肝衰竭的治疗的制作方法

1.本发明源于意外的发现，即干细胞动员剂如g-csf通过加重炎症和组织损伤对肝衰竭，如急性肝衰竭(alf)或慢加急性肝衰竭(aclf)，具有不利作用，但干细胞动员剂与tlr4拮抗剂的组合通过预防炎症驱动的组织损伤以及促进干细胞相关的促再生特性而协同作用。
2.本发明利用这些发现来提供可以用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的干细胞动员剂(如g-csf)和tlr4拮抗剂。
3.本发明还包括提供用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的干细胞和tlr4的拮抗剂。


背景技术：

4.急性失代偿事件((ad)，单独的细菌感染、大量腹水、胃肠道出血或肝性脑病，或它们的组合)是肝硬化肝病最常见的临床表现，并且在大多数情况下可以被成功控制。然而，30％的患者出现或发展为快速进展的肝衰竭和/或肝外器官衰竭，这种情况被称为慢加急性肝衰竭(aclf)。这些患者中约有40％进展为多器官衰竭并死亡。目前尚无针对aclf的特异性治疗(1)。
5.慢加急性肝衰竭(aclf)影响约三分之一因肝硬化并发症住院的患者。aclf是通过使用慢性肝衰竭(clif)联合标准来诊断的，该标准根据器官衰竭的数量将aclf严重程度细分为1级、2级和3级。clif联合慢加急性肝衰竭(clif-c aclf)评分在预测该群体中的死亡方面优于传统评分，如child-pugh评分或meld评分(2)。
6.aclf的病理生物学表征为免疫病理特征，包括作为器官衰竭的主要驱动因素的同时活跃的两种相反的机制。第一种是由tlr4受体通路介导的病原体相关分子模式(pamp)和细胞死亡分子(损伤相关的分子模式(damp))引发的全身性和肝脏炎症。pamp源于肠源性细菌和细菌产物(如脂多糖-lps)经门静脉到肝脏的迁移，通过免疫细胞上的toll样4(tlr4)依赖性经典炎症小体以及肝细胞中tlr4非依赖性非经典炎症小体来促进促炎症反应(3)。tlr4拮抗剂已被证明在诸如aclf的病症的治疗中是有效的(wo2011gb01227)(4)。第二种是长期的器官损伤、免疫细胞瘫痪以及再生失败，促使长期的器官功能障碍和继发感染，最终形成恶性循环，导致多器官衰竭和死亡。已知干细胞和其他调节性免疫细胞能调节免疫激活，从而调节炎症反应并支持组织修复能力(5)。粒细胞集落刺激因子(g-csf)动员干细胞和免疫细胞，被认为具有免疫调节和促进再生的特性。来自印度的一项单中心研究的数据显示了g-csf对aclf患者的作用，将60天后的生存率从30％提高到了70％(6)。来自其他亚洲中心的相似数据证实了该临床作用，但同样只包括了少量患者(7，8)。这些结果无法在更严格执行的欧洲试验中得到证实(9，10)。结果中的差异被认为是由于不平衡的随机化、亚洲试验中包括的患者的不良临床分类以及可能的ⅰ型统计误差。这种差异为德国一项大型多中心研究-graft试验建立了框架，该研究是由德国研究基金会(dfg)支持的。graft试验(nct02669680)根据欧洲clif标准招募了163名aclf患者，并进行了有计划的中期分析。数
据清楚地显示，g-csf对aclf患者的死亡率没有影响，并且可能对某些患者的亚组不利，例如根据apasl标准的aclf患者和酒精性肝炎患者(11)。


技术实现要素：

7.本发明是基于抑制tlr4能防止g-csf介导的死亡并促进g-csf依赖性肝组织修复能力的发现。因此，本发明利用干细胞动员剂如g-csf和toll样受体4拮抗剂的组合来治疗和预防肝脏疾病如alf或aclf以及与肝脏疾病相关的症状和病症。协同作用由增强的肝细胞增殖和减轻的肝损伤组成。
8.因此，本发明提供了：
9.一种干细胞动员剂和一种tlr4拮抗剂，用于在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭的方法中。
10.本发明还提供了：
11.一种在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭的方法，所述方法包括向所述个体施用干细胞动员剂和tlr4拮抗剂的步骤；
12.一种干细胞动员剂，用于在有需要的个体中治疗或预防的肝衰竭的方法中，其中所述方法包括向所述个体额外施用tlr4拮抗剂。
13.本发明还提供了：
14.一种tlr4拮抗剂，用于在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭的方法中，其中所述方法还包括向所述有需要的个体施用干细胞；
15.一种在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭的方法，所述方法包括向所述个体施用干细胞和tlr4拮抗剂；
16.一种干细胞，用于在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭的方法中，其中所述方法包括向所述个体额外施用tlr4拮抗剂。
17.本发明提供了干细胞动员剂和tlr-4拮抗剂的组合，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。本发明提供了一种包括含干细胞动员剂和tlr-4拮抗剂的组合物，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。本发明提供了一种治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法，其中所述方法包括施用干细胞动员剂和tlr4拮抗剂。
18.本发明提供了一种干细胞动员剂，用于在个体中治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中，其中所述方法还包括向所述个体施用tlr4拮抗剂。
19.本发明提供了一种tlr4拮抗剂，用于在个体中治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中，其中所述方法还包括向所述个体施用干细胞动员剂。
20.在优选实施方案中，所述干细胞动员剂是g-csf。
21.在优选实施方案中，所述肝衰竭是aclf。
22.特别地，本发明提供了g-csf和tlr-4拮抗剂，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。本发明提供了g-csf和tlr-4拮抗剂
的组合，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。
23.类似地，本发明提供了g-csf和tlr-4拮抗剂在制备用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf或治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的药物中的用途。
24.类似地，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的方法，所述方法包括向所述个体施用g-csf和tlr-4拮抗剂的步骤。
25.类似地，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的方法，所述方法包括向所述个体施用tlr-4拮抗剂的步骤，其中也将g-csf施用给所述患者。
26.发明人已经证明了tlr4拮抗剂能抑制炎症和器官损伤，并减轻肝脏炎症，从而允许肝干细胞的移植。因此，本发明还设想了干细胞和tlr-4拮抗剂的组合，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的方法中或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。本发明提供了一种包含干细胞和tlr-4拮抗剂的组合物，用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的方法中或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。本发明提供了治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的方法或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法，其中所述方法包括施用干细胞和tlr4拮抗剂。
27.本发明提供了一种干细胞，用于治疗或预防个体的肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中，其中所述方法还包括向所述个体施用tlr4拮抗剂。
28.本发明提供了一种tlr4拮抗剂，用于治疗或预防个体的肝衰竭如alf或aclf或用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中，其中所述方法还包括向所述个体施用干细胞。
29.在优选实施方案中，所述干细胞是人类干细胞。
30.在优选实施方案中，所述干细胞是肝干细胞。
31.在优选实施方案中，所述肝衰竭是aclf。
32.待治疗的个体可能患有肝硬化，如酒精性肝硬化。待治疗的个体可能患有肝衰竭。待治疗的个体可能患有扑热息痛过量。所述个体可能患有肝肾综合征(hrs)。与未患肝病的受试者相比，所述个体可能患有以下一种或多种或处于罹患以下一种或多种的风险中：肾功能障碍；肾衰竭；hrs；脑功能障碍和脑肿胀；血浆肌酐升高；血浆氨升高；肝酶浓度升高；肝和/或肾和/或脑和/或血液循环中的炎症、损伤或功能障碍增加；肝衰竭导致的肝组织损伤；急性肝衰竭，酒精性肝炎，和/或肝脏再灌注损伤。在优选实施方案中，所述个体患有aclf。在优选实施方案中，所述个体患有alf。在优选实施方案中，所述个体患有酒精性肝炎(ah)。在优选实施方案中，所述个体患有非酒精性脂肪性肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)。患有ah、nafld或nash的个体也可能患有aclf。
33.根据本发明使用的tlr4拮抗剂可导致：(a)所述个体的肝和/或肾和/或脑中的tlr4表达降低；和/或(b)所述个体的肝和/或肾和/或脑中的tlr4水平降低；和/或(c)所述个体的肝和/或肾和/或脑中的tlr4活性降低。这将导致炎症减轻和促炎细胞因子的产生减少，以及器官如肝和/或肾和/或脑的功能障碍减少，和/或(d)所述个体的尿液中的tlr4水平降低。
附图说明
34.图1-g-csf增加了患有aclf的啮齿动物的死亡率
35.a)用四氯化碳(ccl4)对c57b/6小鼠进行6周的灌胃(n＝6)，以诱导慢性肝损伤。随后注射lps(克雷伯氏菌属(klebsiella)，4mg/kg，腹腔注射)作为第二次攻击以诱导器官损伤。使用重组鼠g-csf(250μg/kg，皮下注射)连续5天处理小鼠。b)在所有经g-csf处理的动物中，总共有50％在lps注射后48小时内死亡，而剩下的所有动物在整个治疗期内存活。c)在这个aclf小鼠模型中，5天的g-csf处理有在肝脏中促纤维化作用(天狼猩红)。同样，g-csf处理在5天后维持了巨噬细胞浸润(f4/80 )。ccl4-四氯化碳；g-csf-粒细胞集落刺激因子。
36.数据显示，在ccl4 lps模型中，g-csf增加了死亡率、肝纤维化和炎症细胞浸润。
37.图2-在肝纤维化中通过tlr4上调的器官对内毒素的敏化作用
38.a)alf和aclf大鼠模型的肝组织中的tlr4表达(免疫组化)(10
×
放大，(每组n＝4))。对照动物的肝组织显示出低tlr4表达(a1，a5)。一旦bdl诱导了慢性损伤，肝细胞中有明显的tlr4上调，而再生区不表达tlr4(a2)。lps注射没有显著改变这一模式(a3)。使用重组碱性磷酸酶(recap，一种去磷酸化和灭活lps的药物)(1000u/kg，腹腔注射)预处理超过4天，减少了肝细胞中的tlr4表达(a4)。在alf模型中，单独用galn或galn与lps一起(a6，a7)或用recap预处理均不改变tlr4表达(a8)。b)肝组织的tunel染色(细胞死亡)证实，慢性肝损伤可能通过tlr4上调与器官对内毒素的敏化作用相关，因为在bdl后的lps注射会导致细胞死亡区域扩大(7)，而在肝脏未经处理的动物中，相同的lps剂量只显示出低程度的细胞死亡(3)。lps作用可以通过recap预处理来逆转(8)。c)g-csf治疗后，tlr4 肝浸润cd45 细胞增加。d)使用tlr4抑制剂(tak-242)(10mg/kg，腹腔注射)可以提供证据，表明与慢性肝损伤相关的器官敏化作用是通过tlr4介导的。在bdl后的lps注射前和lps注射后的tak-242注射显著降低了肝脏损伤，如肝细胞死亡(tunel)和alt水平所示。
39.图3-tlr4拮抗剂预防g-csf相关的死亡并改善肝损伤
40.a)用ccl4对c57b/6小鼠进行6周的灌胃(n＝4-10)，以诱导慢性肝损伤。随后注射lps(克雷伯氏菌属，4mg/kg，腹腔注射)作为第二次攻击以诱导器官损伤。使用重组鼠g-csf(250μg/kg，皮下注射) /-tak-242(10mg/kg，腹腔注射)处理小鼠两次，24小时。b)ccl4灌胃后，动物中的lps注射 /-g-csf导致alt水平和细胞死亡(tunel)的显著增加，这可通过加入tak-242来阻止。c)通过向g-csf中添加tak-242，肝浸润巨噬细胞(f4/80 )和嗜中性粒细胞(ly6g )明显减少。d)向g-csf中添加tak-242将48小时后的动物存活率从50％提高到100％。
41.图4-g-csf和tak-242在aclf中的协同促再生作用
42.a)用ccl4对c57b/6小鼠进行6周的灌胃(n＝10)，以诱导慢性肝损伤。随后注射lps(克雷伯氏菌属，4mg/kg，腹腔注射)作为第二次攻击以诱导器官损伤。使用重组鼠g-csf(250μg/kg，皮下注射) /-tak-242(10mg/kg，腹腔注射)处理小鼠24小时或5天。b)cdkn2a(p16)是细胞周期阻滞(衰老)的重要标志物，其mrna水平在lps注射后上调，但在使用g-csf、tak-242、以及联合疗法后，其mrna水平依次逐步降低。如白色阴影区域所突出的，在ccl4动物中注射lps导致肝细胞的损伤，其被trp53(p53)阳性(衰老)肝细胞所包围。单独的g-csf不能减少器官损伤(白色阴影区域)，但在数量上减少了p53阳性肝细胞的数量。使用
g-csf /-tak-242处理5天后，衰老肝细胞的数量显著下降。c)细胞周期蛋白a是细胞周期进展(增殖)的标志物。该蛋白主要调控从g2期向m期的转变。在对照动物中，增殖肝细胞(白色箭头)的数量低。在ccl4灌胃后和随后的lps注射后，尽管增殖免疫细胞的数量增加，但细胞周期蛋白a阳性的肝细胞没有增加。在有tak-242或无tak-242的情况下，使用g-csf处理超过5天显著增加了增殖肝细胞的数量，而使用tak-242单一处理的细胞没有增殖。d)肝细胞因子表达(mrna)(il6，tnfa)在aclf和使用g-csf的单一处理中增加，但可以被tak242减少。因此，所述联合疗法能显著减轻肝脏炎症。e)bcl2是stat3通路的效应分子，具有抗凋亡和抗菌特性。所述联合治疗增加了肝脏中bcl2表达(蛋白印迹)。f)tak-242和g-csf的联合疗法激活了stat3通路，同时增加了抗凋亡bcl2的表达(来自每组所有动物的混合肝裂解物)。使用image j进行图像量化，采用单向anova和事后tukey多重比较进行组间比较。mrna数据被描述为ddct值。使用来自每组所有动物的混合蛋白裂解物进行蛋白质印迹。g)炎症、细胞死亡和再生/衰老的标志物的肝蛋白表达(ccl4-lps 24小时处理模型)。将来自每组随机选择的4只动物的肝裂解物混合并涂到一个分析仪膜上。
43.使用imagej测量密度，并将值描述为平均像素密度。样本混合后，无法进行统计比较。h)肝脏asma表达(ccl4-lps 24小时处理模型)对肝脏切片进行作为星状细胞激活的标志物的asma染色(每组n＝4)。当与g-csf联用时，lps使ccl4动物中asma阳性面积从1.4％
±
0.6增加到8.6％
±
1.9(p＜0.001)和9％
±
4.1(p＜0.001)。向g-csf中添加tak-242显著减少了星状细胞的激活(与ccl4 lps g-csf相比，asma阳性面积为3.3％
±
1，p＜0.001)。使用image j进行图像量化，采用单向anova和事后tukey多重比较进行组间比较。i)g-csf刺激后的thp1对lps的响应。thp1被pma激活为巨噬细胞样表型，并用lps(10ng/ml)
±
g-csf(100ng/ml)进行刺激(2批，2次重复)。在两组中使用tak-242 200nm进行处理。lps孵育3小时后提取rna以测量细胞因子反应。lps可诱导thp1单核细胞中il-6mrna的表达上调60.2倍，巨噬细胞中il-6mrna表达上调6.2倍，这可通过与g-csf预孵育而增强(单核细胞中上调了71倍，巨噬细胞中上调了6.7倍)。与未受刺激的细胞相比，tak-242将单核细胞中的il-6mrna的表达减少5.1倍，将巨噬细胞中的il-6mrna的表达减少2.8倍，具有类似的生物学意义。lps孵育在单核细胞中使il-1b的表达增加了1.8倍，而在巨噬细胞中使il-1b的表达减少了0.8倍。与未受刺激的细胞相比，g-csf使il-1b的表达增加了2.5倍，而在巨噬细胞中il-1b的表达保持不变(与未受刺激的细胞相比，1.1倍)。tak-242降低了两个细胞系中的il-1b反应(与未受刺激的细胞相比，单核细胞中降低了1.3倍，巨噬细胞中降低了0.7倍)。j)ccl4后的g-csf的增殖作用。为证实g-csf在无lps驱动的炎症环境中表现出了促增殖作用，在ccl4施用后使用g-csf进行处理。用0.5ml/ml四氯化碳(ccl4)对c57b/6小鼠进行6周的灌胃，以诱导慢性肝损伤。在先前没有施用lps的情况下，每天注射1次g-csf(250μg/kg，皮下注射)，持续5天。将结果与施用lps的组进行比较。g-csf处理将表达细胞周期蛋白a2的肝细胞从在ccl4 lps g-csf处理的动物中的1.4％
±
0.7增加到了在ccl4 g-csf处理的动物中的2.1％
±
1.3(p＜0.05)。作为肝细胞分裂标志物的ki67表达从ccl4 lps g-csf处理后的0.6％
±
0.2增加到了ccl4 g-csf处理后的4.1％
±
2.9(p＜0.001)。使用image j进行图像量化，采用单向anova和事后tukey多重比较进行组间比较。
44.图5-半乳糖胺(galn)在新开发的aclf小鼠模型中诱导非炎症二次攻击。g-csf tak-242对肝损伤的作用。
45.a)为了证实g-csf会加重aclf中的炎症反应，并在非炎症环境下诱导积极的治疗效果，我们开发了一个可替代的非炎症aclf模型。使用ccl4对c57b/6小鼠进行6周的灌胃(n＝8)，以诱导慢性肝损伤。随后注射半乳糖胺(galn)(1000mg/kg，腹腔注射)作为主要的非炎症二次攻击以诱导肝损伤。使用重组鼠g-csf(250mg/kg，皮下注射) /-tak-242(10mg/kg，腹腔注射)中的任何一种处理小鼠48小时。b)tunel染色和alt水平显示了galn注射与明显的肝损伤相关。由g-csf和tak-242组成的联合疗法消除了肝损伤，并在减少细胞死亡(tunel)方面优于使用任何一种剂的单独处理。
46.图6-肝组织中坏死性肝细胞的死亡。
47.ccl4-galn模型表征为坏死性细胞的死亡。注射galn后，细胞表达ripk3(一种程序性坏死(necroptosis)介质)，而半胱氨酸蛋白酶3/7(一种凋亡细胞死亡介质)的酶活性保持不变。使用g-csf tak-242处理显著减少了肝ripk3表达。
48.图7-肝组织的bcl2表达(stat3通路)。
49.使用tak-242和g-csf联合治疗aclf增加了抗凋亡bcl2在肝脏中的表达。
50.图8-tak-242/g-csf在非炎症aclf模型中的作用。
51.galn诱导了再生反应，包括增殖的肝细胞[ki67：ccl4 0.1％
±
0.1vs.ccl4 galn 2％
±
1.7，(p＜0.01)，细胞周期蛋白a2：ccl4 0.1％
±
0.2vs.ccl4 galn 1.9％
±
1.6，(p＜0.05)]，还有处于细胞周期停滞的肝细胞[p21：ccl4 0.5％
±
0.2vs.ccl4 galn 6.4％
±
4.7，p＜0.01]。单独的g-csf或与tak-242的联合减少了细胞死亡和随后的再生反应。单独的tak-242维持增殖的(细胞周期蛋白a2，ki67)和衰老的(p21)肝细胞的数量[ki67 ccl4 galn tak-242 3％
±
2.1vs.ccl4 galn tak-242 g-csf 1.2％
±
1.4(p＜0.05)；细胞周期蛋白a2 ccl4 galn tak-242 1.9％
±
1.6vs.ccl4 galn tak-242 g-csf 0.3％
±
0.2(p＜0.001)；p21 ccl4 galn tak-242 7.1％
±
4.5vs.ccl4 galn tak-242 g-csf 1.7％
±
2.3(p《0.001)]。
[0052]
使用image j进行图像量化，采用单向anova和事后tukey多重比较进行组间比较。mrna数据被描述为ddct值，2倍以上的表达变化被认为是生物学上显著的。使用来自每组所有动物的混合蛋白裂解物进行蛋白质印迹。
[0053]
图9-ripa56对肝细胞死亡的预防阻止了ccl4 galn后的增殖反应。
[0054]
使用0.5ml/ml的四氯化碳(ccl4)对c57b/6小鼠进行6周的灌胃，以诱导慢性肝损伤(每组n＝8)。此后，施用半乳糖胺(galn)(1000mg/kg)以诱导非炎性肝损伤，使用ripk1抑制剂(ripa56，3mg/kg，腹腔注射)进行处理，每12小时一次。ripa56处理减少了galn诱导的细胞死亡(tunel p《0.001(n＝4)以及ripk3表达p《0.001(n＝3)，与ccl4 galn相比)。与ccl4 galn相比，肝损伤的减轻与肝细胞增殖的减少相关(ki67(n＝3)：2％
±
1.7vs.0.2％
±
0.2，p《0.001；细胞周期蛋白a2(n＝3)：1.9％
±
1.6vs.0.03％
±
0.1，p《0.001)。
[0055]
使用image j进行图像量化，采用单向anova和事后tukey多重比较进行组间比较。
[0056]
图10-再生与肝细胞死亡的比率
[0057]
计算肝细胞增殖标志物(细胞周期蛋白a2，ki67)与肝细胞死亡(tunel染色)之间的比率。增加的比率决定了与肝损伤的程度相关的增强的再生反应，反之亦然。尽管高度肝损伤，lps注射(有g-csf或无g-csf)导致了肝细胞增殖的完全终止(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4，0.42vs.ccl4 lps，0.02vs.ccl4 lps g-csf，0.04)。与此相反，galn注射后肝细
胞增殖得以保持(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 galn 0.54)。在两种短期模型中，使用tak-242的处理增强了肝细胞再生(lps 24小时处理，galn 48小时处理)(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 lps tak-242，1.4；ccl4 galn tak-242，0.9)。在处理5天后，g-csf能在长期lps模型中展现其促再生特性(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 lps tak-242 g-csf，1.7)。
具体实施方式
[0058]
应当理解，所公开的方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行调整。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述本发明的具体实施方案的目的，而不旨在进行限制。
[0059]
此外，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“所述”包括对复数个的引用，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“拮抗剂”包括“多种拮抗剂”，提及“抗体”包括两个或更多这样的抗体，诸如此类。
[0060]
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文或是下文，其全部内容均通过引用并入本文。
[0061]
发明人意外地发现，可以通过使用干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂的组合来治疗aclf。
[0062]
本发明还包括干细胞和tlr4拮抗剂的组合在治疗肝病，如alf和aclf中的用途。
[0063]
干细胞
[0064]
干细胞有能力响应适当信号而分化成多种细胞类型。这些特性为干细胞提供了组织修复、替换和再生的能力。因此，人类干细胞，尤其是人类胚胎干细胞(hesc)在医学研究中令人特别感兴趣。胚胎干细胞具有比成体干细胞分化成更多细胞类型的能力，因此在治疗方面具有很大的潜力。分化是由体内多种因素引发的，其中一些可以在体外干细胞培养中复制。诱导多能干细胞(ipsc)是干细胞的一种形式，经常用于自体治疗，因为这些细胞可以从将接受移植的同一患者的组织中产生，从而避免免疫排斥。以这种方式获得的ipsc没有来自胚胎的干细胞的伦理考虑。在本发明的一个实施方案中，所使用的干细胞是自体的，因此来源于待治疗的个体。在本发明的一个实施方案中，所使用的干细胞是异源的，因此不是来源于待治疗的个体。在优选实施方案中，所使用的干细胞是人类干细胞。在优选实施方案中，所使用的干细胞是肝干细胞。在优选实施方案中，所使用的干细胞是人肝干细胞。
[0065]
干细胞动员剂
[0066]
已知干细胞和其他调节性免疫细胞可调节免疫激活从而调节炎症反应并支持组织修复能力(5)。干细胞动员剂是刺激干细胞增殖并从骨髓迁移到血液循环中的化合物。此类化合物的实例是粒细胞集落刺激因子(g-csf)及其类似物，如非格司亭(filgrastin)、来格司亭(lenograstin)和培非格司亭(lenograstin)等，gm-csf，m-csf，普乐沙福(plerixafor，amd3100)，干细胞因子(scf)，血管内皮生长因子(vegf)，红细胞生成素和胎盘生长因子(pgf)，cxcl12/cxcr4调节剂，sip激动剂，vcam/vla-4抑制剂，甲状旁腺激素，蛋白酶体抑制剂，和groβ，hif稳定剂。
[0067]
g-csf
[0068]
粒细胞集落刺激因子(g-csf)是一种动员干细胞和免疫细胞的糖蛋白，并被认为具有免疫调节和促再生特性。其也被称为集落刺激因子3(csf3)。g-csf由一系列不同的组
织产生，刺激骨髓产生干细胞和粒细胞并将它们释放进血液中。g-csf还起到刺激中性粒细胞前体和成熟的中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能的作用。在本发明中，考虑使用g-csf的重组类似物或g-csf的生物类似物来替代g-csf。术语“g-csf”旨在包括g-csf类似物或g-csf生物类似物。
[0069]
tlr4
[0070]
toll样受体4(tlr4)是脂多糖(lps)和其他革兰氏阴性内毒素的重要模式识别受体，在许多非实质细胞和实质细胞上表达，包括肝细胞和肝星状细胞。该受体的激活导致nfkb介导的炎症反应。
[0071]
本发明涉及干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂的组合在治疗、预防和或诊断肝衰竭如慢加急性肝衰竭(aclf)中的用途。
[0072]
alf和aclf
[0073]
急性肝衰竭(alf)发生在先前肝脏正常的个体中，是由于严重的肝损伤，通常由肝毒性损伤引发。
[0074]
慢加急性肝衰竭(aclf)是一种独特的临床疾病，包括肝硬化(通常是失代偿期肝硬化)患者肝功能的急性恶化，这通常与诱发事件相关，并导致一个或多个器官的衰竭和高短期死亡率。不受控制的炎症被认为是一个主要的促成因素。aclf的一个典型特征是其进展迅速，需要多器官支持，中短期死亡率高达40％-90％。
[0075]
因此，本发明来源于发明人对tlr4拮抗剂和干细胞动员剂g-csf的组合的协同作用的发现。本发明通过提出将干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂的组合作为用于治疗或预防肝病如alf或aclf的治疗剂来利用这些作用。
[0076]
tlr4拮抗剂
[0077]
本发明涉及toll样受体4(tlr4)的拮抗作用。tlr4拮抗剂可以是抑制或降低tlr4的活性、功能或量的任何化合物或分子。优选地，所述拮抗剂在肝衰竭患者的肝和/或肾和/或脑中发挥作用。所述拮抗剂可以优先作用于肝和/或肾，或可以作用于包括肝和/或肾和/或脑的多个部位。优选地，所述拮抗剂导致施用了拮抗剂的个体的器官(例如所述个体的肝、肾、脑和心脏中的一个或多个)中tlr4的活性、功能或量的降低。如下文进一步讨论的，所述拮抗剂可以在施用过程中靶向肝、肾或其他器官，例如上文列出的那些。
[0078]
与在没有拮抗剂的情况下观察到的tlr4的活性或量相比，优选的拮抗剂是使tlr4的活性或量降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的那些拮抗剂。
[0079]
tlr4拮抗剂可以将tlr4的活性或量降低至与在一个未患肝病的个体中所观察到相同的、相似的或相当的量或活性。例如，如本文所解释的，tlr4的表达增加被发现与肝硬化模型有关。使用根据本发明的tlr4拮抗剂可以导致被治疗的个体的肝和/或肾和/或脑中的tlr4表达被减少降低至正常水平，如在未患有慢性肝病或肝硬化的个体中所观察到或预期的水平。
[0080]
所述拮抗剂可以特异性拮抗tlr4。即，所述拮抗剂对tlr4的作用可以大于所述拮抗剂的任何其他生物作用。此类拮抗剂对tlr4的抑制可以是特异的，即所述拮抗剂可以降低tlr4的活性，而不降低其他受体如其他toll样受体的活性。此类拮抗剂可以额外地或选择性地对tlr4的表达是特异的，即所述拮抗剂可以降低tlr4的表达，而不降低其他受体如
其他toll样受体的表达。根据本发明使用的拮抗剂可以是如本文所述的tlr4拮抗剂，其不作为其他toll样受体的拮抗剂发挥作用。根据本发明使用的拮抗剂可以优先作用于tlr4，而不是其他toll样受体。例如，根据本发明使用的tlr4拮抗剂可具有一个或更多个如本文所述的tlr4拮抗剂的特性，但可不具有与其他toll样受体相关的此类特性，或可具有与其他toll样受体相关的较低水平(与tlr4相比)的此类特性。例如，降低tlr4活性的拮抗剂可不降低其他toll样受体的活性，或可以较小程度地降低其他toll样受体的活性(相比于其对tlr4的作用)，例如较低的百分比下降。降低tlr4的表达或量的拮抗剂可不降低其他toll样受体的表达或量，或可以较小程度降低其他toll样受体的表达(相比于其对tlr4的作用)，例如较低的百分比下降。如本文所述的tlr4拮抗剂可对其他toll样受体有作用，例如对一个或更多个其他toll样受体的活性、信号传导或表达的拮抗作用，即拮抗剂对tlr4的活性、信号或表达的作用小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％。
[0081]
本文中的其他toll样受体是指任何不是tlr4的toll样受体。在哺乳动物中已鉴定出至少13组toll样受体。其他toll样受体可以是任何不是tlr4的此类toll样受体。其他toll样受体可以是这些toll样受体中的一个或多个。其他toll样受体可以是所有其他不是tlr4的toll样受体。
[0082]
所述tlr4拮抗剂的特异性可以应用于待治疗个体的全身，即所述tlr4拮抗剂的作用可以是如上文所讨论的在所述个体的全身是特异的。所述tlr4拮抗剂的特异性可以应用于所述个体的特定组织，如肝脏、肾脏和/或心脏和/或脑。即，在一个实施方案中，所述tlr4拮抗剂可以特异地在待治疗个体的肝和/或肾和/或其他器官内拮抗tlr4。
[0083]
因此，所述tlr4拮抗剂可以是如上文所述的tlr4特异性拮抗剂。例如，所述tlr4拮抗剂可以不是其他toll样受体的拮抗剂，或者可以对其他toll样受体的活性或表达没有显著影响。
[0084]
任何能够抑制tlr4的活性或功能的剂都可以适用于本发明的方法中。根据本发明使用的拮抗剂可以是tlr4的直接拮抗剂或间接拮抗剂。
[0085]
直接拮抗剂是其活性直接作用于tlr4的剂。例如，直接拮抗剂可以是直接作用于tlr4受体以降低其活性的剂。直接拮抗剂可以是破坏tlr4功能或使tlr4受体不稳定的剂。直接拮抗剂可以通过破坏或扰乱患者体内的tlr4分子来降低tlr4的量。直接拮抗剂可以是作用于tlr4基因、启动子或其他基因调控区以降低tlr4的表达的剂。直接拮抗剂可以通过阻止或减少内源性tlr4基因的表达来降低tlr4的表达。
[0086]
tlr4拮抗剂可以扰乱tlr4的活性。例如，所述拮抗剂可以通过阻止tlr4的激活或阻止包含tlr4的功能复合物的形成来发挥作用。
[0087]
根据本发明，具有上述特性的任何剂或分子都可以用作tlr4拮抗剂。测试剂可以是例如肽、多肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、小分子或其他化合物或可以包含例如肽、多肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、小分子或其他化合物，可以从已知的tlr4拮抗剂开始通过合理的药物设计来设计这些测试剂。
[0088]
根据本发明使用的tlr4拮抗剂或抑制剂的实例包括：
[0089]
肽stm28，如sugiyama等人所述(european journal of pharmacology 594(2008)152-156)；
[0090]
(6r)-6-[n-(2-氯-4-氟苯基)氨磺酰基]环己-1-烯-1-羧酸乙酯(tak-242)，其通过阻断由tlr4胞内结构域而非胞外结构域介导的信号传导来发挥作用；
[0091]
四钠[(2r,3r,4r,5s,6r)-4-癸氧-5-羟基-6-[[(2r,3r,4r,5s,6r)-4-[(3r)-3-甲氧基癸氧基]-6-(甲氧基甲基)-3-[[(z)-十八烷-11-烯酰基]氨基]-5-膦酰氧基噁烷-2-基]氧甲基]-3-(3-氧代十四烷酰氨基)噁烷-2-基]磷酸酯(eritoran)，其可以作为e5564被提供。e5564包含eritoran四钠作为活性成分。e5564阻断受体信号传导并抑制炎症细胞因子il-1和tnf的释放。
[0092]
ni-0101是一种抗tlr4单克隆抗体，其与tlr4上的表位结合，干扰胞内信号传导和促炎通路的诱导所必需的二聚化。ni-0101是novimmune sa的产品。
[0093]
oxpapc(1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱)，其是一种氧化磷脂，已被证明可抑制由细菌脂肽和脂多糖(lps)诱导的信号传导。
[0094]
iaxo化合物如iaxo-101(甲基6-脱氧-6-n-二甲基-n-环戊铵基-2,3-二-o-十四烷基-α-d-吡喃葡萄糖苷碘化物)，iaxo-102(甲基6-脱氧-6-氨基-2,3-二-o-十四烷基-α-d-吡喃葡萄糖苷)，或iaxo-103(n-(3,4-双-十四烷氧基-苄基)-n-环戊基-n,n-二甲铵碘化物)
[0095]
在hennessy et al(2010)nature reviews drug discovery 9:293-307中对靶向tlr如tlr4的化合物进行了综述。
[0096]
优选地，所述tlr4拮抗剂不是lps。
[0097]
所述tlr4拮抗剂可以是能够结合并阻止或破坏tlr4的活性的分子。
[0098]
因此，根据本发明使用的一组tlr4拮抗剂是抗tlr4抗体。此类抗体可以是单克隆的或多克隆的，或可以是其抗原结合片段。例如，抗原结合片段可以是f(ab)2、fab或fv片段或包含f(ab)2、fab或fv片段，即所述抗体的“可变”区域的片段，该片段包含抗原结合位点。抗体或其片段可以是单链抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体或人源化抗体。
[0099]
抗体可以针对tlr4分子，即该抗体可以与tlr4上存在的表位结合，从而选择性地和/或特异性地与tlr4结合。抗体可以针对参与tlr4的表达和/或活性的另一个分子。例如，可以产生对tlr4上的一个或多个表位和/或参与tlr4的表达和/或活性的一个或多个其他分子具有广谱作用的多克隆抗体。
[0100]
可以通过任何合适的方法产生抗体。制备和表征抗体的方法在本领域是公知的，参见例如harlow and lane(1988)“antibodies:alaboratory manual”,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny。例如，抗体可以通过在宿主动物中产生针对整个多肽或其片段例如其抗原表位(在本文中称为“免疫原”)的抗体来产生。
[0101]
抗体或其他化合物“特异地结合”到分子，是指当其优先或以高亲和力与其所特异于的分子结合而基本上不结合或仅以低亲和力与其他分子结合。用于确定抗体的特异性结合能力的竞争性结合或免疫放射分析的多种方案在本领域是公知的(参见例如maddox et al,j.exp.med.158,1211-1226,1993)。此类免疫分析通常涉及具体蛋白及其抗体之间的复合物的形成和对复合物形成的测量。
[0102]
所述tlr4拮抗剂可以是反义寡核苷酸，如针对编码tlr4蛋白的基因的反义寡核苷酸。如本文所用，术语“反义寡核苷酸”是指与所需基因的mrna互补的核苷酸序列。这种反义寡核苷酸可以选择性地与所需基因杂交。在本发明的上下文中，所需基因可以是编码tlr4
的基因。
[0103]
所述tlr4拮抗剂可以调节tlr4基因的表达。例如，所述tlr4拮抗剂可以是短干扰核酸(sirna)分子、双链rna(dsrna)、微小rna、脱氧核糖核酸干扰(dnai)或短发夹rna(shrna)分子。
[0104]
如本文所用，术语“选择性杂交”指核酸可检测地和特异性地结合第二核酸的能力。在最小化与非特异性核酸的可检测结合的可感知量的杂交和洗涤条件下，寡核苷酸选择性地与靶核酸链杂交。高严格条件可用于实现本领域已知的选择性杂交条件。通常，根据常规杂交程序，杂交和洗涤条件在高严格条件下进行。洗涤条件通常为1-3
×
ssc，0.1-1％ sds，50℃-70℃，并在约5-30分钟后更换洗涤溶液。
[0105]
所述tlr4拮抗剂可以是核酸分子，如反义分子或适配体。所述核酸分子可以结合特定的靶分子。
[0106]
适配体可以在体外被完全工程化，其易于通过化学合成产生，具有所期望的储存特性，且在治疗应用中很少或不引起免疫原性。这些特性使它们在制药和治疗效用中特别有用。
[0107]
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。核酸可以包括常规碱基、糖残基和核苷酸间键，也可以包括经修饰的碱基、经修饰的糖残基或经修饰的键。核酸分子可以是单链的或双链的。
[0108]
通常，适配体可以包含长度为至少5个、至少10个或至少15个核苷酸的寡核苷酸。适配体可以包含长度多达40个、多达60个或多达100个或更多个的核苷酸的序列。例如，适配体的长度可以为5至100个核苷酸，10至40个核苷酸，或15至40个核苷酸。在可能的情况下，优选较短长度的适配体，因为这些适配体通常将导致较少的其他分子或材料的干扰。
[0109]
适配体可以使用常规方法来产生，例如通过指数富集的配基系统进化技术(selex)程序。selex是一种与靶分子高度特异结合的核酸分子的体外进化的方法。该方法描述于在，例如us 5,654,151、us 5,503,978、us 5,567,588和wo 96/38579中。所述selex方法涉及从寡核苷酸集合中选择核酸适配体，特别是能够结合到所需靶标的单链核酸。将单链核酸的集合(如dna、rna或其变体)与靶标接触，在有利于结合的条件下，将混合物中那些与靶标结合的核酸与那些未结合的核酸分离，解离核酸-靶标复合物，扩增那些与靶标结合的核酸，产生富含有所需结合活性的核酸的集合或文库，然后根据需要重复这一系列步骤，生成对相关靶标具有特异性结合亲和力的核酸(适配体)的文库。
[0110]
因此，本文所述的任何拮抗剂均可以用于拮抗tlr4，即，降低存在的tlr4的量和/或tlr4的活性或功能。优选地，这些拮抗作用发生在肝和/或肾和/或脑中。
[0111]
tlr4拮抗剂可以是降低内源性tlr4产生的剂。例如，所述剂可以作用在受试者的细胞内以抑制或阻止tlr4的表达。这种剂可以是作用于tlr4基因以抑制或阻止基因表达的转录因子或增强子。
[0112]
优选地，所述tlr4拮抗剂是能够减少由施用肝毒素如对乙酰氨基酚引起的损伤和/或器官功能障碍的剂。例如，这种能力可以在合适的动物模型中进行测试，例如使用这种肝毒素处理的非人类动物(例如小鼠或大鼠)。可以评估潜在的tlr4拮抗剂对这种动物的作用。所述tlr4拮抗剂可以在向所述动物施用肝毒素之前施用、同时施用或之后施用。可以
将存在所述拮抗剂时的肝毒素的作用与不存在所述tlr4拮抗剂时肝毒素的作用进行比较，例如在经赋形剂(vehicle)处理的动物中。与没有所述tlr4拮抗剂时观察到的相比，根据本发明使用的合适的tlr4拮抗剂可以减少动物的损伤或器官功能障碍。这种损伤或功能障碍的减少可以使用本文进一步讨论的任何标准来表征，例如肝酶减少、血浆肌酐和/或氨水平的降低、炎症调节剂水平例如nf6b或tnfα水平的改变、肝脏中白介素1a水平的降低、脑水(brain water)减少、器官组织损伤减少、或预期的由肝毒素处理导致的损伤或器官功能障碍的其他特征。例如，所述器官可以是肝、肾、心脏和/或脑。与不存在所述tlr4拮抗剂时施用肝毒素所观察到的作用相比，合适的tlr4拮抗剂有望具有改善的作用。
[0113]
药物制剂
[0114]
本文所述的合适的tlr4拮抗剂通常被配制成与药学上可接受的载体或稀释剂一起施用。因此，可按照制药领域的常规将所述拮抗剂配制成具有标准的药学上可接受的一种或多种载体(carrier)和/或辅料(excipient)的药剂。所述制剂的确切性质将取决于几个因素，包括所需的施用途径。通常，所述拮抗剂可以被配制为口服、静脉内、胃内、血管内或腹腔内施用。
[0115]
如果要施用干细胞，通常将其配制成与药学上可接受的载体或稀释剂一起施用。具有标准的药学上可接受的载体和/或辅料的细胞制剂可以使用制药领域中的常规方法进行配制。制剂的确切性质将取决于几个因素，包括待施用的细胞和所需的施用途径。合适的制剂类型在remington's pharmaceutical sciences,19
th edition,mack publishing company,eastern pennsylvania,usa中进行了完整地描述。组合物可以与生理上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，这样的组合物被制备为细胞的液体悬浮液。所述细胞可以与药学上可接受的且与活性成分相容的辅料混合。合适的辅料是例如水、生理盐水、右旋糖、甘油等及其组合。
[0116]
此外，如果需要，本发明的药物组合物可以包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂和/或增强效力的佐剂。
[0117]
所述干细胞动员剂如g-csf通常被配制成与药学上可接受的载体或稀释剂一起施用。因此，可按照制药领域的常规将所述干细胞动员剂如g-csf配制成具有标准的药学上可接受的载体和/或辅料的药剂。所述制剂的确切性质将取决于几个因素，包括所需的施用途径。通常，所述干细胞动员剂如g-csf可以被配制为口服、静脉内、胃内、血管内或腹腔内施用。
[0118]
所述干细胞动员剂如g-csf和所述tlr4的拮抗剂可以存在于如本文所述的单一制剂中。所述干细胞动员剂如g-csf和所述tlr4的拮抗剂可以在单一组合、组合物或药物组合物中存在。
[0119]
所述干细胞动员剂如g-csf和所述tlr4拮抗剂可以配制用于同时递送、相继递送或顺序递送。所述tlr4拮抗剂可以在所述干细胞动员剂如g-csf之前施用、同时施用或之后施用。所述干细胞动员剂如g-csf可以在所述tlr4拮抗剂之前施用、同时施用或之后施用。本发明的药物组合物可以包含g-csf和tlr4拮抗剂。
[0120]
所述干细胞动员剂如g-csf和所述tlr4拮抗剂可以存在于如本文所述的单一制剂中。所述干细胞动员剂如g-csf和所述tlr4拮抗剂可以在单一组合、组合物或药物组合物中存在。
[0121]
所述干细胞和所述tlr4拮抗剂可以配制用于同时递送、相继递送或顺序递送。所述tlr4拮抗剂可以在所述干细胞之前施用、同时施用或之后施用。所述干细胞可以在所述tlr4拮抗剂之前施用、同时施用或之后施用。本发明的药物组合物可以包含干细胞和tlr4拮抗剂。
[0122]
药物载体或稀释剂可以是例如等渗溶液如生理盐水。固体口服剂型可以包含活性化合物，稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂；如淀粉、阿拉伯树胶、明胶，甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂，如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羧基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨酯、十二烷基硫酸酯；以及，通常在药物制剂中使用的无毒且无药理活性的物质。这类药物制剂可以以已知的方式制备，例如，通过混合、制粒、压片、糖包衣或薄膜包衣工艺的方式。
[0123]
用于口服施用的液体分散剂可以是糖浆、乳剂或混悬剂。所述糖浆可以包含作为载体的例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。
[0124]
混悬剂和乳剂可以包含作为载体的例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肌内注射的混悬剂或溶液可以包含鸟氨酸，乙酸苯酯和苯基丁酸酯中的至少一种，以及药学上可接受的载体例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇类如丙二醇，以及如果需要，适量的盐酸利多卡因。
[0125]
如果待施用的tlr4拮抗剂是核酸分子，例如，如果所述拮抗剂是表达载体的形式，组合物中还可以包含某些核酸摄取和/或表达的促进剂(“转染促进剂”)，例如，促进剂如布比卡因、心脏毒素和蔗糖，以及转染促进赋形剂如通常用于递送核酸分子的脂质体或脂质制剂。
[0126]
根本发明的药物制剂还可以包含一种或更多种另外的治疗剂。例如，所述制剂可以包含一种或多种如本文定义的tlr4拮抗剂和干细胞动员剂如g-csf。所述制剂可以包含一种以上的干细胞动员剂。所述制剂可以包括本文所述的一种或多种tlr4拮抗剂以及一种或多种另外的治疗剂。优选地，所述一种或多种另外的治疗剂是将有助于待治疗的个体的治疗或预防的剂。例如，一种或多种有效治疗肝病的剂可以作为本文所述制剂的一部分施用。一种或多种有效治疗患者的潜在的肝病或其症状的剂可以作为本文所述制剂的一部分施用。
[0127]
此外，所述制剂可以包括本文定义的一种或多种tlr4拮抗剂和干细胞，如肝干细胞。所述制剂可以包含干细胞和干细胞动员剂。所述制剂可以包含本文所述的一种或多种tlr4拮抗剂以及一种或多种另外的治疗剂。优选地，所述一种或多种另外的治疗剂是有助于被治疗的个体的治疗或预防的剂。例如，一种或多种有效治疗肝病的剂可以作为本文所述制剂的一部分施用。一种或多种有效治疗患者的潜在的肝病或其症状的剂可以作为本文所述制剂的一部分施用。
[0128]
治疗
[0129]
本发明提供了用于治疗患有肝衰竭如aclf的个体的方法，特别是用于治疗或预防与肝衰竭如alf或aclf相关或由其引起的症状和疾病的方法。
[0130]
因此，本发明提供了一种治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法，包括向所述受试者施用干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂。类似地，可以提供干细胞动员剂如g-csf
和tlr4拮抗剂以用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。还提供了干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂在制备用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的药物中的用途。
[0131]
因此，本发明提供了一种治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法，包括向所述受试者施用干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂。类似地，可以提供干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂以用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。还提供了干细胞动员剂如g-csf和tlr4的拮抗剂在制备用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的药物中的用途。
[0132]
本发明还提供了一种治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法，包括向所述受试者施用干细胞如肝干细胞和tlr4拮抗剂。类似地，可以提供干细胞如肝干细胞和tlr4的拮抗剂以用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的方法中。还提供了干细胞如肝干细胞和tlr4拮抗剂在制备用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的个体的药物中的用途。
[0133]
g-csf和tlr4拮抗剂可以在本文所述的制剂中提供。因此，向受试者施用本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂，以治疗或预防受试者的肝衰竭(如alf或aclf)或与肝衰竭(如alf或aclf)相关的特定症状或病症。因此，可以施用如本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂以改善受试者(例如患有肝衰竭如alf或aclf的受试者)的病症。可以施用如本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂以缓解受试者的症状，例如与肝衰竭如alf或aclf相关的症状。
[0134]
可以施用如本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂以对抗或延缓肝衰竭如alf或aclf的发作或与之相关的任何症状。因此，本发明可以预防肝衰竭如alf或aclf的医学后果。因此，如本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂的使用可以延长患有肝衰竭如alf或aclf的患者的生命。
[0135]
肝衰竭如alf或aclf的治疗是指对患有肝衰竭如alf或aclf或有风险患有肝衰竭如alf或aclf的个体的治疗。所述个体也可能患有慢性肝病，如肝硬化或酒精性肝硬化。所述患者可能患有与感染如肝炎病毒感染如丙型肝炎病毒感染相关或由其引起的肝病或肝硬化。所述患者也可能患有与肝毒素(如对乙酰氨基酚(扑热息痛))治疗相关或由其引起的肝病或肝硬化。所述患者也可能患有ah、nafld或nash。本文所述的方法可以用于治疗任何此类疾病。
[0136]
所述个体可能患有一种或多种由肝衰竭如alf或aclf引起或与之相关的症状或病症。可以根据本发明来治疗这些疾病或病症的任何一种或多种。例如，所述患者可能由于他们的肝衰竭如aclf而患有以下一种或多种症状或处于罹患以下一种或多种症状的风险中：肾功能障碍；肾衰竭；hrs；血浆肌酐升高；脑功能障碍和脑肿胀；血浆氨升高；肝酶浓度升高(如肝中alt和/或ast浓度升高)；肝和/或肾和/或脑和/或血液循环中的炎症、损伤和/或功能障碍增加；肝衰竭导致的肝组织损伤，如由对乙酰氨基酚(apap)毒性所导致。所述患者可能患有急性肝衰竭、酒精性肝炎和/或肝脏再灌注损伤或处于罹患以上的风险中。这些病症可能是由所述个体的alf和/或aclf引起的。本文所述的方法和用途可以用于治疗或预防这些症状或病症的任何一种或多种，特别是在患有肝衰竭如aclf的个体中。
[0137]
特别地，本文所述的方法可以用于治疗患有肝衰竭如alf或aclf的患者。例如，所述患者可能患有肾衰竭或处于罹患肾衰竭的风险中。肝衰竭如alf或aclf可能由感染和/或炎症所导致。肝衰竭如aclf可能由于暴露于肝毒素(如对乙酰氨基酚(扑热息痛))所导致，如暴露于高水平的肝毒素，如扑热息痛过量所导致。本文所述的方法可以用于治疗或预防任何这些疾病或症状。
[0138]
如本文所述，所述tlr4拮抗剂可以导致所述受试者的肝和/或肾中tlr4的表达下降和/或tlr4的水平下降。例如，所述拮抗剂可以是抑制受试者细胞中tlr4的转录的剂。
[0139]
如本文所述，所述tlr4拮抗剂可以导致所述个体的肝和/或肾中tlr4的活性下降。
[0140]
使用如本文所述的干细胞动员剂和tlr4拮抗剂治疗所述受试者。在优选实施方案中，使用如本文所述的g-csf和tlr4拮抗剂治疗所述受试者。如上所述，所述干细胞动员剂如g-csf和tlr4拮抗剂可以各自单独施用，彼此相继施用，彼此顺序施用，和/或以药物制剂的形式施用。所述制剂可以包含一种或多种另外的治疗剂或预防剂。
[0141]
使用如本文所述的干细胞和tlr4拮抗剂治疗所述受试者。在优选实施方案中，使用如本文所述的肝干细胞和tlr4拮抗剂治疗所述受试者。如上所述，所述干细胞如肝干细胞和tlr4拮抗剂可以各自单独施用，彼此相继施用，彼此顺序施用，和/或以药物制剂的形式施用。所述制剂可以包括一种或多种另外的治疗剂或预防剂。
[0142]
除了使用干细胞治疗受试者之外，本文所述的两种或多种不同的tlr4拮抗剂还可以组合使用。所述两种或多种拮抗剂可以一起施用、以单一制剂施用、同时施用、以两种或多种单独制剂施用，或作为联合施用方案的一部分单独施用或顺序施用。
[0143]
所述干细胞和tlr4拮抗剂可以与已知用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的其他剂联合施用。所述干细胞和tlr4拮抗剂和其他剂可以一起施用、以单一制剂施用、同时施用、以两种或多种单独制剂施用，或作为联合施用方案的一部分单独施用或顺序施用。
[0144]
除了使用g-csf治疗受试者之外，本文所述的两种或多种不同的tlr4拮抗剂还可以组合使用。所述两种或多种拮抗剂可以一起施用、以单一制剂施用、同时施用、以两种或多种单独制剂施用，或作为联合施用方案的一部分单独施用或顺序施用。
[0145]
g-csf和tlr4拮抗剂可以与已知用于治疗或预防肝衰竭如alf或aclf的其他剂联合施用。g-csf和tlr4拮抗剂和其他剂可以一起施用、以单一制剂施用、同时施用、以两种或多种单独制剂施用，或作为联合施用方案的一部分单独施用或顺序施用。
[0146]
本发明的药物组合物或制剂可以通过任何合适的途径施用。优选地，通过口服、静脉内、胃内、腹腔内或血管内途径施用。所述拮抗剂或制剂可以直接施用于所述受试者的肝脏。
[0147]
将所述药物组合物或制剂以治疗有效量施用。本发明的药物组合物或制剂的合适剂量可以根据各种参数来确定，如待治疗受试者的年龄、体重和病症；肝病的类型和严重程度；施用途径；以及所需的方案。可以确定单个拮抗剂的合适剂量。例如，对于一些药物组合物或制剂，典型剂量可以为0.1mg/kg/天至30g/kg/天。医生将能够针对任何具体受试者确定所需的拮抗剂剂量。
[0148]
本发明广泛适用于治疗方法，并与预防性和/或治疗性治疗的开发有关。应当理解，本文中提及的所有治疗包括治愈性治疗、姑息性治疗和预防性治疗。
[0149]
预防或治疗包括但不限于引起tlr4的量、功能或活性的有效降低，以引起与aclf相关或由其引起的一种或多种症状或病症的减轻。所述症状或病症可以是例如任何上文讨论的那些。例如，预防或治疗可以导致：肾功能障碍症状减轻，肝衰竭症状的预防或减轻，血浆肌酐、血浆氨、肝酶浓度的水平降低(如肝中alt和/或ast的浓度降低)，肝和/或肾和/或脑和/或血液循环中的炎症减轻，和或肝衰竭导致的肝组织损伤(如由对乙酰氨基酚(apap)毒性所导致的)减轻。预防或治疗可以将患者的肾功能障碍、肾衰竭、血浆肌酐、脑功能障碍
和/或脑肿胀、血浆氨、肝酶浓度(如肝中alt和/或ast的浓度)、肝和/或肾和/或脑和/或血液循环中的炎症、和或肝衰竭导致的肝组织损伤(如由乙酰氨基酚(apap)毒性所导致的)维持在特定水平，而在所述患者中这些症状因aclf已经加重或预期会加重。与在没有这种治疗的情况下可能看到或预期的变化相比，预防或治疗可以导致这种个体的症状或病症的变化以较低的速度改变。
[0150]
预防或治疗对本文所述的肝衰竭如alf或aclf的任何症状或后果可能有相似的作用。即，根据本发明的治疗可以减轻此类症状或后果的严重程度，维持此类症状或后果的现有水平，或减缓或减少此类症状或后果的恶化。
[0151]
待治疗的患者
[0152]
本发明涉及在有需要的个体中治疗或预防肝衰竭如alf或aclf。因此，根据本发明的待治疗的个体可能患有肝衰竭如alf或aclf或可能处于增加的肝衰竭如alf或aclf的风险中。例如，所述受试者可能患有肝衰竭。所述受试者可能患有免疫功能障碍或衰竭、全身性炎症、肾衰竭或脑功能障碍和/或脑肿胀。所述受试者可能患有ah、nafld或nash。
[0153]
用于诊断肝衰竭、免疫功能障碍、肾功能障碍、脑功能障碍、脑肿胀或免疫衰竭的方法在本领域中是公知的，特别是对于本领域的临床医生和兽医而言。例如，肾功能障碍的特征在于肾功能的降低或丧失，这可以通过监测尿量或尿液的钠浓度和渗透压来评估。肝肾综合征也与肾血流量的减少有关。优选地，所述受试者已被例如医学或兽医专业人员诊断为患有肝衰竭。所述受试者可能表现出一种或多种与肝衰竭、肾功能障碍或肾衰竭相关的症状。
[0154]
用于诊断肝衰竭如aclf的方法在本领域中是公知的，特别是对于本领域的临床医生和兽医而言。aclf通过使用慢性肝衰竭(clif)联合标准、nacseld标准或apasl标准来诊断。先前验证的用于评估疾病严重程度的评分包括child-pugh(cp)分级、终末期肝病模型(meld)和clif联合急性失代偿(clif-c ad)评分。
[0155]
与健康个体如未患肝衰竭如alf或aclf的个体相比，所述待治疗的个体可能具有肝中tlr4的表达增加。与健康个体如未患肝衰竭如alf或aclf的个体相比，所述待治疗的个体可能具有增加的血清或血浆tlr4。
[0156]
所述待治疗的个体可以例如通过这些方法中的任何一种被诊断为患有肝衰竭如alf或aclf或本文所述的一种或多种可能与肝衰竭如alf或aclf相关的症状或病症。所述待治疗的个体可以被诊断为有患肝衰竭如alf或aclf的风险。例如，所述个体可以被诊断为患有与肝衰竭、肝硬化、肾衰竭和/或肾衰竭相关的一种或多种症状。例如，所述待治疗的个体可以患有肝硬化、ah、nash、特发性非肝硬化门静脉高压症、先天性肝纤维化、部分结节性转化、布加综合征、门静脉血栓形成、右心衰或血吸虫感染。
[0157]
所述待治疗的受试者可以是任何易患肝衰竭如alf或aclf的个体。所述受试者可以是男性或女性。女性可比男性更易受到酒精的不良影响。与男性相比，女性可在更短的时间内以及因更少的酒精量而患上慢性肝病。
[0158]
所述待治疗的受试者可以是人。所述待治疗的受试者可以是非人类动物。所述待治疗的受试者可以是农场动物，例如母牛或公牛、绵羊、猪、牛、山羊或马，或可以是家养动物，如狗或猫。所述待治疗的受试者可以是肝病动物模型或可以不是肝病动物模型。所述动物可以是任何年龄的动物，但通常是成熟的成年受试者。
[0159]
实施例
[0160]
实施例1-干细胞动员在慢加急性肝衰竭(aclf)中具有有害后果
[0161]
在来自亚洲的三个小型随机试验中，干细胞动员显著提高了生存率，改善了器官功能，并降低了感染率，因此提示干细胞动员是aclf的一种新的治疗选择。然而，本发明人产生的数据出乎意料地表明了在aclf情况下的干细胞动员是有害的。
[0162]
首先，他们在德国进行了的第一个多中心随机对照试验来测试aclf中的g-csf，该试验由德国研究基金会(dfg)(nct02669680)资助。他们招募了163名患者，随机分为g-csf治疗和标准护理的两组。在根据apasl标准，在患有酒精性肝炎和aclf的患者亚组中，g-csf没有改善生存率，并且有增加死亡率的趋势(11)。
[0163]
其次，由于关于g-csf的治疗益处的数据相互矛盾，为了阐明干细胞动员的作用，本发明人在公认的aclf啮齿动物模型中进行了临床前研究。用四氯化碳(ccl4)对c57bl/6小鼠进行6周的灌胃以诱导肝纤维化，随后注射脂多糖(lps)以诱导组织损伤和器官衰竭。lps注射1小时后，对小鼠进行g-csf 250μg/kg的皮下注射，每天1次，连续5天(图1a)。ccl4诱导显著的桥接纤维化和严重的内毒素驱动的肝损伤，伴有扩大的指示凋亡/坏死的实质细胞的tunel阳性区域。所有未经治疗的动物在lps注射后存活了5天。然而，g-csf治疗导致了48小时后50％的死亡率，更高程度的肝纤维化(天狼猩红)(图1b、图1c)。这伴随着肝纤维化增加和肝巨噬细胞浸润(免疫组化f4/80 )(图1c)，这在g-csf处理5天后持续存在。
[0164]
科学家进一步的重复导致在lps注射后48小时内使用g-csf处理的所有aclf动物的死亡率为66％，而其余所有动物在整个治疗期存活。
[0165]
使用g-csf的治疗增加了死亡率，加重了肝巨噬细胞浸润和局部炎症反应(il6)(图4d)，并增强了肝纤维化。
[0166]
因此，g-csf加重了内毒素驱动的aclf和与aclf相关的死亡率，这与恶化的肝巨噬细胞浸润有关。
[0167]
实施例2：干细胞动员和toll样受体4抑制协同作用治疗慢加急性肝衰竭。
[0168]
发明人研究了toll样受体4(tlr4)抑制是否能预防干细胞动员剂在慢加急性肝衰竭中的危害，以及加重的炎症反应和器官功能障碍是否与干细胞动员有关。所有干细胞动员剂，如g-csf、gm-csf和amd3100，其共同点是在动员干细胞方面有效，但同时释放了诸如中性粒细胞和单核细胞的促炎细胞。发明人假设，一旦在慢加急性肝衰竭中被释放到循环中，那些细胞立即面临循环的危险分子，如损伤相关分子模式(damp)和病原体相关分子模式(pamp)，其通过toll样受体4(tlr4)激活免疫细胞。随后的过度炎症反应加重了组织损伤。
[0169]
基于以下观察，本发明人假设aclf中的g-csf相关的死亡率增加可能是由于tlr4依赖性机制：
[0170]
·
通过肝脏中tlr4上调的对内毒素的敏化作用是肝硬化中的关键事件(图2a，b)。
[0171]
·
g-csf增加了tlr4表达，因为现已证明一旦将g-csf施用给肝衰竭的鼠模型，g-csf就增加了该模型中肝脏tlr4表达并且加重了肝损伤(12)。
[0172]
·
发明人发现肝中tlr4 ve cd45 免疫细胞的数量增加(图2c)。
[0173]
为探究该假设，本发明人在有g-csf或无g-csf的aclf模型的啮齿动物中使用了tlr4拮抗剂tak-242。tak-242有效地减少了肝中细胞死亡(图2d)并改善了血浆alt水平(图
2d)。
[0174]
然后，发明人在aclf的临床前模型中测试了tlr4抑制剂(如tak-242)是否能拯救g-csf驱动的损伤和炎症。用ccl4对c57bl/6小鼠进行6周的灌胃，随后注射lps，用g-csf或tak-242或其组合处理24小时和5天(图3a，图4a)。结果显示在lps驱动的炎症lps模型中动物免于g-csf相关的死亡(图3d)，并且血浆alt水平降低(图3b)，lps诱导的器官损伤改善，该结果由肝细胞死亡(tunel(图3b)，bcl2(图4e))、炎症反应(巨噬细胞浸润，肝中性粒细胞(图3c，d)，tnfalpha，il6(图4d))的减少证实。
[0175]
stat3通路通过释放拮抗bax的bcl2来缓解凋亡。发明人还观察到，tak-242/g-csf的保护作用与stat3通路的激活(pstat3的增加)相关(图4f)，可能由il-22分泌诱导(图4g再生)，伴有增加的抗凋亡bcl2的表达和更高的bcl2/bax比率(图4f)。同样，损伤标志物(如脂质运载蛋白/ngal和il-13)随g-csf增加，但如果添加了tak-242，则损伤标志物减少，如混合肝脏裂解物后由蛋白分析仪所示(图4g炎症/损伤和衰老)。lps注射也与星状细胞激活(asma表达)相关，这可被tak-242显著消除(图4h)。
[0176]
单核细胞和巨噬细胞是肝病中细胞因子释放的主要来源。因此，发明人在体外测试了lps和g-csf在多大程度上调节pma激活和原生的thp1细胞中的细胞因子反应。这些实验表明，在lps刺激前，在pma激活的thp1巨噬细胞样细胞和原生thp1单核细胞样细胞中孵育g-csf会导致细胞因子反应加重，尤其是il6 mrna表达上调[thp1巨噬细胞 lps 10ng/ml：6.2倍上调vs.lps 10ng/ml g-csf 100ng/ml：6.7倍上调；thp1单核细胞 lps 10ng/ml：60.2倍上调vs.lps 10ng/ml g-csf 100ng/ml：71倍上调(图4i)]。这些体外发现与肝il6水平一致，在g-csf处理的动物中，il6水平增加了2.8倍(图4d)。在tak-242的存在下，单独使用lps或组合使用lps与g-csf的这些变化被完全阻止，这清楚地表明tak-242阻止了由lps和g-csf驱动的压倒性炎症反应。这些数据有助于解释使用g-csf/tak-242处理的aclf动物中器官损伤的标志物的减少。
[0177]
发明人观察到tak-242和g-csf的联合治疗对肝再生和损伤具有协同作用。g-csf与tak242的联合在24小时后减少了肝细胞衰老，并在治疗5天后显著改善了肝细胞增殖，而单独使用tak242治疗没有增强肝细胞驱动的组织修复(图4b，图4c，图4d)。在未施用lps的ccl4肝硬化动物中，本发明人观察到类似的g-csf对肝细胞增殖的作用，从而为阻止lps-tlr4信号传导是揭示g-csf的促增殖能力的关键提供了证据。
[0178]
作为g-csf在非炎症环境中表现出促增殖作用的进一步证据，发明人测试了在ccl4(无lps)施用后的5天的g-csf治疗。在这种情况下，g-csf注射显著增加了增殖的肝细胞的数量；观察到ki67染色为4.1％
±
2.9(对于ccl4 lps g-csf 5d，p《0.001)，细胞周期蛋白a2为2.1％
±
1.3(对于ccl4 lps g-csf 5d，p《0.05)(图4j)。
[0179]
通过使用蛋白质组分析仪，在混合肝脏裂解液中对其他再生标志物的蛋白质表达进行了评估。在ccl4-lps小鼠中单独施用tak-242超过24小时，减少了血管再生的肝脏标志物(如血管生成素2、增殖蛋白和pdgf)和参与肝脏再生的其他标志物，如il-22、flt3-配体和igfbp-1(图4g血管再生和再生)。向tak-242中添加g-csf显著增加了这些促再生标志物的肝蛋白表达(图4g血管再生和再生)。
[0180]
这些发现证实了g-csf需要非炎症环境以发挥其对肝细胞的增殖作用的假设，因此，使用tak-242的抗炎治疗允许g-csf发挥其促再生能力。
[0181]
实施例3：在非炎症aclf模型中的g-csf与tak-242协同作用的机制
[0182]
众所周知，g-csf具有促增殖特性，且肝硬化与细胞衰老和缺乏肝细胞增殖有关。因此，本发明人评估了tak-242和g-csf作为联合疗法的有益作用的机制是否是由于调节炎症的同时增加了肝细胞增殖。
[0183]
从几个临床前的肝损伤模型中很好地描述了干细胞动员和归巢到肝脏诱导实质再生。然而，与直接肝毒性损伤模型不同，aclf是一种独特的疾病，因为其主要将败血症样全身性炎症反应与组织损伤联系起来。炎症可掩盖由干细胞和调节免疫细胞诱导的再生。因此，发明人测试了向g-csf中添加tak-242是否不仅能预防g-csf驱动的炎症反应，还允许干细胞动员发挥其组织修复能力。在不同的aclf模型中测试了g-csf和tak-242的联合治疗，所述模型包括ccl4灌胃6周，随后注射半乳糖胺(肝毒性，非炎症性打击)(图5)。在galn模型中，tak-242 g-csf在减少组织损伤方面优于单独疗法(tunel(图5b)，bcl2(图7)，alt水平(图5b)和ripk3(图6a，b))。
[0184]
在galn诱导的非炎症模型中，向g-csf中添加tak-242通过上调bcl2在减少肝损伤(tunel，ripk3)方面显著优于单独疗法(图7)。
[0185]
在galn诱导的非炎症模型中，galn注射诱导了显著的肝损伤，伴有高alt水平[27.3u/l(范围为24.2
–
63.4)vs.288u/l(范围为46-807)(p《0.001)]、细胞死亡面积扩大(tunel)(0.23％(范围为0.17-0.29)vs.2.6％(范围为1.3-5.2))、坏死性细胞死亡的标志物ripk3阳性[1％(范围为0.75-1.1)vs.3.2％(范围为1.6-4.4)，p《0.001)]。与炎症lps模型相反，使用g-csf的单独处理降低了alt水平[101u/l(范围为51-284)]、肝细胞死亡(tunel 1.2％(范围为0.4-1.9)，p《0.001)和ripk3表达[1.9％(范围为0.9-2.5)]。单独使用tak-242倾向于降低alt水平至96.5u/l(范围为45-229)、ripk3表达[1.7％(范围为0.9-2.1)]和肝细胞死亡[tunel 1.4％(范围为0.4-3.3)]，然而未达到统计学显著性。g-csf和tak242的组合优于两种单独处理，改善了alt水平(74.5u/l(范围为44-297))、肝细胞死亡(tunel 0.45％(0.11-0.95)，p《0.001；与两种单独疗法相比)和ripk3表达(1.23％(1-1.78)，对于ccl4 galn，p《0.01)。此外，tak-242 g-csf的处理也与stat3通路的激活和抗凋亡bcl2表达增加的趋势有关，如通过蛋白质印迹在混合的肝脏样本中评估的那样。
[0186]
发明人还评估了在该模型中的肝细胞增殖是否受到g-csf
±
tak-242处理的调节。注射了galn的经ccl4处理的动物显示出了高水平的增殖的肝细胞[ki67：ccl4 0.1％
±
0.1vs.ccl4 galn 2％
±
1.7，(p《0.01)，细胞周期蛋白a2：ccl4 0.1％
±
0.2vs.ccl4 galn1.9％
±
1.6，(p《0.05)]和处于细胞周期停滞的肝细胞(p21：ccl4 0.5％
±
0.2vs.ccl4 galn 6.4％
±
4.7，p《0.01)。在有tak-242或无tak-242的情况下，g-csf处理降低了肝细胞增殖和肝细胞衰老的程度，而单独的tak-242没有改变对损伤的反应[ki67：ccl4 galn tak-242-3％
±
2.1vs.ccl4 galn tak-242 g-csf：1.2％
±
1.4(p《0.05)；细胞周期蛋白a2：ccl4 galn tak-242-1.9％
±
1.6vs.ccl4 galn tak-242 g-csf 0.3％
±
0.2(p《0.001)；p21：ccl4 galn tak-2427.1％
±
4.5vs.ccl4 galn tak-242 g-csf 1.7％
±
2.3(p《0.001)](图8)。
[0187]
综合这些数据表明，在该非炎症模型中，g-csf和tak-242的组合对肝损伤、再生产生了积极影响，并且还减少了衰老的标志物。这也证实g-csf的再生作用在非炎症环境中得以保留。
[0188]
实施例4-细胞死亡与肝再生的关系以及g-csf和tak-242的作用
[0189]
为了探究细胞死亡作为再生调节剂的作用，发明人在不同处理组中使用了ripa56(选择性ripk1抑制剂)来防止galn诱导的坏死性细胞死亡。与ccl4 galn相比，ripa56处理有效地防止了与肝细胞增殖的减少(ki67 2％
±
1.7vs.0.2％
±
0.2，p《0.001；细胞周期蛋白a2 1.9％
±
1.6vs.0.03％
±
0.1，p《0.001)相关的galn驱动的细胞死亡(与ccl4 galn相比，tunel p《0.001以及ripk3 p《0.001)(图9)，这表明在这种非炎症环境中，再生反应与损伤程度直接相关。
[0190]
然后，发明人计算了作为细胞周期进程的标志物的细胞周期蛋白a2的表达与肝细胞死亡量(tunel)的比率，以描述两种药物在所有研究模型中与肝损伤相关的促再生能力。因此，细胞周期蛋白a2和tunel比率的增加表明增强的再生活性，以及较少的细胞死亡，反之亦然(图10)。在24小时ccl4-lps模型中，在有g-csf或无g-csf的情况下，lps注射完全抑制了再生反应(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 0.42vs ccl4 lps 0.02vs.ccl4 lps g-csf 0.04)；与之相反，在ccl4-galn模型中，在注射galn后再生反应得以保留(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 galn 0.54)。在两种“短期”模型中，tak-242的施用与增强的肝细胞再生反应相关(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 lps tak-242：1.4；ccl4 galn tak-242：0.9)支持了创建一个无炎症环境对恢复再生能力重要的假设。此外，抗炎环境(存在tak-242)允许g-csf发挥其对肝损伤的积极作用，尤其是在ccl4-lps模型中，并在5天的治疗后增强再生(细胞周期蛋白a2/tunel比率：ccl4 lps tak-242 g-csf：1.7)，因此支持了g-csf的促再生能力，特别是在长期治疗后。
[0191]
结论
[0192]
数据显示了g-csf和使用tak-242的tlr4抑制之间的协同作用，其通过影响肝脏增殖同时调节炎症的严重程度，从而改善aclf模型的生存。g-csf是一种经批准的用于治疗化疗后的中性粒细胞减少症以及用于健康干细胞供者的骨髓刺激。g-csf具有长期可靠的安全性记录，可被用于新的目的。该药物可用于临床，并且是trl9。所述tlr4拮抗剂tak-242已在临床试验中进行到了3期，并具有可靠的安全性记录。tak-242近期获得了trl8状态，即将在2a/2b期临床试验中进行测试。
[0193]
因此，发明人展示了以下意外发现：
[0194]
(i)在临床相关的动物模型中，干细胞动员剂g-csf是有害的，因其会诱发全身性炎症并增加死亡率
[0195]
(ii)tak-242抑制炎症和器官损伤，以及(ii)减少肝脏炎症，从而允许肝干细胞移植；
[0196]
(iii)g-csf动员干细胞，但由于肝脏炎症，这些细胞不能移植到肝脏，并且在动物模型中g-csf可以导致炎症恶化并增加死亡率；
[0197]
(iv)所述干细胞动员剂g-csf和tak242的组合协同作用以(i)减少肝脏和全身性炎症(ii)动员干细胞而不引发炎症(iii)这些细胞具有改善的移植到肝脏中的能力。
[0198]
参考文献
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