TUG891用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途

tug891用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途
技术领域
1.本发明属于医药领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及tug891用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。


背景技术：

2.急性肾损伤(acute kidney injury,aki)，是指由多种病因引起的以肾小球滤过率短期内急剧下降为表现的临床综合征，是临床常见的危急重症之一，已成为全球性的重大健康问题之一。尽管临床工作者和基础科研人员高度重视aki的临床诊疗和科学研究，但目前仍缺乏满意的诊治手段。因此，进一步深入探究aki的发病机制，寻找潜在的药物干预靶点，具有极重大的临床意义。ffar4属于7次跨膜的g蛋白偶联受体(gpr120)，近期多项研究证实，gpr120在2型糖尿病、炎症性肠病、爆发性肝衰竭等疾病中有显著的保护作用。之前的研究已证实：足细胞gpr120的表达量与糖尿病肾病的进展呈负相关；gpr120激动剂tug891可以通过改善内质网应激在顺铂aki中发挥保护作用。然而，gpr120对脓毒血症aki的保护作用及潜在机制目前尚缺乏有力证据。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供tug891用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。
4.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
5.tug891用于制备治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的用途。
6.进一步地，所述药物以tug891为活性成分，用药学上可以接受的辅料制成药学上可以接受的剂型；所述辅料为固体、液体或半固体辅料，剂型包括片剂、胶囊、注射剂和滴丸。
7.有益效果：
8.本发明用动物试验证明tug891可明显改善脓毒血症急性肾损伤小鼠肾功能，并有效缓解肾脏病理损伤。tug891作为ffar4激动剂，可以抑制脓毒血症急性肾损伤小鼠ffar4的下调。该试验结果表明，tug891可以通过改善肾功能紊乱、抑制肾损伤进而保护脓毒血症急性肾损伤。因此，tug891具备开发成治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的前景。
附图说明
9.图1为各组小鼠血清scr(a)及bun(b)水平；其中，****p《0.0001；数据以均数
±
标准差表示；
10.图2为he染色观察各组小鼠肾组织病理改变及肾小管损伤评分比较(200
×
、400
×
)；其中，***p《0.001,****p《0.0001；数据以均数
±
标准差表示；
11.图3为wb检测各组小鼠ffar4(gpr120)蛋白表达水平；其中，****p《0.0001；数据以均数
±
标准差表示。
具体实施方式
12.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
13.一、实验材料
14.1、实验主要试剂
15.[0016][0017]
2、实验主要仪器
[0018]
电泳仪及垂直式电泳槽、板、梳amersham公司，中国class
ꢀⅱ
a/b3生物安全柜thermo forma公司，美国labofug 400r离心机heraeus公司，德国微型台式离心机heraeus公司，德国bs-240全自动生化仪mindray公司，中国-20℃冰箱荣事达bcd-241，中国-80℃超低温冰箱sanyo mdf-382e，日本电热恒温水浴箱上海医疗器械五厂，中国万分之一分析天平赛多利斯科学仪器有限公司，中国超纯水系统millipore公司，德国type16700涡旋混匀器上海达姆公司，中国蛋白电泳仪bio-rad公司，美国微量移液器gilson公司，法国水平摇床thermo scientific公司，美国各型号加样枪eppedorf公司，德国光学显微照相系统olympus公司，日本正置荧光显微镜zeiss公司，中国synergy mx多功能酶标仪bio tek公司，美国pcr仪bio-rad公司，美国化学发光成像仪bio-rad公司，美国
[0019]
二、实验方法
[0020]
1、主要试剂的配制方法
[0021]
(1)tug891灌胃溶液：通过分析天平准确称量所需的tug891，加入20％peg400溶解后4℃冰箱保存备用。灌胃前半小时用0.9％生理盐水将tug891灌胃液母液稀释，参考既往研究，按35mg/kg/日来配制，现配现用。
[0022]
(2)10％中性福尔马林溶液(ph 7.0)：磷酸二氢钠4g及磷酸氢二钠6.5g加入100ml甲醛及900ml水；
[0023]
(3)伊红-酒精溶液：蒸馏水及冰醋酸中加入0.5～1g伊红，滤纸过滤，烘干后加入100ml无水乙醇；
[0024]
(4)苏木精溶液(3000ml)：在100ml无水乙醇中加入6g苏木精，2000ml蒸馏水中加入150g硫酸铝钾，待溶解后再加甘油、碘酸钠及冰醋酸混合溶解，混合后放在有光和通风处3周，变成深红色，即可使用；
[0025]
(5)0.2％冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2ml加入蒸馏水100ml；
[0026]
(6)1％磷钼酸水溶液：磷钼酸1g加入蒸馏水100ml；
[0027]
(7)1％光绿水溶液：光绿1g加入蒸馏水100ml；
[0028]
(8)60％异丙醇的配制：40ml蒸馏水中加入100％异丙醇，4℃冰箱保存备用；
[0029]
(9)4％(mv)多聚甲醛：100ml 1
×
pbs溶液中加入4g多聚甲醛，同时加入数滴naoh，在通风厨中60℃加热使其溶解，冷却至室温，用hcl调节溶液的ph值至7.4，分装置于-20℃冰箱备用；
[0030]
(10)tbs-t液：tween-20与tbs缓冲液按1:2000比例配制，将tween-201ml加入tbs缓冲液1l中，混匀后室温备用；
[0031]
(11)封闭液：100mltbs-t溶液中加入5g脱脂奶粉，待溶解后置于4℃冰箱保存备用；
[0032]
(12)pbs储存液(10x)：超纯水中，加入氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钠2.08g混合后定容至100ml；
[0033]
(13)pbs工作液(1x)：10xpbs存储液与超纯水以1:9的比例稀释至1xpbs工作液，调整ph至7.2，放置于玻璃瓶中，高温高压灭菌后备用；
[0034]
(14)2％(m/v)bsa：先量取10mlpbs(1
×
)，再量取0.2gbsa粉末，放入pbs中，予以磁力搅拌子涡旋溶解，4℃冰箱保存备用；
[0035]
(15)0.2m磷酸缓冲液的配制：量取磷酸氢二钠(na2hpo4·
12h2o)29g及磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)2.6g，加入双蒸馏水，定容至500ml，ph调至7.4；
[0036]
(16)30％丙烯-双丙烯酰胺贮存液：三蒸水中加入30g丙烯酰胺，待溶解完成后再加入0.8g双丙烯酰胺，定容，然后过滤，4℃冰箱保存备用；
[0037]
(17)多聚赖氨酸(0.05mg/ml)：加入三蒸水，让多聚赖氨酸配成所需浓度；
[0038]
(18)sds上样缓冲液：取1ml1mol/ltris
·
hcl(ph6.8)，再加入100ml去离子水，混匀后再加入4ml10％sds、1ml1mol/l二硫叔焦醇及0.02g溴酚蓝，混匀后予以0.45μm滤纸过滤，4℃冰箱保存备用；
[0039]
(19)sds储存液：90ml去离子水中加入10g sds，充分溶解后再加去离子水定容至100ml，室温保存备用；
[0040]
(20)电泳缓冲液：蒸馏水中加入甘氨酸14.4g、tris base 3.03g及sds1 g定容至1l；
[0041]
(21)转膜缓冲液：蒸馏水中加入甘氨酸14.4g、tris base 3.03g及甲醇200ml定容至1l；
[0042]
(22)tbst缓冲液：蒸馏水中加入nacl 29.2g及tris base 2.42g定容至1l，加入tween-20 1ml；
[0043]
(23)10％过硫酸铵(aps)：10ml去离子水中加入1g过硫酸铵，完全溶解后，-20℃冰箱保存备用；
[0044]
(24)蛋白裂解液：ripa裂解液中加入1000
×
蛋白酶抑制剂；
[0045]
(25)一抗稀释液：称取0.5gbsa粉末，加入到10mltbst溶液中，充分溶解混匀，保存于-20℃冰箱备用；
[0046]
(26)含2％h2o2的pbs缓冲液(ph 7.4)：h2o 22.0ml溶解于pbs缓冲液98ml；
[0047]
(27)dna裂解缓冲液：双蒸水82ml中加入10％sds 5ml、0.5m edta 10ml、1m tris-hcl 1ml及5m nacl 2ml；
[0048]
(28)dnase i储存液的配制：将总rna提取试剂盒中的dnase i干粉(1500u)溶解在无rna酶的双蒸水(550μl)中，混匀后分装，置于-20℃冰箱贮存待用；
[0049]
(29)dnase i工作液的配制：在新的无rna酶离心管中放入dnase i储存液(由样品数量决定所需配制的量)加rdd缓冲液；
[0050]
(30)电泳凝胶配置：
[0051]
15％分离胶
[0052][0053]
5％浓缩胶
[0054][0055]
2、脓毒血症急性肾损伤(aki)模型建立及分组
[0056]
选取c57bl/6j小鼠，予以35mg/kg/日tug891，灌胃治疗三天后予以戊巴比妥钠(50mg/kg)充分麻醉，对小鼠盲肠末端和回盲瓣之间结扎以针穿过结扎的中央段挤出少量盲肠内容物，再将盲肠重新置入腹腔内缝合。术后24小时留小鼠血清、肾脏标本进行相关检测。
[0057]
3、标本采集
[0058]
(1)血标本的采集及检测
[0059]
戊巴比妥钠(50mg/kg)充分麻醉，抓取小鼠颈部头皮，压迫颈部两侧，待小鼠双眼突出且可见眶后静脉丛充血，用镊子快速摘取眼球，眼眶内流出血液，即收集入ep管中，随
后固定小鼠头部，右手抓住鼠尾靠近小鼠身体的地方向后上方牵拉，立即造成颈椎脱臼所致死亡，立即摘取肾组织。留取血液标本后，静置30分钟，离心20分钟(3,000rpm)。分装上层血清，采用bs-240全自动生化仪检测血清肌酐(scr)，尿素氮(bun)等生化指标。剩余标本于-80℃冰箱保存。检测试剂均保存于4℃冰箱。
[0060]
(2)肾组织的收集
[0061]
用组织剪分别取下小鼠两个肾脏，将肾蒂及包膜组织去除干净，予锋利刀片将肾脏纵行切开。其中取一半肾组织予以10％中性福尔马林溶液固定24～48小时，用于行he、tunel染色(后续实验)等；一半肾组织放于2.5％的戊二醛固定液中，用于透射电镜观察(后续实验)，余下肾组织放入加满oct冰冻切片包埋剂的组织包埋盒中，随之置于液氮表面，当该切片剂由液态变成白色固态后，予以锡箔纸将组织包裹并标记，置于-80℃冰箱中，待后期行免疫组化染色等。剩余的两个半肾组织的皮质部，分别置于1.5ml规格的干燥ep管中，-80℃冰箱保存，用于分子生物学检测等。
[0062]
4、免疫印迹法(western blot，wb)检测目的蛋白的表达水平
[0063]
4.1组织蛋白的提取
[0064]
(1)配制好的蛋白裂解液置于冰上；
[0065]
(2)研磨棒、研钵洗净并干燥后，加入液氮预冷；
[0066]
(3)从-80℃冰箱中取出各组冰冻肾脏组织，快速置于液氮中，在研钵中倒入少许液氮后，研磨棒充分研磨肾组织；
[0067]
(4)将0.1μl蛋白酶抑制剂及100μl细胞裂解液混匀，加入上步沉淀中；
[0068]
(5)匀浆器中充分匀浆，30分钟后将裂解液转移至离心管中；
[0069]
(6)低温(4℃)下，调离心机转速至13,000rpm(离心15分钟)，将上清蛋白悬液置于新的ep管中，配制3个浓度梯度的样品，置于-80℃冰箱备用。
[0070]
4.2组织、细胞目的蛋白浓度测定
[0071]
(1)根据试剂盒使用说明，准备蛋白标准品，先配置成适量的bca工作液(a液：b液＝50:1)，冰上预冷；
[0072]
(2)每个样品分别取10μl，双蒸水稀释10～20倍，混匀置于冰上，按说明书配置蛋白标准品：所需浓度为0.5mg/ml的标准品，剩余的置于-20℃冰箱储存；
[0073]
(3)取上述稀释过的蛋白样品及标准蛋白20μl，分别加入96孔板内；
[0074]
(4)200μlbca液加入干净96孔板中，顺序加入25μl蛋白标准品或稀释后的待测样品，37℃，震荡反应30分钟；
[0075]
(5)酶标仪检测，根据标准样品及od值绘制标准曲线，由待测样品od值算出待测蛋白浓度；
[0076]
(6)在蛋白样品中按比例加入5
×
loading buffer的样品缓冲液，用1
×
loading buffer配平，使其达到工作浓度(1
×
)，水浴10分钟(100℃)，予以50μl/管分装，置于-80℃冰箱待用。
[0077]
4.3聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳
[0078]
(1)双蒸水冲洗干净制胶用的短玻片和长玻片，将短、长玻片对齐，并用制胶夹卡紧；
[0079]
(2)配制分离胶和浓缩胶，将现配的15％分离胶快速灌入玻璃槽中，避免气泡，室
温下静置20～30分钟；
[0080]
(3)待下层胶凝固后，弃上层，将现配的5％浓缩胶灌入玻璃板中，根据需要迅速插入有孔梳子(10孔或15孔)，室温静置20～30分钟；
[0081]
(4)将胶连同玻板安装于电泳槽内，并在内部加满电泳缓冲液，两只手同时向上拔掉浓缩胶内梳子；
[0082]
(5)根据需要量用移液枪上样，10～20μl/孔；初始电压：80伏，电泳约30分钟；
[0083]
(6)待蛋白样品泳动至分离胶，即可见不同颜色的条带，电压调整为120伏(1～2小时)，至溴酚蓝刚达胶底部时终止电泳；
[0084]
(7)待蛋白样品跑至胶底，关闭电源并取下凝胶，根据需要裁剪凝胶以备转膜。
[0085]
4.4转膜
[0086]
(1)pvdf膜用甲醇侵泡10秒，后同滤纸一起侵入预冷的缓冲液中；
[0087]
(2)电泳结束后，双蒸水冲掉电泳缓冲液，放入转膜缓冲液中，平衡10分钟
×
2次；
[0088]
(3)根据目的蛋白分子量切胶，依次放置：转膜夹黑色面，海绵，滤纸，凝胶pvdf膜，滤纸，海绵-转膜夹白色面；
[0089]
(4)按正负极对应插入转膜电泳槽，再加入转膜缓冲液至槽上标记处；
[0090]
(5)接通电源，根据蛋白量的大小，来决定转膜所需的电压和时间。
[0091]
4.5封闭
[0092]
转膜完成后，取出pvdf膜，tbs-t溶液洗涤约5分钟，加入封闭液，室温封闭1小时。
[0093]
4.6一抗孵育
[0094]
封闭完成后，离心管回收封闭液，放于4℃冰箱保存，用tbs缓冲液清洗pvdf膜5分钟
×
3次，用镊子夹取1ml tbst pvdf膜，然后在抗体孵育盒加入一抗(按一抗说明书配制一抗)，置4℃冰箱过夜。
[0095]
4.7二抗孵育
[0096]
将一抗连同条带室温下复温约半个小时，回收一抗，tbst缓冲液洗膜5分钟(3次)，配制相应的二抗并加入，室温孵育1小时。
[0097]
4.8显影曝光
[0098]
避光下配置所需高敏显影混合液，现配现用，采用自动曝光模式曝光并保存曝光图片。
[0099]
4.9计算分析
[0100]
测定蛋白条带的灰度值，使用image j分析软件，导入excel 2007软件进行数据处理及统计分析。
[0101]
5、肾组织的形态学观察
[0102]
5.1肾组织蜡块准备
[0103]
(1)10％中性福尔马林固定的小鼠肾组织，4℃过夜，pbs浸洗30分钟
×
3次；
[0104]
(2)脱水：取固定后样品，放置于50％、70％、85％、95％乙醇溶液中各60～120分钟，然后放于100％乙醇溶液30～60分钟
×
2次；
[0105]
(3)透明：二甲苯ⅰ、ⅱ脱腊各20～30分钟；
[0106]
(4)渗透：温度62℃，50％石蜡与50％二甲苯中放置90分钟，依次于石蜡ⅰ(温度50～52℃)、石蜡ⅱ(温度60～62℃)、石蜡iii(温度60～62℃)各约60分钟；
[0107]
(5)包埋：放置于石蜡包埋机中，予以包埋备用；
[0108]
(6)切片：将石蜡包埋块切片，随后置于烘片机上烘烤1小时，以防止脱片。
[0109]
5.2肾组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色
[0110]
(1)将石蜡切片依次放入二甲苯脱腊，每次5分钟
×
3次，依次予以100％乙醇，95％乙醇i，95％乙醇ii，80％乙醇，每次浸洗1分钟，自来水冲洗3～5分钟；
[0111]
(2)pbs浸洗5分钟
×
3次，滴加苏木素100μl，染色10分钟；
[0112]
(3)75％盐酸乙醇分化数秒；
[0113]
(4)自来水流动水冲洗约10分钟至细胞核呈蓝色；
[0114]
(5)双蒸水冲洗组织切片15分钟，滴加0.5％伊红染色剂，约1分钟；
[0115]
(6)蒸馏水冲洗1-2秒，梯度酒精脱水(80％乙醇5秒，95％乙醇2分钟，无水乙醇2分钟)；
[0116]
(7)自来水冲洗约10分钟至细胞核呈蓝色；
[0117]
(8)二甲苯透明，封片。
[0118]
光学显微镜下观察，放大400倍，每张切片随机选择10个视野下观察组织切片，以评估小鼠肾小管损伤程度。每组至少3个样本中随机选择两个切片，每张切片随机选择10个皮质区，使用image j软件计算损伤肾小管所占比例来评估肾小管损伤程度，小管组织损伤评分分为0～4级，具体如下：
[0119]
0分：正常或微量肾小管细胞肿胀或空泡变性；
[0120]
1分：肾小管上皮细胞出现较明显的空泡变性，细胞肿胀，坏死脱落等病变，损伤比例小于25％；
[0121]
2分：小管损伤病变比例占25％～50％；
[0122]
3分：小管损伤病变比例占50％～75％；
[0123]
4分：小管损伤病变比例大于或等于75％。
[0124]
6、统计学分析
[0125]
采用spss 22.0统计分析软件对数据统计分析。计量资料以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较使用one-way anova检验(tukey，s multiple cormparisons test)，p《0.05认为差异有统计学意义。
[0126]
所有统计结果均使用graphpad prism 9.4.1软件作图。
[0127]
三、实验结果
[0128]
tug891(35mg/kg)可明显改善脓毒血症急性肾损伤小鼠肾功能(scr、bun)，并有效缓解肾脏病理损伤(he染色)。tug891作为ffar4激动剂，可以抑制脓毒血症急性肾损伤小鼠ffar4的下调。综上，tug891可以通过改善肾功能紊乱、抑制肾损伤进而保护脓毒血症急性肾损伤，因而具备开发成治疗脓毒血症急性肾损伤的药物的前景。
[0129]
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。