细胞介导的免疫强度随着免疫后经过的时间而增加，如通过增殖的cd4 t细胞和cd8 t细胞的中位百分比所证明。在两组中，在免疫后第28天观察到增殖的cd4 t细胞和cd8 t细胞的最大值。在第0天与第28天之间观察到增殖的cd4 t细胞和cd8 t细胞的百分比的最大统计显著差异(p《0.001)。
[0247]
从图5、6所示的结果可以得出结论，基于ifnγ浓度的中位增量，通过用两种形式的药剂变体1对志愿者进行连续免疫引起的细胞介导的免疫强度的增长在免疫后的天数越多越明显。免疫前水平(第0天)和接种后第14天之间的ifnγ浓度增量的统计学显著差异为p《0.001。在免疫后第28天观察到ifnγ浓度的最大增量。在研究的第0天与第28天之间观察到ifnγ浓度增量的最大统计学显著差异(p《0.001)。
[0248]
因此，基于上述数据，可以得出结论，用所开发的药剂进行免疫诱导抗感染免疫的强抗原特异性细胞介导的组分，这得到了在免疫之前和之后测量的参数的高统计学意义的支持。
[0249]
实例9
[0250]
通过评估接种后不同时间间隔志愿者的血液中针对sars-cov-2抗原的抗体的滴度，研究所开发的药剂的免疫原性。
[0251]
对参与研究的40名志愿者用以下免疫接种:
[0252]
1)液体形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2，组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量1х10
11
个病毒颗粒(20名志愿者)。
[0253]
2)冻干形式的所开发的药剂，变体1：组分1，然后在21天内加入组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2，组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量1х10
11
个病毒颗粒(20名志愿者)。
[0254]
在第14天、第21天和第28天，收集血液样品，然后进行血清分离。
[0255]
按照制造商的说明，使用药剂盒sars-cov-2-rbd-eia-gamaleya测量针对sars-cov-2s蛋白的rbd的抗体的滴度。
[0256]
在图7中示出了在施用液体形式的药剂后，在志愿者的血清中针对sars-cov-2抗原的抗体滴度的测定结果。
[0257]
在图8中示出了在施用冻干形式的药剂后，在志愿者的血清中针对sars-cov-2抗原的抗体滴度的测定结果。
[0258]
如从呈现的数据中显而易见的，使用液体形式和冻干形式的所开发的药剂对志愿者进行免疫能够产生强的(在统计学上，与在未免疫的动物的对照组中获得的值显著不同)抗体介导的免疫，其特征在于针对sars-cov-2的s蛋白的抗体水平增加。观察到免疫后抗体介导的免疫应答的强度随着时间的增加而增加。
[0259]
实例10
[0260]
所开发的药剂用于在使用模型亚单位疫苗免疫后延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0261]
本研究的目的是评估所开发的药剂在用模型亚单位疫苗免疫的动物的再接种中的潜在用途。
[0262]
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠balb/c。在第1阶段，用含有sars-cov-2的s蛋白(10μg/小鼠)的模型疫苗在含氢氧化铝的磷酸盐缓冲液(100μg/小鼠)中对动物进行免疫。以21天的给药间隔施用两次剂量的疫苗。在第180天，用所开发的药剂的多种变体对动物进行再免疫。在双组分药剂的情况下：第一组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
[0263]
1)模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0264]
2)模型疫苗/ad26-cag-s-cov2/ad5-cag-s-cov2
[0265]
3)模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2/ad5-ef1-s-cov2
[0266]
4)模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0267]
5)模型疫苗/ad26-cag-s-cov2/simad25-cag-s-cov2
[0268]
6)模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2/simad25-ef1-s-cov2
[0269]
7)模型疫苗/simad25-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0270]
8)模型疫苗/simad25-cag-s-cov2/ad5-cag-s-cov2
[0271]
9)模型疫苗/simad25-ef1-s-cov2/ad5-ef1-s-cov2
[0272]
10)模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2
[0273]
11)模型疫苗/ad26-cag-s-cov2
[0274]
12)模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2
[0275]
13)模型疫苗/ad5-cmv-s-cov2
[0276]
14)模型疫苗/ad5-cag-s-cov2
[0277]
15)模型疫苗/ad5-ef1-s-cov2
[0278]
16)模型疫苗/simad25-cmv-s-cov2
[0279]
17)模型疫苗/simad25-cag-s-cov2
[0280]
18)模型疫苗/simad25-ef1-s-cov2
[0281]
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(eia)来确定抗sars-cov-2抗体的滴度:
[0282]
1)将抗原在 4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
[0283]
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μl/孔的量加入到每个孔中。将板在 37℃的摇床上孵育1小时。
[0284]
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
[0285]
4)将50μl的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
[0286]
5)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0287]
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0288]
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠igg抗体。
[0289]
8)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0290]
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0291]
10)然后加入四甲基联苯胺(tmb)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(od)。
[0292]
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表3中示出。
[0293]
表3
–
鼠血清中抗s蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
[0294]
表3
[0295][0296]
所呈现的数据证明了在使用模型灭活疫苗免疫后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0297]
实例11
[0298]
所开发的药剂用于在使用模型灭活疫苗免疫后延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0299]
本研究的目的是评估所开发的药剂在用模型灭活疫苗免疫的动物的再接种中的潜在用途。
[0300]
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠balb/c。在第1阶段，用含有福尔马林灭活的sars-cov-2病毒的模型疫苗免疫动物。以21天的给药间隔施用两次剂量的疫苗。在第180天，用所开发的药剂的多种变体对动物进行再免疫。在双组分药剂的情况下：第一组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
[0301]
1.模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0302]
2.模型疫苗/ad26-cag-s-cov2/ad5-cag-s-cov2
[0303]
3.模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2/ad5-ef1-s-cov2
[0304]
4.模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0305]
5.模型疫苗/ad26-cag-s-cov2/simad25-cag-s-cov2
[0306]
6.模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2/simad25-ef1-s-cov2
[0307]
7.模型疫苗/simad25-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0308]
8.模型疫苗/simad25-cag-s-cov2/ad5-cag-s-cov2
[0309]
9.模型疫苗/simad25-ef1-s-cov2/ad5-ef1-s-cov2
[0310]
10.模型疫苗/ad26-cmv-s-cov2
[0311]
11.模型疫苗/ad26-cag-s-cov2
[0312]
12.模型疫苗/ad26-ef1-s-cov2
[0313]
13.模型疫苗/ad5-cmv-s-cov2
[0314]
14.模型疫苗/ad5-cag-s-cov2
[0315]
15.模型疫苗/ad5-ef1-s-cov2
[0316]
16.模型疫苗/simad25-cmv-s-cov2
[0317]
17.模型疫苗/simad25-cag-s-cov2
[0318]
18.模型疫苗/simad25-ef1-s-cov2
[0319]
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(eia)来确定抗sars-cov-2抗体的滴度:
[0320]
1)将抗原在 4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
[0321]
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μl/孔的量加入到每个孔中。将板在 37℃的摇床上孵育1小时。
[0322]
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
[0323]
4)将50μl的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
[0324]
5)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0325]
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0326]
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠igg抗体。
[0327]
8)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0328]
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0329]
10)然后加入四甲基联苯胺(tmb)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(od)。
[0330]
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表4中示出。
[0331]
表4
–
鼠血清中抗s蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
[0332]
表4
[0333][0334][0335]
所呈现的数据证明了在使用模型灭活疫苗免疫后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0336]
实例12
[0337]
所开发的药剂用于在使用所开发的药剂的多种变体免疫后延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0338]
本研究的目的是评估所开发的药剂在用所开发的药剂的多种变体免疫的动物的再接种中的潜在用途。
[0339]
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠balb/c。在第1阶段，用所开发的药剂的多种单组分变体(10
10
个病毒颗粒/小鼠)免疫动物。在第180天，用所开发的药剂的多种双组分变体对动物进行再免疫。(10
10
个病毒颗粒/小鼠)。第一组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在实验的第180天施用，第二组分(10
10
个病毒颗粒/小鼠)在第201天施用。在单组分药剂的情况下，在实验的第201天进行免疫接种。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
[0340]
1)ad26-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0341]
2)ad26-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2
[0342]
3)ad26-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0343]
4)ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0344]
5)ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2
[0345]
6)ad5-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0346]
7)simad25-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0347]
8)simad25-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2
[0348]
9)simad25-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0349]
10)ad26-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0350]
11)ad26-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0351]
12)ad26-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0352]
13)ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0353]
14)ad5-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0354]
15)ad5-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0355]
16)simad25-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0356]
17)simad25-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0357]
18)simad25-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0358]
在实验的第21天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(eia)来确定抗sars-cov-2抗体的滴度:
[0359]
1)将抗原在 4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
[0360]
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μl/孔的量加入到每个孔中。将板在 37℃的摇床上孵育1小时。
[0361]
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
[0362]
4)将50μl的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
[0363]
5)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0364]
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0365]
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠igg抗体。
[0366]
8)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0367]
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0368]
10)然后加入四甲基联苯胺(tmb)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(od)。
[0369]
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表5中示出。
[0370]
表5
–
鼠血清中抗s蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
[0371]
表5
[0372][0373][0374]
所呈现的数据证明在使用所开发的药剂的单组分变体免疫小鼠后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0375]
实例13
[0376]
所开发的药剂用于在使用所开发的药剂的多种变体免疫后延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0377]
本研究的目的是评估所开发的药剂在用所开发的药剂的多种变体免疫的动物的再接种中的潜在用途。
[0378]
在这一实验中，使用体重为18g的雌性小鼠balb/c。在第1阶段，用所开发的双组分药剂的变体(10
10
个病毒颗粒/小鼠)以21天间隔免疫动物。在第180天，用所开发的药剂的多种单组分变体对动物进行再免疫。因此，研究了下列实验组和对照组动物:
[0379]
1)ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0380]
2)ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0381]
3)ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0382]
4)ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0383]
5)ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0384]
6)ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0385]
7)simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2
[0386]
8)simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad5-cmv-s-cov2
[0387]
9)simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2
[0388]
10)ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0389]
11)ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2
[0390]
12)simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/simad25-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2
[0391]
13)ad26-cmv-s-cov2,ad5-cmv-s-cov2/ad26-cmv-s-cov2,simad25-cmv-s-cov2
[0392]
在实验的第42天、第180天和第222天，从尾静脉收集血液，然后进行血清分离。按照以下方案，通过酶免疫测定(eia)来确定抗sars-cov-2抗体的滴度:
[0393]
1)将抗原在 4℃的温度下吸附在96孔微量滴定板的孔上持续16小时。
[0394]
2)为了排除非特异性结合，用封闭缓冲液“锁定”板，封闭缓冲液以100μl/孔的量加入到每个孔中。将板在 37℃的摇床上孵育1小时。
[0395]
3)将免疫小鼠的血清稀释100倍，然后制备一系列2倍稀释液。
[0396]
4)将50μl的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
[0397]
5)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0398]
6)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0399]
7)然后加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗小鼠igg抗体。
[0400]
8)然后将板在 37℃下孵育1小时。
[0401]
9)在孵育结束后，用三份磷酸盐缓冲液洗涤孔。
[0402]
10)然后加入四甲基联苯胺(tmb)溶液，其为辣根底物并在反应过程中变成有色化合物。在15分钟内，加入硫酸以停止反应。然后使用分光光度计在波长450nm下测量每孔中溶液的光密度(od)。
[0403]
抗体滴度被确定为显示溶液光密度显著大于阴性对照组的最高稀释度。结果(几何平均值)在表6中示出。
[0404]
表6
–
鼠血清中抗s蛋白抗体的滴度(几何平均抗体滴度)。
[0405]
表6
[0406]
[0407][0408]
所呈现的数据证明在使用所开发的药剂的双组分变体免疫小鼠后在所有动物体内抗体的产生；到免疫后第180天，抗体滴度降低，然而用所开发的药剂的多种变体对动物进行再接种导致血液抗体滴度的多倍增加。因此，实验数据支持了所开发的药剂用于延长针对sars-cov-2的疫苗接种后免疫的用途。
[0409]
因此，如所呈现的实例所支持的那样，解决了所指定的技术问题，具体地，提供针对sars-cov-2病毒的疫苗接种后免疫的延长的药剂的产生。
[0410]
工业用途
[0411]
所有呈现的实例均支持这些药剂的功效，这些药剂提供了免疫应答的有效诱导，并延长针对sars-cov-2病毒的疫苗接种后免疫和工业用途。