一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物及其制备和应用的制作方法

1.本发明属于日用化妆品领域，特别涉及一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物及其制备和应用。


背景技术：

2.近年来随着我国社会发展和人民生活水平的提高，消费者越来越关注皮肤的护理。中药其成分天然，且药食同源。因此，中药成分护肤品成为护肤领域一个热点。
3.大多数的中药护肤品中，其添加的中药提取物常采用水提法、超声提取法、微波提取法或酶解提取法。上述提取方法中，水提和超声提取的过程容易导致中药的活性成分无法有效提取出来，微波提取和酶解的过程容易使中药中的活性成分被破坏，最终导致得到的中药提取物的护肤效果不理想。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的制备方法。
5.本发明另一目的在于提供上述方法制备的具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
6.本发明再一目的在于提供上述具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的应用。
7.本发明的目的通过下述方案实现：
8.一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的制备方法，包括：
9.将党参和连翘加入至液体培养基中，得到中药发酵培养基；
10.将芽孢杆菌种子液接入至所述中药发酵培养基中发酵培养，得到中药发酵液；
11.对所述中药发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
12.本发明通过大量试验得到，使用芽孢杆菌对党参和连翘共生发酵，得到的组合物具有很好的保湿、抗氧化、抗炎的功效。
13.可选的，在一些实施方式中，在进行所述将芽孢杆菌种子液接入至所述中药发酵培养基中发酵，得到中药发酵液的步骤之前，还包括制备芽孢杆菌种子液：
14.将芽孢杆菌种溶于无菌水，配制成芽孢杆菌悬液；
15.将所述芽孢杆菌悬液接种于固体培养基活化培养，得到活化的芽孢杆菌；
16.将所述活化的芽孢杆菌接种至种子培养基中进行扩培，得到所述芽孢杆菌种子液。
17.可选的，在一些实施方式中，芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌，优选为凝结芽孢杆菌。
18.可选的，在一些实施方式中，所述固体培养基为营养琼脂培养基、lb肉汤培养基、
mrs琼脂培养基中的至少一种；优选为营养琼脂培养基；
19.所述种子培养基选自营养肉汤培养基、lb液体培养基、mrs肉汤培养基中的至少一种；优选为营养肉汤培养基；
20.可选的，在一些实施方式中，芽孢杆菌悬液活化培养的温度为30～40℃，优选为35℃；芽孢杆菌悬液活化培养的时间为24～72h，优选为48h；
21.活化的芽孢杆菌在种子培养基的扩培温度为30～40℃，优选为35℃；活化的发酵乳杆菌在种子培养基的扩培时间为24～72h，优选为48h；
22.可选的，在一些实施方式中，芽孢杆菌种子液的菌种浓度在107～10
10
cfu/ml之间。
23.可选的，在一些实施方式中，芽孢杆菌种子液的接种量为中药发酵培养基质量的0.5～3％，优选为1％。
24.可选的，在一些实施方式中，党参和连翘的总质量占所述中药发酵培养基的总质量的0.1～3％；优选为1.5％；
25.所述党参和连翘质量比为1～2:1～2；优选为2：3；
26.所述液体培养基包括水、碳源、氮源和无机盐；
27.所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、果葡糖浆、乳糖、半乳糖中的至少一种，优选为葡萄糖；所述碳源的加入量为液体培养基的0.5～3％，优选为1.5％；
28.所述氮源选自牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨的至少一种，优选为牛肉膏；所述氮源的加入量为液体培养基0.1～2％，优选为1.5％；
29.所述无机盐选自nacl、kcl、k2hpo4、na2hpo4中的至少一种，优选为nacl；所述无机盐的添加量为液体培养基0.1～0.5％，优选为0.3％；
30.所述发酵培养的温度为28～38℃，优选为32℃；
31.所述发酵时间为36h～56h，优选为48h；
32.发酵培养时搅拌桨的转速为50～350r/min；优选为150r/min；
33.可选的，在一些实施方式中，在所述对所述中药发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的步骤中：
34.所述灭活处理的温度为60～90℃，所述灭活处理的时间为15～30min；
35.所述纯化处理包括对所述中药发酵液进行过滤去渣和/或过微滤膜；所述过滤去渣是指利用板框压滤机过滤去渣；所述过微滤膜的步骤包括将所述发酵液依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱以除去所述中药发酵液的杂质。
36.本发明还提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物，所述具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物采用如前所述的制备方法制备得到。
37.本发明还提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的应用，尤其是在护肤产品和发用护理产品中的应用。
38.在本发明中，具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在发用护理产品中的质量百分比为0.5～10％。
39.在本发明的一些实施方式中，具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在护肤产品中的质量百分比为0.5～10％。
40.党参为桔梗科植物，具有健脾益肺，养血生津的作用。党参用于治疗脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足，面色萎黄，心悸气短，津伤口渴，内热消渴。党参含有多种甾醇
类物质，菊糖、果糖等糖类及丁香甙、党参甙等甙类，胆碱、烟碱等生物碱及含氮组分，还含有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸等17种氨基酸，以及铁、锌、铜、锰等14种无机元素。2018年1月11日国家卫计委将党参录入“药食同源”，说明党参将在更多的领域得到更大的发挥。
41.连翘为木犀科连翘属植物，是中药临床常用传统药物之一，具有清热解毒、消肿散结之功效。现代药理研究表明，连翘具有抗菌、抗病毒、解热抗炎、抗氧化、保肝等多种药理作用。
42.本发明用芽孢杆菌对党参和连翘共同发酵，在发酵过程中，芽孢杆菌利用党参、连翘中的营养成分，有效地将党参和连翘中的活性物质释放出来。最终，制备得到的中药组合物具有很好的保湿、抗氧化和抗炎的功效。
43.本发明提供的制备方法制备得到的具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物具有如下的优点及功效：
44.(1)与传统的提取方式相比，本发明利用微生物发酵的方式提取党参和连翘的活性成分，更有利于各种活性成分的溶出，最终制备得到的中药组合物中具有优良的保湿、抗氧化、抗炎功效。
45.(2)本发明采用微生物发酵法提取党参和连翘的活性成分，制备过程中不使用有机溶剂、制备方法简单，有利于保护环境和实现工业化生产。
附图说明
46.图1为使用本发明提供的实施例1-8和对比例1-9对dpph抑制率的结果示意图。
47.图2为使用本发明提供的实施例1-8和对比例1-9对
·
oh抑制率的结果示意图。
48.图3为使用本发明提供的实施例1-8和对比例1-9制备的润肤乳后皮肤水分含量变化率的示意图。
49.图4为使用本发明提供的实施例1-8和对比例1-9制备的润肤乳后皮肤水分流失变化率的示意图。
50.图5为使用本发明提供的实施例1-8和对比例1-9抑制il-6的结果示意图。
具体实施方式
51.下面将结合本发明中的附图，对本发明中具有保湿、抗炎和修护功效的中药组合物及其制备方法和应用进行清楚、完整地描述，目的是为了让公众更好的理解本发明所述的技术方案，而不是对所述技术方案进行限制，事实上，在以相同或近似的原理对所述配方及其制备方法进行的改进，都在本发明所要求保护的权利要求范围之内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中凝结芽孢杆菌bncc168437，枯草芽孢杆菌bncc337420均购于北纳创联生物科技有限公司。
52.实施例1
53.一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物，由以下步骤制备得到：
54.1)制备凝结芽孢杆菌种子液
55.将凝结芽孢杆菌溶于无菌水制成凝结芽孢杆菌悬液，移取10μl凝结芽孢杆菌悬液在营养琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度35℃，培养时间48h，获得活化后的凝结芽
孢杆菌。
56.将活化后的凝结芽孢杆菌通过接种环接种至营养肉汤培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为35℃。培养48h后，得到凝结芽孢杆菌种子液。在种子液中，凝结芽孢杆菌的浓度约为108cfu/ml。
57.2)制备中药发酵培养基。
58.将质量分数为液体发酵培养基1.5％的葡萄糖、质量分数为液体发酵培养基1.5％的牛肉膏、质量分数为液体发酵培养基0.3％的nacl和质量分数为液体发酵培养基96.7％的水加入至锥形瓶中，混合均匀，得到液体发酵培养基。
59.称取0.6kg干燥的党参、0.9kg干燥的连翘(连翘果实)，打碎，过80目筛网，注入98.5kg的液体培养基，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，得到中药发酵培养基。
60.3)制备中药发酵液
61.取1.0kg的凝结芽孢杆菌种子液接种至步骤2)制备的中药发酵培养基中，在32℃、自然ph、搅拌桨的转速为150r/min下发酵48h，得到中药发酵液。
62.4)对中药发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
63.在80℃的条件下对中药发酵液进行灭活处理，灭活处理的时间为20min。待中药发酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
64.实施例2-8中具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的制备方法与实施例1相同，不同实施例中，步骤1)-3)有所区别，具体实施例1-8中步骤1)-3)的参数如下表1所示。
65.表1实施例1-8中步骤1)-3)的参数
[0066][0067]
实施例9
[0068]
1)制备凝结芽孢杆菌种子液
[0069]
将凝结芽孢杆菌溶于无菌水制成凝结芽孢杆菌悬液，移取8μl凝结芽孢杆菌悬液在mrs琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度37℃，培养时间36h，获得活化后的凝结芽孢杆菌。
[0070]
将活化后的凝结芽孢杆菌通过接种环接种至lb肉汤培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为37℃。培养40h后，得到凝结芽孢杆菌种子液。在种子液中，凝结芽孢杆菌的浓度约为107cfu/ml。
[0071]
2)制备中药发酵培养基。
[0072]
将质量分数为液体发酵培养基2.0％的蔗糖、质量分数为液体发酵培养基1.0％的胰蛋白胨、质量分数为液体发酵培养基0.1％的kh2po4和质量分数为液体发酵培养基96.9％的水加入至锥形瓶中，混合均匀，得到液体发酵培养基。
[0073]
称取1.0kg干燥的党参、1.0kg干燥的连翘，打碎，过80目筛网，注入98kg的液体培养基，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，得到中药发酵培养基。
[0074]
3)制备中药发酵液
[0075]
取1.5kg的凝结芽孢杆菌种子液至中药发酵培养基中，在37℃、自然ph、搅拌桨的转速为200r/min下发酵36h，得到中药发酵液。
[0076]
4)对中药发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物；
[0077]
在75℃的条件下对中药发酵液进行灭活处理，灭活处理的时间为25min。待中药发
酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
[0078]
实施例10
[0079]
1)制备枯草芽孢杆菌种子液
[0080]
将枯草芽孢杆菌溶于无菌水制成枯草芽孢杆菌悬液，移取10μl枯草芽孢杆菌悬液在mrs琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度28℃，培养时间72h，获得活化后的枯草芽孢杆菌。
[0081]
将活化后的枯草芽孢杆菌通过接种环接种至mrs肉汤培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为28℃。培养72h后，得到发酵乳杆菌种子液。在种子液中，发酵乳杆菌的浓度约为107cfu/ml。
[0082]
2)制备中药发酵培养基。
[0083]
将质量分数为液体发酵培养基3％的果葡萄糖浆、质量分数为液体发酵培养基2％的酪蛋白胨、质量分数为液体发酵培养基0.2％的kcl和质量分数为液体发酵培养基94.8％的水加入至锥形瓶中，混合均匀，得到液体发酵培养基。
[0084]
称取0.6kg干燥的党参、0.9kg干燥的连翘，打碎，过80目筛网，注入98.5kg的液体培养基，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，得到中药发酵培养基。
[0085]
3)制备中药发酵液
[0086]
取2.0kg的枯草芽孢杆菌种子液接种至中药发酵培养基中，在35℃、自然ph、搅拌桨的转速为250r/min下发酵50h，得到中药发酵液。
[0087]
4)对中药发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
[0088]
在90℃的条件下对中药发酵液进行灭活处理，灭活处理的时间为10min。待中药发酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。
[0089]
对比例1
[0090]
采用水提法制备中药组合物。
[0091]
称取干燥的党参0.6kg，干燥的连翘0.9kg，用粉碎机打碎，过80目筛网,加入水至总质量为100kg。在80℃、匀速150r/min搅拌条件下提取12h。待提取液降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到中药组合物。
[0092]
对比例2
[0093]
采用超声提取法制备中药组合物
[0094]
称取干燥的党参0.6kg，干燥的连翘0.9kg，用粉碎机打碎，过80目筛网，加入水至总质量为100kg。在60℃、超声波频率为58khz、超声波功率为600w的条件下提取2h。待提取液降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到中药提取物。
[0095]
对比例3
[0096]
采用酶解提取法制备中药组合物
[0097]
称取干燥的党参0.6kg，干燥的连翘0.9kg，用粉碎机打碎，过80目筛网，加入10g纤维素酶，加水至总质量为100kg，在45℃下酶解6小时，酶解结束后，在90℃下保持30min进行灭酶处理，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到中药提取物。
[0098]
对比例4
[0099]
将实施例1中0.6kg干燥的党参、0.9kg干燥的连翘改为1.5kg干燥的党参，其余的步骤与实施例1均相同。
[0100]
对比例4与实施例1的区别在于：对比例4仅用党参进行发酵。
[0101]
对比例5
[0102]
将实施例1中0.6kg干燥的党参、0.9kg干燥的连翘改为1.5kg干燥的连翘，其余的步骤与实施例1均相同。
[0103]
对比例5与实施例1的区别在于：对比例5仅用连翘进行发酵。
[0104]
对比例6
[0105]
将实施例1中凝结芽孢杆菌改为植物乳杆菌(菌种编号为gdmcc 1.140，购于广东省微生物保藏中心)，其余的步骤与实施例1均相同。
[0106]
对比例6与实施例1的区别在于：对比例6用植物乳杆菌发酵党参和连翘。
[0107]
对比例7
[0108]
将实施例1中凝结芽孢杆菌改为酿酒酵母菌(菌种编号为gdmcc 2.71，购于广东省微生物保藏中心)，其余的步骤与实施例1均相同。
[0109]
对比例7与实施例1的区别在于：对比例7用酿酒酵母菌发酵党参和连翘。
[0110]
对比例8
[0111]
将实施例1中1.5％的牛肉膏改1.5％硫酸铵(氮源的一种)，其余的步骤与实施例1均相同。
[0112]
对比例8与实施例1的区别在于：对比例8中采用硫酸铵作为氮源。
[0113]
对比例9
[0114]
将实施例1中发酵温度为32℃改为39℃，其余的步骤与实施例1均相同。
[0115]
对比例9与实施例1的区别在于：对比例9的发酵温度为39℃。
[0116]
测试例
[0117]
测试例1：抗氧化性能测试-dpph法
[0118]
利用dpph法测试本技术中的实施例1-8和对比例1-9制备得到的组合物对自由基的清除效果。dpph又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。
[0119]
测试方法：
[0120]
按以下表2依次加样，其中，dpph-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(macklin，纯度》96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250ml棕色容量瓶。dpph-乙醇溶液临用时现配。样品溶液由以下步骤制备得到：分别移取实施例1-8和对比例1-9的组合物0.1ml、1ml、10ml、30ml，加入去离子水定容至1000ml棕色容量瓶，得
到0.1％、1％、3％浓度样品溶液。
[0121]
表2样品加液要求
[0122]
试剂t-样品管t
0-样品本底c-dpph管c
0-溶剂本底样品溶液(ml)11——水(ml)2233dpph-乙醇溶液(ml)1—1—无水乙醇(ml)—1—1
[0123]
扫描c-dpph组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。
[0124]
清除率计算公式为：
[0125][0126]
式中：
[0127]
t—样品管吸光值，即样品与dpph反应后溶液吸光值；
[0128]
t0—样品本底吸光值；
[0129]
c—dpph管吸光值，即未加样品时dpph溶液吸光值；
[0130]
c0—溶剂本底吸光值。
[0131]
取三次测量平均值，测试结果如表3。
[0132]
测试例2：抗氧化性能测试-羟自由基(
·
oh)清除测试
[0133]
分别移取实施例1-8和对比例1-9的组合物1ml、5ml，加入去离子水定容至1000ml棕色容量瓶，得到0.1％、0.5％浓度样品溶液。
[0134]
参考李晓娇,汪玉洁,杨丽华,等.不同提取方式和改性对小粒咖啡果皮果胶的理化性质及抗氧化活性影响[j/ol].食品与发酵工业:1-14中的方法，取2.0ml不同浓度的样品溶液，依次加入0.5ml 6mmol/l的feso4溶液和0.5ml 6mmol/l的h2o2溶液，充分混匀后于室温下反应10min，再分别加入0.5ml 6mmol/l水杨酸混匀，室温反应30min，在510nm处测得吸光度为a1。在上述反应体系中，以无水乙醇代替水杨酸，测定吸光度为a2，以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度为a0，
·
oh清除率按以下公式计算：
[0135][0136]
取三次测量平均值，测试结果如表3。
[0137]
表3样品对自由基的抑制率(％)
[0138][0139]
实施例1-8清除dpph和
·
oh的效果优于对比例1-3，说明本发明提供的生物发酵法制备的中药组合物的抗氧化效果优于水提法、超声提取法和酶解法制备的中药组合物。实施例1-8清除dpph和
·
oh的效果优于对比例4和5，说明党参和连翘共生发酵的效果优于单一中药植物的发酵效果，最终得到中药组合物的抗氧化效果更好。实施例1-8清除dpph和
·
oh的效果优于对比例6和7，说明在本发明中，使用芽孢杆菌的发酵效果最好，优选为凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，更优选为凝结芽孢杆菌。实施例1、5、6清除dpph和
·
oh的效果优于对比例6和7，说明中药发酵培养基中的氮源的种类影响芽孢杆菌的发酵效果，在本发明中，选用牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨的发酵效果较好，最终制备得到的中药组合物清除dpph和
·
oh的效果较优。实施例1、7、8清除dpph和
·
oh的效果优于对比例9，说明发酵温度影响发酵效果，影响了中药组合物的抗氧化性能，在本发明中，发酵培养的温度应设置在28～38℃，在该范围内，芽孢杆菌的发酵效果最好。实施例1清除dpph和
·
oh的效果优于实施例2和3，说明党参和连翘加入的质量比影响发酵效果，影响了中药组合物的抗氧化性能，在本发明中，党参和连翘质量比应设置为1～2:1～2，优选地，党参和连翘的质
量比为2:3。
[0140]
测试例3：保湿性能测试
[0141]
测试对象：添加了实施例1～8、对比例1～9的中药组合物的乳液(仅加入实施例1～8、对比例1～9中的其中一个)
[0142]
乳液的成分如表4：
[0143]
表4乳液成分表
[0144][0145][0146]
乳液的制备方法如下：
[0147]
将a相投入至乳化锅中，升温至80℃，保温搅拌至完全溶解。将b相投入至油锅中，升温至80℃，搅拌完全溶解后投入a相乳化，匀质5～8分钟。将油锅的温度降低至70℃，加入c相，搅拌均匀。将油锅的温度降低至60℃，加入d相，搅拌均匀。将油锅的温度降低至40℃，
加入e相，搅拌均匀。将油锅的温度降低至38℃，出料灌装。
[0148]
测试方法参考《qb/t 4256-2011化妆品保湿功效评价指南》。
[0149]
测试的部位为前臂内侧。样品及空白对照区按照测试区域随机分布表分布于志愿者前臂内侧区域，每个区域大小为3.0cm
×
3.0cm，样品的用量为(2.0
±
0.1)mg/cm2。在产品使用前、使用第2、6h后，用皮肤水分测试仪cm825和皮肤水分流失测试仪tm300进行皮肤角质层水分含量测试和皮肤水分散失率测试。每个样品乳液测试10次，取10次的平均值。
[0150]
以初始值与终值的变化率进行比较(变化率＝(终值-初始值)/初始值)，通过水分含量的变化率和水分散失率的变化率比较乳液的保湿效果。
[0151]
测试结果如表5所示。
[0152]
表5实施例和对比例的保湿性能测试汇总
[0153][0154][0155]
皮肤水分含量的变化率增大，说明皮肤中的水分得到补充，皮肤水分含量升高。皮肤水分散失率是指单位时间内皮肤的水分流失量。皮肤水分散失率降低，在单位时间内，皮
肤的水分流失量减少，皮肤角质屏障越好。
[0156]
如表5所示，实施例1-8保湿的效果优于对比例1-3，说明本发明提供的生物发酵法制备的中药组合物的保湿效果优于水提法、超声提取法和酶解法制备的中药组合物。实施例1-8保湿效果优于对比例4和5，说明党参和连翘共生发酵的效果优于单一中药植物的发酵效果，最终得到中药组合物的保湿效果更好。实施例1-8保湿效果优于对比例6和7，说明在本发明中，使用芽孢杆菌的发酵效果最好，优选为凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，更优选为凝结芽孢杆菌。实施例1、5、6保湿效果优于对比例6和7，说明中药发酵培养基中的氮源的种类影响芽孢杆菌的发酵效果，在本发明中，选用牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨的发酵效果较好，最终制备得到的中药组合物保湿效果较优。实施例1、7、8保湿效果优于对比例9，说明发酵温度影响发酵效果，影响了中药组合物的保湿性能，在本发明中，发酵培养的温度应设置在28～38℃，在该范围内，芽孢杆菌的发酵效果最好。实施例1保湿效果优于实施例2和3，说明党参和连翘加入的质量比影响发酵效果，影响了中药组合物的保湿性能，在本发明中，党参和连翘质量比应设置为1～2:1～2，优选地，党参和连翘的质量比为2:3。
[0157]
测试例4：抗炎测试-il-6抑制测试
[0158]
人角质形成细胞是一种存在于表皮中的免疫活性细胞，可分泌至少9种白细胞介素(il)，这些因子对淋巴细胞增殖、活化炎症细胞等有重要作用。已有研究发现，紫外线辐射后角质形成细胞分泌的il-6可促进成纤维细胞产生细胞外基质金属蛋白酶(mmp)，mmp可导致胶原蛋白降解，导致细胞外基质的损伤而引起皮肤的老化。
[0159]
本发明使用人角质形成细胞(hacat细胞，购于中国科学院昆明细胞库)为模型，将实施例1-8和对比例1-9的中药组合物用完全培养基(mem 10％fbs)配置成体积百分数为1.0％、3.0％的测试样品溶液，利用脂多糖lps(10ug/ml，终浓度)刺激，角质形成细胞孵育24h后，研究对炎症因子(il-6、il-8)的释放情况，进而评价浓度为1.0％、3.0％的本实施例1组合物的抗炎效果。以lps(10ug/ml)作为刺激物，1％ lps、3％ lps、2个浓度的实施例1-8和对比例1-9的中药组合物溶液与lps的混合物为受试样品，以正常培养的角质形成细胞为空白对照。
[0160]
试验步骤具体如下所示:
[0161]
(1)细胞培养：将hacat细胞以密度为2.0～3.0
×
105个/ml/孔接种于12孔板，返回培养箱培养18～24h，培养基为在2～8℃下保存2周的含10％fbs的mem培养基。
[0162]
(2)暴露：取出上述培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1ml测试样品溶液(实施例1的组合物用完全培养基(mem 10％fbs)配置成体积百分数为1.0％、3.0％的测试样品溶液)，并利用脂多糖(lps)(10ug/ml，终浓度)刺激；同时设置模型组和空白对照组，模型组为仅利用lps(10μg/ml，终浓度)刺激，空白对照组为加入1ml完全培养基，不加lps刺激。培养24
±
1h。
[0163]
(3)加样：去除原培养液，加入1ml新鲜培养液，继续培养24
±
1h。
[0164]
(4)检测：收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用elisa试剂盒进行测定，测试条件为：温度37
±
0.5℃，湿度》90％和5％co2浓度。
[0165]
(5)数据分析：数据以均值
±
标准差表示，数据采用spss进行分析，如果p《0.05考虑差异具有统计学意义。
[0166]
测试结果：
[0167]
表6il-6相对含量(％)
[0168][0169][0170]
测试结果如表6所示。空白组为正常细胞内的il-6炎症因子相对含量为100％，经lps刺激角质形成细胞后，模型组的il-6水平较对照组(正常细胞)显著升高至285％，约为对照组的2.5倍。经统计学分析，与模型组对比，1％、3％实施例1-8和对对比例1-9的中药组合物对lps诱导的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子il-6有显著下调作用，即实施例1-8和对对比例1-9的中药组合物表现出抗炎的作用。
[0171]
实施例1-8抗炎效果优于对比例1-3，说明本发明提供的生物发酵法制备的中药组合物的抗炎效果优于水提法、超声提取法和酶解法制备的中药组合物。实施例1-8抗炎效果优于对比例4和5，说明党参和连翘共生发酵的效果优于单一中药植物的发酵效果，最终得到中药组合物的抗炎效果更好。实施例1-8抗炎效果优于对比例6和7，说明在本发明中，使
用芽孢杆菌的发酵效果最好，优选为凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，更优选为凝结芽孢杆菌。实施例1、5、6抗炎效果优于对比例6和7，说明中药发酵培养基中的氮源的种类影响芽孢杆菌的发酵效果，在本发明中，选用牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨的发酵效果较好，最终制备得到的中药组合物抗炎效果较优。实施例1、7、8抗炎效果优于对比例9，说明发酵温度影响发酵效果，影响了中药组合物的抗炎性能，在本发明中，发酵培养的温度应设置在28～38℃，在该范围内，芽孢杆菌的发酵效果最好。实施例1抗炎效果优于实施例2和3，说明党参和连翘加入的质量比影响发酵效果，影响了中药组合物的抗炎性能，在本发明中，党参和连翘质量比应设置为1～2:1～2，优选地，党参和连翘的质量比为2:3。
[0172]
本发明提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物的制备方法，本发明将干燥的党参和连翘，用芽孢杆菌共生发酵，最终制备得到的中药组合物对具有良好的保湿、抗氧化、抗炎功效。本发明制备的组合物适合应用于护肤产品中。
[0173]
本发明还提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物。本发明的组合物采用上述方法制备得到。本发明提供的组合物具有良好的保湿、抗氧化、抗炎功效，制备工艺简单，制备过程不使用有机溶剂，适合工业生产。
[0174]
本发明还提供上述具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在护肤产品中的应用。本发明提供的具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在护肤产品中的质量百分比为0.5～10％。本发明提供的中药组合物可以作为柔肤水类、乳液类、膏霜类、面贴膜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类和彩妆类的活性成分。
[0175]
本发明还提供上述具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在发用护理产品中的应用。本发明提供的具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物在发用护理产品中的质量百分比为0.5～10％。本发明提供的中药组合物可以作为发用精华液、洗发香波、护发素的活性成分。
[0176]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。